通过阻断可诱导共刺激分子及白细胞介素33调节四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的免疫应答

Abstract

Objective

To investigate the effects of combined blockade of interleukin-33 (IL-33) and inducible co-stimulatory molecule (ICOS) on carbon tetrachloride-induced chronic liver fibrosis and imbalance of T helper lymphocyte subsets in mice.

Methods

There were 40 BALB/c mice in each model and control group. Flow cytometry was used to determine the proportion of Th1/Th2/Th17 cells in the splenic lymphocyte suspension of mice, the expression levels of interferon γ, IL-4, and IL-17 in the splenic lymphocyte suspension of liver fibrosis mice after combined blockade of IL-33 and ICOS, and the pathological changes of liver histopathology in mice with liver fibrosis. Two independent sample t-test was used to compare data between groups.

Results

Compared with the non-blocking group, the proportion of Th2 and Th17 cells in the IL-33/ICOS blocking group was significantly down-regulated (Th2: 65.96%±6.04% vs. 49.09%±7.03%; Th17:19.17%±4.03% vs. 9.56%±2.03%)，while the proportion of Th1 cells and Th1/Th2 ratio were up-regulated (Th1:17.14%±3.02% vs. 31.93%±5.02%; Th1/Th2: 0.28±0.06 vs. 0.62±0.23)，and the difference was statistically significant (t=5.15, 6.03, 7.14, 4.28, respectively, with P＜0.05). After entering the chronic inflammation stage of liver fibrosis in mice (10 weeks), compared with the non-blocking group, the expression levels of IL-4 and IL-17 in the blockade group were significantly down-regulated [IL-4: (84.75±14.35) pg/ ml vs. (77.88±19.61) pg/ml; IL-17: (72.38±15.13) pg/ml vs. (36.38±8.65) pg/ml]，while the expression of interferon γ was up-regulated [(37.25±11.51) pg/ml vs. (77.88±19.61) pg/ml]，and the difference was statistically significant (t: IL-4: 4.71; IL-17: 5.84; interferon γ: 5.05, respectively, with P＜0.05). Liver histopathological results showed that hepatic necrosis, hepatic lobular structural disorder, and fibrous tissue hyperplasia were significantly lower in the blockade group than those in the non-blocking group at 13 weeks of liver fibrosis.

Conclusion

Combined blockade of the ICOS signaling pathway and IL-33 can regulate Th2 and Th17 polarization, down-regulate the inflammatory response, and inhibit or prevent the occurrence and progression of fibrosis.

肝纤维化是各种病因所致慢性肝病进展至肝硬化的必经病理阶段，肝硬化及其并发症如曲张静脉破裂出血、肝肾综合征、肝性脑病及肝细胞癌等预后极差，总体病死率居高不下，造成严重的社会经济负担。因此，找到调控肝纤维化的关键靶点至关重要。已有大量文献报道，肝纤维化患者肝组织中浸润的免疫细胞主要为CD4⁺及CD8⁺T淋巴细胞，且CD8⁺T淋巴细胞浸润较CD4⁺T淋巴细胞少，提示CD4⁺T淋巴细胞可能在肝纤维化尤其是慢性炎症阶段中发挥更为重要的作用^[1]。在肝纤维化发生、发展过程中，CD4⁺T淋巴细胞及其亚群的功能起到了至关重要的作用。研究发现，CD4⁺T淋巴细胞具有高度异质性特点，不同亚群可发挥不同的生物学功能^[2]。肝纤维化患者外周血中2型辅助性T淋巴细胞（T helper 2, Th2）/Th17细胞的数量与疾病严重程度呈正相关，具有促进B淋巴细胞成熟和分泌自身抗体的能力，提示循环Th2/Th17细胞数量可能与肝纤维化严重程度呈正相关^[3]。可诱导共刺激分子（inducible costimulator, ICOS）与其配体（inducible costimulator ligand, ICOSL）相互作用后能有效地促进T淋巴细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌等，在一定程度上决定了T淋巴细胞极化的方向^[4]。近期的研究表明：白细胞介素33（interleukin-33, IL-33）能诱导Th2免疫应答，在肝纤维化发生时，活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）可分泌IL-33，并能在HSC细胞膜上观察到肿瘤发生抑制蛋白2（suppression of tumorigenicity 2, ST2）^[5]。因此，本研究拟用四氯化碳致小鼠肝纤维化模型，探讨联合阻断IL-33、ICOS对小鼠肝纤维化及辅助型T淋巴细胞亚群失衡的影响。

材料与方法

1.试剂和仪器：流式细胞仪（DXflex），购自美国贝克曼库尔特公司；分析软件：Flow Jo，购自美国BD公司；CD45/CD3/CD4/CD8组合抗体，及CD25/CD127/CD183/CD196组合抗体，均购自美国BD公司。RPMI 1640购自美国Sigma公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物公司；四氯化碳购自上海国药集团化学试剂有限公司。ICOS、IL-33阻断剂购自美国Ramp;D Systems公司。干扰素γ、IL-4、IL-17A的酶联免疫吸附试剂盒购自美国e Bioscience公司。

2.实验动物：建立小鼠四氯化碳致肝纤维化模型。将80只雄性8～10周龄30～40g的BALB/c小鼠（无特殊病原体级）按随机数字表法分为正常对照组、肝纤维化模型组，每组40只，分笼饲养，采用12h光/暗周期，给予常规食物和水。模型组腹腔注射四氯化碳（用玉米油稀释至20%），给药剂量为6μl/g，每周3次，连续8周。对照组腹腔注射与模型组等量的玉米油。抗体阻断小鼠每次腹腔注射四氯化碳稀释液前1h腹腔注射100 μg IL-33抗体和ICOS抗体。分别在感染前（0周）及感染后10周，取小鼠的脾脏制备淋巴细胞悬液，每批每组各取小鼠8只，用于流式细胞仪分析；肝脏置于10%甲醛溶液固定48h，自来水冲洗2h，用于HE染色。

3.流式细胞术检测脾淋巴细胞悬液中T淋巴细胞亚群：制备小鼠的脾淋巴细胞悬液，用于流式细胞检测。每个流式管内加入细胞数为1×10⁶个。室温放置2h内检测；同时设置同型对照管，向样本管加入相应体积的CD45/CD3/CD4/CD8组合抗体和CD25/CD127/CD183/CD196组合抗体，孵育、裂解红细胞后上机检测。界定CD3⁺CD4⁺CD183⁺CD196^-为Th1细胞，CD3⁺CD4⁺CD183^-CD196^-为Th2细胞，CD3⁺CD4⁺CD183^-CD196⁺为Th17细胞。

4.脾淋巴细胞培养及细胞因子检测：将不同时期分离的小鼠脾淋巴细胞加至培养板中（3×10⁶个/孔），用RPMI1640定容为1ml/孔。将24孔培养板放置于37℃培养箱（5% CO₂）中72h，2000r/min离心5min（r=12.5 cm），取上层液相，-80℃保存待测。用酶联免疫吸附法按照试剂盒操作说明测定肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中IL-4、IL-17、干扰素γ的表达水平。

5.统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验结果及数据均以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中Th1/Th2/Th17细胞比例：在四氯化碳致小鼠肝纤维化10周时，用流式细胞术检测肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中Th1/Th2/Th17细胞比例。结果显示：与未阻断组相比，阻断组Th2、Th17细胞比例明显下调，Th1比例及Th1/Th2比值上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1，图1。

表1. 肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中Th1/Th2/Th17细胞比例（$\overline{x}$±s）.

组别	例数	肝纤维化小鼠（10周）
		Th1（%）	Th2（%）	Th17（%）	Th1/Th2
阻断组	8	31.93±5.02	49.09±7.03	9.56±2.03	0.62±0.22
未阻断	8	17.14±3.02	65.96±6.04	19.17±4.03	0.28±0.06
t值		7.14	5.15	6.03	4.28
P值		<0.05	<0.05	<0.05	<0.05

图1. 肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中Th1/Th2/Th17细胞比例代表图.

注：D1：Th1细胞亚群；D2：Th2细胞亚群；D3：Th17细胞亚群；Th：辅助型T淋巴细胞

2.联合阻断IL-33、ICOS后肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中干扰素γ、IL-4、IL-17表达水平：在四氯化碳致小鼠肝纤维化10周时，检测联合阻断IL-33、ICOS后肝纤维化小鼠脾淋巴细胞悬液中干扰素γ、IL-4、IL-17表达水平动态变化。结果显示：进入慢性炎症阶段（10周）后，与未阻断组相比，阻断组肝纤维化小鼠IL-4、IL-17的表达水平明显下调，干扰素γ的表达水平上调，差异均有统计学意义。见表2，图2。

表2. 联合阻断IL-33、ICOS后肝纤维化小鼠IL-4、IL-17、干扰素γ表达水平（$\overline{x}$±s，pg/ml）.

组别	IL-4	IL-17	干扰素γ
未阻断组	84.75±14.35	72.38±15.13	37.25±11.51
阻断组	46.13±18.23	36.38±8.65	77.88±19.61
t值	4.71	5.84	5.05
P值	<0.05	<0.05	<0.05

注：IL：白细胞介素；ICOS：可诱导共刺激分子

图2. 联合阻断IL-33、ICOS后肝纤维化小鼠干扰素γ、IL-4、IL-17表达水平.

注：ICOS：可诱导共刺激分子；IL：白细胞介素

3.联合阻断IL-33、ICOS肝纤维化小鼠肝组织病理变化：HE染色显示对照组（图3A）及联合阻断组（图3C）小鼠肝脏组织未见明显异常；四氯化碳致小鼠肝纤维化13周时肝脏组织肝细胞坏死、肝小叶结构紊乱、纤维组织增生明显、间质细胞弥漫增生，形成肝纤维化（图3B），联合阻断IL-33、ICOS小鼠在肝纤维化13周时肝细胞坏死情况、肝小叶结构紊乱情况及纤维组织增生情况明显减轻（图3D）。

图3. 肝组织病理学变化HE×200.

注：ICOS：可诱导共刺激分子；IL：白细胞介素；A：正常对照小鼠；B：肝纤维化小鼠13周；C：ICOS/IL-33联合阻断正常小鼠；D：ICOS/IL-33联合阻断小鼠肝纤维化13周

讨论

CD3⁺T淋巴细胞反映了机体的免疫功能状况，在不同环境因子的刺激下，CD3⁺T淋巴细胞分化为辅助性CD4⁺T淋巴细胞和细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞。辅助性CD4⁺T淋巴细胞免疫功能异常一直是肝慢性炎症及肝纤维化发病机制中重要的环节之一，其中CD4⁺T淋巴细胞亚群在肝纤维化中的作用已成为研究的焦点^[1]。在正常情况下，Th细胞亚群间互相调控，使机体处于平衡状态；而Th细胞亚群间失衡的发生则是许多慢性炎症反应的中心环节。研究认为肝纤维化的进展过程中主要是Th1/Th2的漂移并以Th2优势型细胞免疫应答模式为主^[2]。Th2型细胞因子IL-6能够调节和诱导Th17及Th22等细胞的分化和活化，活化的Th细胞产生大量的IL-17、IL-22、IL-6、干扰素γ等细胞因子诱导肝脏肉芽肿炎性反应及纤维化^[3]。近年研究认为Th17细胞也是肝纤维化进展中的重要参与者，其主要的细胞因子IL-17A能够诱导促炎细胞因子及炎症蛋白酶的表达而导致组织细胞浸润和组织破坏^[6]。此外，CD4⁺T淋巴细胞亚群中新成员Th9通过细胞因子IL-9、利用IL-17A通道促进HSC的增殖及炎症反应，从而参与该病的发生及发展^[7]。

本研究结果显示：与对照组相比，未阻断IL-33/ICOS组Th2、Th17细胞比例明显上调，Th1比例及Th1/Th2比值下调；与未阻断组相比，阻断IL-33/ICOS组Th2、Th17细胞比例明显下调，Th1比例及Th1/Th2比值上调，与国内外现有的大多数研究结果一致^[8，9]。这提示了T淋巴细胞亚群及Th细胞亚群表达的异常与肝慢性炎症反应及肝纤维化的进展有关。

进入慢性炎症反应阶段（10周）后，与未阻断组相比，阻断组肝纤维化小鼠IL-4、IL-17的表达明显下调，干扰素γ的表达上调。一直以来，根据CD4⁺T淋巴细胞的功能和分泌的细胞因子将T淋巴细胞分为Th1细胞和Th2细胞，Th1细胞主要分泌干扰素γ、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α等细胞因子；Th2细胞主要分泌转化生长因子β、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子^[10]。细胞因子对于炎性肉芽肿的形成和纤维化的发生及进展发挥着决定性作用，其中Th2类细胞因子的功能已比较明确；IL-4是功能研究得最为清楚的Th2类细胞因子；应用IL-4基因敲除小鼠模型发现：IL-4可促使肉芽肿的发生；IL-4决定了肉芽肿体积的大小，能促进产生Th2类细胞因子的淋巴细胞的增殖，而且对于IL-5和IL-13的产生也非常重要^[11]。然而，IL-4对纤维化的发展不是必需的，但它能够增强IL-13的致纤维化作用^[11，12]。

本研究的前期工作已证实在四氯化碳致小鼠肝慢性炎症反应及肝纤维化的免疫应答中，ICOS通过促进Th17细胞分泌IL-17，上调了Th2型优势应答，导致了Th1/Th2失衡，从而加重了肝纤维化的进展^[13]。而近期的研究报道显示：IL-33能够诱导Th2免疫应答，并且在肝脏炎症组织高表达^{[5，14，15]}；本研究结果进一步证实了通过阻断ICOS及IL-33信号下调了Th2/Th17免疫应答，ICOS信号可能在介导肝纤维化免疫应答的Th2/Th17极化过程中起到重要作用。

在肝纤维化的发生、发展中，辅助性T淋巴细胞亚群及其细胞因子产生的种类及水平反映了T淋巴细胞亚群的功能变化。深入探讨肝纤维化免疫应答的调节机制，尤其是关键信号分子ICOS及发挥重要作用的IL-33的不同生物学功能，不仅可深入探讨肝纤维化的免疫调节机制，对了解由辅助性T淋巴细胞亚群失衡介导的其他免疫疾病也具有广泛的理论参考价值和重要的实际应用价值。

目前，有关肝纤维化的发病机制尚未完全阐明，且一旦发展为肝硬化并发症较多，因此，在早期寻找能够有效调控肝纤维化进展的关键靶点至关重要。本研究提示因T淋巴细胞亚群的变化导致肝纤维化小鼠的细胞免疫和体液免疫功能的变化而促进其进展，联合阻断ICOS信号及IL-33可调节Th2及Th17极化，下调炎症反应，抑制或防止纤维化的发生与进展。T淋巴细胞及Th细胞亚群的分化、增殖、调控及参与肝纤维化发病的具体机制方面还需要大量的基础及临床实验进一步研究。

引用本文：

王波，李文娜，李欣，等.通过阻断可诱导共刺激分子及白细胞介素33调节四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的免疫应答[J].中华肝脏病杂志，2023,31（5）:504-508.DOI:10.3760/cma.j.cn501113-20211019-00516.

作者贡献声明

王波、李媛、萨如拉、李慧：实验操作、论文撰写；王波、李欣、李文娜：数据整理、统计学分析；丁海涛：研究指导、论文修改

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：内蒙古自治区科技计划项目（2022YFSH0069）;内蒙古自治区自然科学基金（2016BS0812、2020MS08155）;内蒙古医科大学联合项目（YKD2021LH044）

Fund program: The Project of Inner Mongolia Autonomous Region Science and Technology Plan(2022YFSH0069);The General Program of Inner Mongolia Natural Science Foundation (2016BS0812, 2020MS08155)Joint Project of Inner Mongolia Medical University(YKD2021LH044);