Abstract
目的
观察替诺福韦酯（TDF）抗病毒治疗对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8+T细胞功能的影响，评估其与HBeAg血清学阴转的相关性。
方法
纳入2016年10月至2018年7月就诊的HLA-A02限制性HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者63例，予以TDF（300 mg/d）抗病毒治疗，分选基线和治疗48周时外周血CD8+T细胞，流式细胞术检测外周血T细胞计数，酶联免疫斑点试验检测分泌穿孔素、颗粒酶B和γ干扰素（IFN-γ）的HBV特异性CD8+T细胞频数，建立HBV特异性CD8+T细胞与HepG2.2.15细胞直接接触和间接接触共培养系统，检测培养上清液中HBV DNA，通过检测乳酸脱氢酶水平计算靶细胞死亡率，酶联免疫吸附试验检测细胞因子表达，评估病毒特异性CD8+T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能。2组计量资料比较采用t检验或配对t检验。
结果
TDF治疗48周时病毒学应答率为100%，生化学应答率为90.48%（57/63），HBeAg阴转率为25.40%（16/63）。外周血T细胞计数在TDF治疗48周时与基线及对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。TDF治疗48周时，CH B患者分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的HBV特异性CD8+T细胞频数较基线显著升高（P＜0.001），HBeAg阴转的CHB患者病毒特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的频数亦显著高于HBeAg未阴转的患者（P＜0.05）。在直接接触和间接接触培养系统中，TDF治疗48周时HBV特异性CD8+T细胞均可诱导HepG2.2.15细胞培养上清液中HBV DNA显著下降（P＜0.001），分泌IFN-γ和白细胞介素-2的水平显著升高（P＜0.05），但仅在直接接触共培养系统中病毒特异性CD8+T细胞诱导HepG2.2.15细胞死亡的比例升高（21.7%±6.18%比16.1%±4.15%，P＜0.001）。HBeAg阴转的CHB患者HBV特异性CD8+T细胞较HBeAg未阴转患者诱导HBV DNA下降水平更显著（P＜0.001）、IFN-γ分泌水平升高（P＜0.05），但靶细胞死亡比例在HBeAg阴转和未阴转患者之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论
TDF治疗过程中，伴随病毒载量下降，病毒特异性CD8+T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能均显著增强，且与HBeAg阴转密切相关。
Keywords: 慢性乙型肝炎, 抗病毒, 免疫应答
Abstract
Objective
To observe the effect of tenofovir disoproxil fumarate (TDF) antiviral therapy on HBV-specific CD8+T cell function in peripheral blood of patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B, and to assess its correlation with HBeAg sero-negativeness.
Methods
Sixty-three cases with HLA-A02 restricted HBeAg-positive chronic hepatitis B who received TDF (300 mg/d) antiviral therapy were enrolled from October 2016 to July 2018. The peripheral blood CD8+T cells were separated at baseline and 48 weeks after treatment. The peripheral blood T cells count were detected by flow cytometry. The frequency of HBV-specific CD8+T cells secreting perforin, granzyme B, and interferon-γ (IFN-γ) were detected by enzymelinked immunoblotting test. Direct and indirect contact co-culture system was established between HBV-specific CD8+T cells and HepG2.2.15 cells. HBV DNA was detected in the culture supernatant. Target cell mortality was calculated by lactate dehydrogenase level. Cytokines expression was detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Virus-specific CD8+T cells cytokilling and non-cytokilling functions were evaluated. Measurement data of the two groups were compared by t-test or paired t-test.
Results
Viral response, biochemical response, and HBeAg seroconversion rate at 48 weeks of TDF treatment were 100%, 90.48% (57/63), and 25.40% (16/63), respectively. There was no statistically significant difference in peripheral blood T cell count when compared with baseline and control group at 48 weeks of TDF treatment (P＞0.05). At 48 weeks of TDF treatment, the frequency of HBV-specific CD8+T cells secreting perforin, granzyme B, and IFN-y in CHB patients was significantly higher than baseline (P＜0.001). Furthermore, the frequency of HBV-specific CD8+T cells secreting perforin, granzyme B, andIFN-γ was also significantly higherin CHB patients with HBeAg negative than that of non-negative (P＜0.05). HBV-specific CD8+T cells bad induced significant down-regulation of HBV DNA in the supernatant of HepG2.2.15 cell culture (P＜0.001) and remarkable IFN-y andinterleukin-2 secretion (P＜0.05) at 48 weeks of TDF therapy in direct and indirect contact co-culture system. However, HepG2.2.15 cells death rate induced by virus-specific CD8+T cells was increased only in the direct contact co-culture system (21.7%±6.18% vs. 16.1%±4.15%，P＜0.001). Compared with HBeAg non-negative patients, HBeAg negative CHB patients with HBV-specific CD8+T cells had induced a strong decrease in HBV DNA (P＜0.001) and an increase in IFN-y secretionlevel (P＜0.05). However, the target cell death proportion difference between HBeAg negative and non-negative patients was not statistically significant (P＞0.05).
Conclusion
During TDF treatment, with the viral load reduction, virus-specific CD8+T cells cytokilling and non-cytokilling functions are significantly enhanced, and are closely related to HBeAg negative.
Keywords: Chronic hepatitis B, Antiviral, Immune response
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染人体后所导致不同的临床转归主要取决于病毒复制和宿主免疫应答之间的复杂相互作用[1]。慢性HBV感染是HBV持续复制介导免疫细胞和免疫分子功能紊乱及失衡，特别是病毒特异性CD8+T细胞的数量和功能衰竭，不能有效发挥抗病毒效应，最终导致免疫耐受和感染慢性化[2]。因此，恢复HBV特异性CD8+T细胞功能已成为目前实现慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）功能性治愈的研究热点之一[3]。替诺福韦酯（tenofovir disoproxil, TDF）等一线核苷（酸）类似物可有效控制HBV复制，但对CD8+T细胞功能的影响及其相关机制尚未完全阐明。因此，本研究通过观察TDF治疗后HBeAg阳性CHB患者HBV特异性CD8+T细胞功能的改变，评估CD8+T细胞功能与HBeAg阴转的相关性，探讨抗病毒治疗对宿主免疫功能的影响。
资料与方法
一、研究对象
本研究选择2016年10月至2018年7月就诊于新乡医学院第一附属医院感染科的HBeAg阳性CHB患者。入选标准：（1）年龄18～60岁；（2）符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[4]的诊断标准；（3）从未服用过任何抗病毒和免疫调节药物；（4）人类白细胞抗原-A02限制性。排除标准：（1）合并其他肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染；（2）合并肝硬化、肝衰竭、肝癌等终末期肝病；（3）合并其他肝脏疾病，如：酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损害等；（4）合并恶性肿瘤；（5）合并脑、肺、肾脏等重要脏器功能不全；（6）妊娠期及哺乳期妇女。患者接受富马酸替诺福韦二吡呋酯片（正大天晴药业集团股份有限公司）300mg/d治疗，随访研究48周，在基线和治疗48周时留取血样作为随访检测标本。同时选择HBsAg阴性的健康志愿者17例作为对照组。入选患者均签署知情同意书，本研究方案通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准（编号：2013002）。
二、研究方法
1.外周血T细胞绝对计数：向Trucount绝对计数管（购自美国BD公司）中加入20μl抗CD3/CD4/CD8荧光标记抗体（购自美国BD公司）和50μl抗凝全血，避光孵育15min，加入450μl FACS红细胞裂解液，孵育45min后使用FACS Calibur流式细胞仪（购自美国BD公司）进行分析，使用Multi SET软件对CD3+、CD4+和CD8+T细胞进行绝对计数。
2.CD8+T细胞的分选：患者和对照者于清晨、空腹采集EDTA抗凝外周血20ml，2h内使用淋巴细胞分离液（购自北京索莱宝生物技术公司）、采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。使用CD8+T细胞分选试剂盒（购自德国美天旎公司）对PBMC中的CD8+T细胞进行分选，调整PBMC浓度至107个/ml，加入RPMI 1640+10%胎牛血清于37℃、5%CO2条件下培养2h，于4℃、300 r/min离心10min，弃上清液后使用40μl缓冲液重悬细胞，加入10μl生物素标记的抗体鸡尾酒（包含抗人CD4、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ、CD235a），于4℃孵育5min后加入30μl缓冲液，再加入20μl CD8+T淋巴细胞磁珠抗体鸡尾酒（包含抗人CD14、CD61和抗生物素抗体），于4℃孵育10min。将上述标记的细胞悬液加入使用缓冲液浸润的、置于MACS磁力架上的分离柱，收集通过分离柱的细胞，即为纯化的CD8+T细胞，分选的CD8+T细胞使用RPMI 1640+10%胎牛血清于37℃、5%CO2条件下培养备用。
3.酶联免疫斑点试验（enzyme linked immunospot assay, ELISPOT）检测分泌穿孔素、颗粒酶B和γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）的HBV特异性CD8+T细胞频数：设立阳性对照组（PHA 10μg/ml）、实验组（HBc18-27多肽10μg/ml，序列：FLPSDFFPSV；HBs 183-191多肽10μg/ml，序列：FLLTRILTI）、阴性对照组，每组设立3个复孔。分别用稀释后的抗穿孔素抗体、抗颗粒酶B抗体和抗IFN-γ抗体（0.5μg/ml，每孔加入100μl；购自美国Abcam公司）包被96孔聚偏氟乙烯（PVDF）膜板，于4℃孵育过夜，次日洗板、封闭。加入所配刺激原和分选的CD8+T细胞105个/孔，终体积为200μl/孔，于37℃、5%CO2条件下培养16h，洗板后每孔加入100μl生物素标记的抗穿孔素抗体、抗颗粒酶B抗体或抗IFN-γ抗体，室温孵育60min，洗板后每孔加入100μl碱性磷酸酶标记的链球菌亲和素，室温避光孵育45min，洗板后加入显色剂孵育15min，加入终止液后洗板。使用ELISPOT读板仪（德国AID公司）读取孔内斑点数，每一个斑点代表一个分泌细胞，计数斑点形成细胞（spot forming cell, SFC）数，记录实验数据为“实验组SFC-阴性对照组SFC”，以106个CD8+T细胞中SFC为单位计数产生穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ的细胞数。
4.CD8+T细胞与HepG2.2.15细胞共培养系统的建立：建立CD8+T细胞（2×105个）和HepG2.2.15细胞（106个）的共培养系统[5]。（1）直接接触共培养系统：将CD8+T细胞与HepG2.2.15细胞直接混合培养，加入HBV表位多肽刺激培养。（2）间接接触共培养系统：将CD8+T细胞与HepG2.2.15细胞分别置于Transwell培养平板（美国康宁公司）的上层和下层，两种细胞被孔径为0.4μm的滤膜分隔，仅可溶性细胞因子可穿过，向上层培养孔中加入HBV表位多肽刺激培养。培养48h后收集上清液。
5.HepG2.2.15细胞死亡检测：通过检测培养上清液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平计算靶细胞死亡率。应用LDH细胞毒性检测试剂盒（购自武汉碧云天公司）检测培养上清液中LDH水平，以HepG2.2.15细胞培养上清液中的LDH水平作为“低水平LDH对照”，以Triton X-100处理的HepG2.2.15细胞培养上清液中的LDH水平作为“高水平LDH对照”。应用以下公式计算靶细胞死亡率：（样本LDH值-低水平LDH对照值）/（高水平LDH对照值-低水平LDH对照值）×100%[5]。
6.酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测培养上清液中IFN-γ、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α ,TNF-α）和白细胞介素-2（interleukin-2, IL-2）水平：使用人IFN-γ、TNF-α和IL-2 ELISA检测试剂盒（购自武汉碧云天公司）对培养上清液中的细胞因子水平进行检测。向检测孔中加入50μl检测稀释液，将培养上清液和倍比稀释的标准品各50μl分别加入检测孔中，同时设立空白对照，室温水平摇床孵育2h。洗涤后每孔中加入200μl样本结合物，室温水平摇床孵育2h，再次洗涤后每孔中加入100μl底物溶液，室温避光孵育30min后向每孔中加入100μl终止液。使用酶标仪（购自美国伯乐公司）在450nm波长测定吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算培养上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平。
三、统计学方法
使用SPSS21.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，2组间比较采用t检验或配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料采用中位数和四分位数间距[M（P25,P75）]表示，2组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料比较采用x2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果
一、一般资料
纳入研究的HLA-A02限制性CHB患者63例，其中男性40例，女性23例，所有患者均为HBeAg阳性，同时入组17例HBsAg阴性的对照者，男性11例，女性6例。CH B患者血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平显著高于对照者。见表1。TDF治疗48周时，所有63例CHB患者外周血HBVDNA定量均低于检测下限，病毒学应答率为100%，57例患者转氨酶复常，生化学应答率为90.48%，16例患者HBeAg阴转，血清学应答率为25.40%，无患者发生HBsAg阴转。
表1. 慢性乙型肝炎患者和对照者的一般资料.
| 组别 | 例数 | 性别（男/女） | HBV DNA（log10IU/ml） | ALT（IU/L） | AST（IU/L） |
|---|---|---|---|---|---|
| 慢性乙型肝炎组 | 63 | 40/23 | 6.08±1.76 | 146（89, 227） | 89（65, 199） |
| 对照组 | 70 | 11/6 | 不适用 | 23（11, 37） | 18（9, 34） |
| 统计量值 | - | χ2=0.471 | Z=5.794 | Z=11.37 | |
| P值 | - | 0.872 | <0.001 | <0.001 |
注：HBV：乙型肝炎病毒；ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶
二、TDF抗病毒治疗不影响CHB患者外周血T细胞绝对计数
CD3+、CD4+和CD8+T细胞计数在未经治疗的CHB患者和对照者之间的差异无统计学意义（P值均＞0.05），抗病毒治疗48周时CHB患者外周血T细胞计数与基线比较差异无统计学意义（P值均＞0.05）。见表2。HBeAg阴转者和HBeAg未阴转者在基线和治疗48周时外周血T细胞计数差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。
表2. 慢性乙型肝炎患者和对照者外周血T细胞计数的比较（个/μl）.
| T细胞计数 | 患者基线 | 患者治疗48周 | 对照者 | F 值 | P 值 |
|---|---|---|---|---|---|
| CD3+T细胞 | 1 972±451 | 1 891±463 | 2 016±524 | 0.345 | 0.731 |
| CD4+T细胞 | 878±230 | 872±194 | 961±275 | 1.266 | 0.209 |
| CD8+T细胞 | 1 071±337 | 1 056±363 | 1 109±391 | 0.399 | 0.691 |
三、TDF抗病毒治疗对CHB患者病毒特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的影响
抗病毒治疗48周时，CHB患者病毒特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的水平均较基线时显著升高（P值均＜0.001），见表3。HBeAg阴转患者（n=16）病毒特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的水平显著高于HBeAg未阴转患者（n=47）（P值均＜0.05），见表4。
表3. 抗病毒治疗前后慢性乙型肝炎患者病毒特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和干扰素-γ的比较.
| 指标 | 基线 | 治疗48周 | t 值 | P 值 |
|---|---|---|---|---|
| 穿孔素（SFC/106） | 89.1±27.6 | 209.5±67.8 | 13.05 | <0.001 |
| 颗粒酶B（SFC/106） | 68.3±19.4 | 119.2±34.7 | 10.16 | <0.001 |
| γ干扰素（SFC/106） | 183.7±34.1 | 262.4±47.9 | 10.62 | <0.001 |
表4. HBeAg阴转和未阴转患者治疗48周病毒特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和干扰素-γ的比较.
| 指标 | HBeAg阴转（ n =16） | HBeAg未阴转（ n =47） | t 值 | P 值 |
|---|---|---|---|---|
| 穿孔素（SFC/106） | 236.7±70.4 | 200.4±56.5 | 2.082 | 0.041 |
| 颗粒酶B（SFC/106） | 143.1±44.4 | 91.6±28.3 | 5.392 | <0.001 |
| γ干扰素（SFC/106） | 287.9±56.3 | 239.1±42.4 | 3.649 | 0.0005 |
四、TDF抗病毒治疗对CHB患者病毒特异性CD8+T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能的影响
无论在共培养系统中直接接触还是间接接触，治疗48周时的病毒特异性CD8+T细胞均可诱导培养上清液中HBV DNA水平显著下降（均P＜0.001），治疗48周时培养上清液中的IFN-γ和IL-2水平则显著高于基线（P值均＜0.05）。在直接接触共培养系统中，治疗48周时病毒特异性CD8+T细胞诱导的HepG2.2.15细胞死亡比例显著高于基线（P＜0.001），而在间接接触共培养系统中，病毒特异性CD8+T细胞诱导的靶细胞死亡比例在基线和治疗48周时的差异无统计学意义（P=0.464）。见表5。
表5. 慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后病毒特异性CD8+T细胞细胞杀伤和非细胞杀伤功能的比较.
| 指标 | 基线 | 治疗48周 | t 值 | P 值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 直接接触共培养系统 | |||||
| HBV DNA（log10IU/ml） | 7.61±0.54 | 5.89±0.37 | 20.86 | <0.001 | |
| 靶细胞死亡（%） | 16.10±4.15 | 21.70±6.18 | 5.971 | <0.001 | |
| IFN-γ（pg/ml） | 108.40±28.20 | 210.70±77.30 | 9.868 | <0.001 | |
| TNF-α（pg/ml） | 964.30±278.90 | 1 145.00±319.50 | 3.382 | 0.000 9 | |
| IL-2（pg/ml） | 421.40±107.20 | 481.70±152.30 | 2.570 | 0.011 | |
| 间接接触共培养系统 | |||||
| HBV DNA（log10IU/ml） | 7.78±0.82 | 5.76±0.61 | 15.69 | <0.001 | |
| 靶细胞死亡（%） | 5.15±1.68 | 4.98±0.74 | 0.735 | 0.464 | |
| IFN-γ（pg/ml） | 54.00±13.80 | 87.10±24.70 | 9.286 | <0.001 | |
| TNF-α（pg/ml） | 768.20±203.40 | 811.90±261.20 | 1.048 | 0.297 | |
| IL-2（pg/ml） | 267.20±41.00 | 314.80±96.40 | 3.607 | 0.0004 | |
注：HBV：乙型肝炎病毒；IFN-γ：γ干扰素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-2：白细胞介素-2
无论直接接触还是间接接触共培养系统中，治疗48周时HBeAg阴转患者的病毒特异性CD8+T细胞较HBeAg未阴转患者可更显著诱导培养上清液中HBV DNA水平下降（P值均＜0.001），HBeAg阴转者培养上清液中IFN-γ的分泌水平较HBeAg未阴转者显著升高（P值均＜0.05）。但病毒特异性CD8+T细胞诱导的HepG2.2.15细胞死亡比例及TNF-α、IL-2表达水平在HBeAg阴转和未阴转患者之间的差异无统计学意义（P值均＞0.05）。见表6。
表6. HBeAg阴转和未阴转患者治疗48周病毒特异性CD8+T细胞细胞杀伤和非细胞杀伤功能的比较.
| 指标 | HBeAg阴转（ n =16） | HBeAg未阴转（ n =47） | t 值 | P 值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 直接接触共培养系统 | |||||
| HBV DNA（log10IU/ml） | 5.37±0.22 | 6.07±0.48 | 5.613 | <0.001 | |
| 靶细胞死亡（%） | 20.40±7.01 | 22.90±5.79 | 1.413 | 0.162 | |
| IFN-γ（pg/ml） | 237.10±79.40 | 191.30±71.70 | 2.148 | 0.036 | |
| TNF-α（pg/ml） | 1 187.00±322.00 | 1102.00±302.60 | 0.955 | 0.343 | |
| IL-2（pg/ml） | 480.10±166.70 | 483.40±139.80 | 0.077 | 0.938 | |
| 间接接触共培养系统 | |||||
| HBV DNA（log10IU/ml） | 5.29±0.44 | 5.99±0.84 | 5.896 | <0.001 | |
| 靶细胞死亡（%） | 5.02±0.87 | 4.88±0.68 | 0.661 | 0.511 | |
| IFN-γ（pg/ml） | 109.60±33.40 | 71.80±19.50 | 5.513 | <0.001 | |
| TNF-α（pg/ml） | 807.80±271.20 | 820.30±245.50 | 0.171 | 0.865 | |
| IL-2（pg/ml） | 334.60±117.20 | 307.10±82.60 | 1.029 | 0.307 | |
注：HBeAg：乙型肝炎e抗原；HBV：乙型肝炎病毒；IFN-γ：γ干扰素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-2：白细胞介素-2
讨论
治疗CHB的抗病毒药物主要包括IFN-α和核苷（酸）类似物，IFN-α兼具抗病毒和免疫调节的双重作用，有望诱导持久免疫控制，实现HBsAg清除，达到功能性治愈[6]。但在抗病毒治疗过程中，核苷（酸）类似物是否参与可机体免疫功能的调控尚不清楚。研究发现替比夫定可抑制CHB患者外周血病毒特异性Th17细胞水平和IL-22的分泌[7]，调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）水平亦降低，病毒特异性Treg/Th17细胞比例的显著下降可预测HBeAg血清学转换[8,9]。在使用阿德福韦酯抗病毒治疗过程中，伴随HBV病毒载量的下降，HBeAg阴转患者病毒特异性T细胞分泌IFN-γ和细胞增殖能力均显著增强，HBV特异性T细胞免疫功能恢复，而以Treg和自然杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的变化与HBeAg血清学转换则无明显相关性[10]。上述结果提示HBV特异性免疫细胞在控制病毒复制和机体炎症应答中发挥重要作用。本研究结果显示，CHB患者无论是否接受TDF抗病毒治疗，其外周血中CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量与健康对照者比较差异均无统计学意义，提示HBV感染并不影响T细胞的数量。而慢性HBV感染可诱导T细胞免疫耐受，特别是病毒特异性CD8+T细胞功能衰竭，不能有效清除病毒，致使感染慢性化[11]。我们发现TDF抗病毒治疗在有效抑制HBV复制的同时，亦可提升CHB患者病毒特异性CD8+T细胞的功能，这不但进一步说明CHB患者中存在CD8+T细胞功能不全/衰竭，还提示抗病毒治疗可恢复部分病毒特异性细胞免疫功能，免疫细胞之间的相互调节可改善免疫微环境，进而影响抗病毒治疗。
CD8+T细胞可通过穿孔素-颗粒酶介导的细胞杀伤作用和分泌细胞因子介导的非细胞杀伤作用发挥细胞毒性作用，清除病毒感染[12]。核苷酸类似物不但可发挥抑制HBV逆转录酶的功能，还能在胃肠道中诱导IFN-入3分泌，抑制肠溶性脂多糖介导的IL-10产生，诱导IL-12p70和TNF-α分泌，但在核苷类似物却并未发现相似的作用[13,14]。本研究结果显示TDF治疗后，HBV特异性CD8+T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的水平升高，这一升高过程在发生HBeAg阴转的患者中更为明显，这提示TDF介导的病毒抑制可能伴随HBV特异性CD8+T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能的增强。我们进一步利用直接接触共培养系统和间接接触共培养系统评估HBV特异性CD8+T细胞的功能，结果显示无论在直接接触还是间接接触共培养系统中，TDF治疗后的病毒特异性CD8+T细胞介导的HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA水平较未治疗患者均显著下降，但仅在直接接触共培养系统中出现HepG2.2.15靶细胞死亡比例升高，这提示虽然在抗病毒治疗后HBV特异性CD8+T细胞的直接细胞杀伤功能显著增强，但其可能仍主要通过分泌细胞因子介导的非细胞杀伤功能抑制HBV复制，这与既往的研究结果一致[5]。而在间接接触共培养系统中，IFN-γ和IL-2的分泌水平在TDF治疗后显著升高，提示此两种细胞因子可能主要介导病毒抑制作用。进一步分析则发现，在HBeAg阴转的CHB患者中，病毒特异性CD8+T细胞介导的病毒抑制亦显著高于HBeAg未阴转患者，而IFN-γ在这一过程中发挥重要作用，提示IFN-γ可能是促进HBeAg血清学转换的关键细胞因子之一。
综上所述，TDF在有效抑制HBV病毒复制的同时，亦可诱导病毒特异性CD8+T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能均显著增强，以分泌IFN-γ为主要效应因子的非细胞杀伤作用与HBeAg阴转密切相关。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明
段树鹏、侯丽娟、王宏伟、宋新文、郝洁：文献复习、患者入组、实验操作；段树鹏、朱利红：文章撰写、图文处理、统计分析；段树鹏：指导实验完成
Funding Statement
基金项目：河南省医学科技攻关计划项目（201303106）
Fund program: Medical Science and Technique Foundation of Henan Province (201303106)
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