肝纤维化是一切慢性肝病的共同病理学基础。肝星状细胞是早期肝损伤中细胞外基质蛋白最主要的来源，肝星状细胞的持续活化在肝纤维化的发展进程中起到了关键作用[1]。有报道肝脏局部存在肾素-血管紧张素（RAS）系统，并且其与肝纤维化形成密切相关。血管紧张素（Ang）Ⅱ是RAS的核心效应分子，它能刺激肝星状细胞增殖与活化，并能释放炎症因子以及促纤维化因子[2]。近年发现的血管紧张素转换酶（ACE）2可降解Ang Ⅱ并同时产生Ang-（1-7）。Ang-（1-7）在体内外通过与Mas受体结合能拮抗Ang Ⅱ的活性。胰岛素样生长因子（IGF）-I与其受体结合亦可促进肝星状细胞增殖，胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）-2作为IGF系统中的主要介质，通过与IGF-I结合影响其活性，进而调节肝纤维化[3]。因此，ACE2、IGFBP-2作为各自系统的调控点均可能在肝纤维化形成中发挥重要作用，本研究通过观察ACE2、IGFBP-2在HSC-T6细胞中的表达，以进一步探索肝纤维化形成机制，以及为临床肝纤维化的治疗提供新的思路和方向。
一、材料与方法
1.实验材料：大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自中国医学科学院肿瘤细胞库。引物、Buffer、RNA酶抑制剂、Ang Ⅱ购自中国吉尔生化上海有限公司，Ang-（1-7）、A779购自Sigma-Aldrich中国有限公司，ACE2与IGFBP-2即用型SABC免疫组织化学试剂盒、ACE2与IGFBP-2兔抗大鼠多克隆抗体、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。随机引物、d NTP、ROX逆转录酶购自上海生工生物科技有限公司。
2.细胞培养：HSC-T6培养在37℃、5%CO2条件下，按实验分组进行处理，分为正常对照组、Ang Ⅱ组、Ang-（1-7）组、Ang Ⅱ+Ang-(1-7)组、Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A779组。分组处理后收集细胞，制备细胞爬片，备用。
3.免疫细胞化学染色法检测ACE2、IGFBP-2的表达：按ACE2和IGFBP-2试剂盒说明书的步骤进行染色，光学显微镜下观察染色结果。标准型全自动医学图像彩色分析系统进行图像半定量分析，对每张细胞爬片随机选取5个视野（×200），测定细胞中棕黄色和棕褐色阳性表达颗粒的平均灰度值，该值越低，表达越强。
4.RT-PCR检测肝星状细胞ACE2和IGFBP-2 mRNA的表达：用Trizol法抽提肝星状细胞总RNA，然后进行逆转录。内参照β-肌动蛋白上游引物：5 ′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游引物：5′-AGAG GTCTTTACGGATGTCAACGT-3′，产物长度为147 bp。ACE2上游引物：5′-GCTAAACATGATGGCCCACT-3′，下游引物：5′-CCCACAGTCGAATTCCTGTT-3′，产物长度为218 bp。IGFBP-2上游引物：5′-AGCATGGCCTGTACAA CCTC-3′，下游引物：5′-CCCAGTATTGGGGTTCACAC-3′,产物长度为86 bp。RT-PCR体系及条件按试剂盒说明书进行。
5.A779的作用：A779为Mas受体阻滞剂，其可抑制ACE2-Ang-(1-7）-Mas受体轴的相应作用。
6.统计学方法：数据以均数±标准差（
±s）表示，采用SPSS13.0统计软件对实验数据分析处理。先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件者行单因素方差分析，不符合上述条件者行秩和检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
二、结果
1.ACE2、IGFBP-2的免疫细胞化学染色结果：经图像分析及数据统计显示，ACE2、IGFBP-2在各组细胞中均有表达。与对照组相比，Ang Ⅱ组中ACE2、IGFBP-2的表达水平增加（P值均<0.05），且ACE2在Ang Ⅱ+Ang-（1-7）组较Ang Ⅱ组进一步增强（P<0.01），但是IGFBP-2在Ang Ⅱ+Ang-（1-7）组较Ang Ⅱ组表达减弱，两组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1，图1。
表1. ACE2、IGFBP-2蛋白在各组细胞中相对表达水平的比较（±s）.
| 组别 | ACE2 | IGFBP-2 |
|---|---|---|
| 对照组 | 174.417±5.945 | 175.382±6.474 |
| Ang Ⅱ组 | 144.222±8.924a | 135.431±5.213a |
| Ang-（1-7）组 | 172.389±6.122 | 173.653±7.315 |
| Ang Ⅱ +Ang-（1-7）组 | 132.167±9.811b | 155.452±4.576b |
| Ang Ⅱ +Ang-（1-7）+A779组 | 143.528±8.988 | 138.424±3.238 |
| F值 | 60.650 | 92.143 |
| P值 | <0.05 | <0.05 |
注：ACE2：血管紧张素转换酶2；IGFBP-2：胰岛素样生长因子结合蛋白-2；Ang：血管紧张素；a与对照组比较，P<0.05；b与AngⅡ组比较，P<0.05
图1. 肝星状细胞中血管紧张素转换酶2的染色结果DAB×200.
三、讨论
2.各组大鼠肝星状细胞ACE2、IGFBP-2 m RNA的表达：各组细胞均有ACE2、IGFBP-2 m RNA的表达，但程度有所不同。RT-PCR结果显示：与正常对照组相比较，Ang Ⅱ组表达ACE2、IGFBP-2 m RNA的水平升高（P值均<0.05)；与Ang Ⅱ组比较，Ang Ⅱ+Ang-（1-7）组中ACE2 m RNA的表达水平增加，IGFBP-2m RNA的表达水平降低，其差异均有统计学意义（P值均<0.05）。见表2。
表2. 各组细胞中ACE2、IGFBP-2 mRNA相对表达水平的比较（±s）.
| 组别 | ACE2 | IGFBP-2 |
|---|---|---|
| 对照组 | 1.4614±0.4494 | 0.6524±0.5166 |
| AngⅡ组 | 3.3710±1.055a1 | 6.0619±1.6430a |
| Ang-（1-7）组 | 1.9951±1.0257 | 0.4552±0.2756 |
| AngⅡ+Ang-（1-7）组 | 5.4198±1.1197b | 2.1334±1.2142b |
| AngⅡ+Ang-（1-7）+A779组 | 3.6743±1.1263 | 5.0202±0.3576 |
| F值 | 72.052 | 53.954 |
| P值 | <0.05 | <0.05 |
注：ACE2：血管紧张素转换酶2；IGFBP-2：胰岛素样生长因子结合蛋白-2；Ang：血管紧张素；a与对照组比较，P<0.05；b与Ang Ⅱ组比较，P<0.05
肝纤维化表现为肝星状细胞大量活化，后者分泌多种细胞外基质，细胞外基质的大量合成及过度沉积是肝纤维化和门静脉高压形成和发展的直接原因。肝内RAS系统与肝纤维化的发生具有密切的关系，Ang Ⅱ被认为是该系统中最具活性的成分。新发现的ACE2-Ang-（1-7）-Mas受体轴是RAS另一条重要途径。Ang-（1-7）通过与细胞膜上Mas受体结合能拮抗Ang Ⅱ的生物学效应。有报道IGF-I能够刺激人肝星状细胞分裂增殖，并增加肝内胶原的合成，提示IGF-I在肝纤维化的发生和发展中有重要的促进作用，并且国内外许多研究已证实，IGFs与肝纤维化、肝硬化的形成、发展有关[4]。IGFBP是一组在结构、功能上相似的多功能蛋白，其与IGFs具有高亲和力，IGFBP通过IGF依赖或非依赖的机制，在调节体内生理和病理过程中发挥重要作用[5]。
已知Ang-（1-7）通过与Mas受体结合后，发挥其生物学效应，Mas受体阻断剂A779可阻断Ang-（1-7）与Mas受体的结合。本研究结果显示ACE2、IGFBP-2在Ang Ⅱ处理组的表达水平与Ang Ⅱ+Ang-（1-7）+A779组的差异无统计学意义，说明Ang-（1-7）的作用可被Mas受体阻断剂A779所阻断。提示Mas受体阻断剂A779可阻断Ang-（1-7）拮抗Ang Ⅱ的作用。
本研究结果还显示ACE2在Ang Ⅱ处理组的表达水平较正常对照组增强，这与Huang等[6]采用体外实验发现在加入Ang Ⅱ处理的肝星状细胞中，ACE2 m RNA及蛋白表达上调的结果一致。研究结果表明，肝脏发生纤维化时，ACE2表达增加，促使Ang-（1-7）的产生，拮抗Ang Ⅱ的缩血管及促肝纤维化作用。而ACE2在Ang Ⅱ+Ang-（1-7）处理组的阳性表达较Ang Ⅱ处理组增强。推测Ang-（1-7）可引起活化的肝星状细胞中ACE2基因表达增强，使ACE2含量增多并通过降解Ang Ⅱ减轻其促肝纤维化作用。
本研究结果亦显示了IGFBP-2在Ang Ⅱ诱导活化的肝星状细胞中表达较正常对照组增强，这与刘立新等[7]的研究结果一致；我们推测IGFBP-2参与了肝纤维化的形成。同时IGFBP-2在Ang Ⅱ+Ang-（1-7）处理组表达较Ang Ⅱ处理组减弱，提示Ang-（1-7）使激活的肝星状细胞中IGFBP-2的表达减弱。我们前期研究结果显示血清IGFBP-2水平与肝纤维化程度呈正相关[8]。IGFBP-2作为评价肝脏功能的指标，表达减弱提示Ang-（1-7）发挥了其拮抗Ang Ⅱ的促肝纤维化作用。
本研究结果证实，ACE2、IGFBP-2参与了肝纤维化的病理过程并且在肝纤维化的发生机制中发挥着重要作用，Mas受体阻断剂A779可阻断Ang-（1-7）与Mas受体的结合，从而阻断Ang-（1-7）拮抗AngⅡ的作用。
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