Abstract
目的
探索一种非侵入性、简单的筛查早期肝癌的方法，采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学方法筛查乙型肝炎相关肝癌的唾液标志物。
方法
收集唾液样本，提取唾液蛋白，用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学方法分析肝细胞癌（HCC）组和非HCC组间差异表达蛋白。采用免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附试验在肝癌组织和唾液中验证差异蛋白，并确定标志物。采用t检验、多种非参数检验、Spearman相关分析等统计学分析方法对唾液标志物的诊断效能进行统计分析。
结果
通过比较HCC组与非HCC组数据，筛选出了152个唾液差异表达蛋白。通过免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附试验验证，结果显示α-1-酸性糖蛋白1和甲胎蛋白（AFP）在HCC组中表达显著增高（P＜0.05）。唾液AFP与血清AFP显著相关（P＜0.05）。唾液α-1-酸性糖蛋白1与AFP联合用于诊断HCC时，受试者操作特征曲线下面积值为0.8726（95%CI：0.8104～0.9347），敏感度为78.3%，特异度为88.0%。
结论
唾液AFP和α-1-酸性糖蛋白1可作为乙型肝炎相关肝癌的潜在生物标志物。
Keywords: 唾液, 甲胎蛋白, α-1-酸性糖蛋白1, 肝细胞癌, 生物标志物
Abstract
Objective
To study using isotope-labeled relative and absolute quantitative proteomics methodologies to screen for salivary biological markers as a simple, non-invasive tool for identifying hepatitis B-related HCC at an early stage.
Methods
Saliva samples were collected to extract salivary proteins. Isotope-labeled relative and absolute quantitative proteomics were used to analyze the differentially expressed proteins between the hepatocellular carcinoma (HCC) and non-HCC groups. Western blotting, immunohistochemistry, and enzyme-linked immunosorbent assays were used to verify differential proteins and identify markers in liver cancer tissues and saliva. Statistical analysis was used to analyze the diagnostic efficiency of salivary biomarkers.
Results
152 differentially expressed salivary proteins were screened out between the HCC and non-HCC groups. Western blot,immunohistochemistry, and enzyme-linked immunosorbent assays validated that the expressions of α-1-acid glycoprotein 1 (ORM1) and alpha-fetoprotein (AFP) were significantly increased in HCC (P＜0.05). There was a significant correlation between salivary AFP and serum AFP (P＜0.05). HCC was diagnosed when salivary α-1-acid glycoprotein 1 combined with AFP. The area underthe receiver operating characteristic curve was 0.8726 (95% confidence interval: 0.8104～0.9347), the sensitivity was 78.3%, and the specificity was 88%.
Conclusion
Salivary AFP and α-1-acid glycoprotein 1 can serve as potential biomarkers for hepatitis B-related hepatocellular carcinoma.
Keywords: Saliva, Alpha-fetoprotein, α-1-acid glycoprotein 1, Hepatocellular carcinoma, Biomarker
根据国际癌症研究机构资料显示，肝癌在全球发病率排名第6，在男性中排名第5，女性中第9，病死率排名第3[1]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的肝癌病理类型，占90%[2]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是HCC最主要的危险因素[3]。肝癌的发病率在过去10年中有所下降，但病死率仍然很高[1]。与晚期肝癌相比，早期肝癌的5年生存率通过有效治疗可大大提高，早期诊断对改善肝癌预后尤为重要[4]。早期筛查和监测可作为影响肝癌预后的独立因素[5]。目前常用B型超声和血清甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）进行肝癌的筛查和检测。B型超声检测需要禁食至少8h，检测的准确性受到肝脏特征（如肝脏质地异常）、患者特征（如肥胖）、操作者技术（如超声质量和经验）等条件的限制[6]。与超声相比，生物标志物筛查肿瘤对医生和患者都更方便。目前常用来筛查肝癌的生物标志物是AFP。超声对早期肝癌筛查的敏感度为47%（95%CI：33%～61%），超声联合AFP对早期肝癌筛查的敏感度为63%（95%CI：48%～75%）[4]。随着技术的进步，AFP L3%、脱羧凝血酶原等生物标志物以及液体活检技术可以提高肝癌检测的敏感度和特异度[7]。唾液是一种微酸性的口腔液体，由唾液腺分泌物、龈沟液和血清渗出微生物等组成。它富含丰富蛋白质和细胞成分，可用于各种癌症的早期筛查和监测[8]。已有报道，唾液LNC PCDH9 13∶1是早期HCC的理想生物标志物[9]。12种唾液代谢物的组合诊断HCC可达到较高的敏感度和特异度[10]。等压标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation, i TRAQ）质谱技术已广泛生用于各种疾病的研究[11]。唾液检测具有非侵入性和相对简单的操作优势，我们采用基于i TRAQ的蛋白质组学方法，揭示肝癌患者与健康受试者、肝硬化（liver cirrhosis, LC）和乙型病毒性肝炎患者唾液蛋白的差异，筛选出潜在的肝癌唾液标志物。
资料与方法
1.受试者选择：本研究包括发现和验证队列，发现队列40例受试者，包括10例HCC患者、10例LC患者、10例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者和10名健康受试者作为正常对照（normal control, NC）。验证队列包括160例受试者，其中60例HCC患者，40例LC患者，40例CHB患者，20名健康受试者作为NC。健康受试者为健康检查结果正常的个体，检查项目包括胸片、口腔、腹部超声、大便常规、血常规、肝肾功能，HBV、HCV抗原检测结果，无人类免疫缺陷病毒、梅毒抗体。HCC、LC和CHB的诊断符合美国肝病研究学会、欧洲肝脏研究学会和亚太肝脏研究学会标准[12，13，14]。HCC患者均未接受抗癌治疗，HCC和LC患者均有HBV感染，无其他原因引起的口腔疾病或慢性肝病。
2.唾液标本采集：标本采集时间为上午8∶00至10∶00，采集前至少2h避免进食、饮水和吸烟，并在采集前用清水漱口[15]。采用吐痰法采集唾液[16]，受试者将唾液吐入预冷的15ml离心管中。4000×g，4℃离心15min，将上清液转移至1.5ml试管中，进一步离心（12000×g, 10min,4℃），完全去除细胞成分。按100∶1的比列在唾液上清液中加入蛋白酶抑制剂，-80℃保存待用。
3.唾液蛋白提取与标记：发现队列每组中10个唾液样本汇集在一起，获得每组1个混合样本。4组混合样品用冷丙酮沉淀，用Bradford法检测蛋白的蛋白浓度。将唾液蛋白悬浮液、变性、半胱氨酸阻断，并用胰蛋白酶消化。每组样品用i TRAQ标记试剂（购自美国Thermo Fisher Scientific公司）标记，并用不同的标签重复（NC组标记117和118；CHB组标记119和121；LC组标记为115和116；HCC组标记为113和114）。
4.肽分离：样品的液相分离采用Shimadzu LC-20AB液相系统，色谱柱为5μm4.6mm×250 mm Gemini C18。在214nm波长处监测洗脱峰，每1min收集1个组分。根据色谱洗脱峰图组合样品，得到20份样品，然后冻干。
5.高效液相层析：用流动相A（2%乙腈，0.1%甲酸）重组干燥的肽样品，20000×g离心10 min，取上清液。分离使用Thermo Ulti Mate 3000 UHPLC（购自美国Thermo Fisher Scientific公司）进行。
6.质谱检测：用乙腈溶液将上述肽段结晶溶解后，再通过液相色谱以及串联质谱进行鉴定。正离子模式，捕获300～1800m/z离子信息。用Protein Pilot 2.0版蛋白定量分析软件以及IPI HUMAN数据库。取95%CI，且5%假阳性率；蛋白识别要求至少2个独特肽；蛋白质评分的选择阈值＞1.3[17]。
7.目标蛋白选择：从i TRAQ结果中筛选出差异倍速排名前10的上调差异表达蛋白，并通过免疫印迹在混合和个人唾液样本中进行验证。选择在免疫印迹分析鉴定为肝癌组显著过表达的蛋白。最后，通过免疫组织化学和酶联免疫吸附试验（ELISA）找出肝癌组织和肝癌患者唾液中高表达的蛋白作为本研究的目标蛋白。
8.免疫印迹：提取的蛋白浓度通过BCA蛋白测定试剂盒（购自中国Beyotime Institute of Biotechnology公司）测定。提取发现队列中4组混合唾液样本的蛋白质，后加入5×上样缓冲液（购自中国Beyotime公司），100℃煮沸5min。蛋白质样品经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到聚偏二氟乙烯膜（购自美国Millipore公司）上。用5%牛血清白蛋白和TBST在室温下封闭2h。然后将膜放入第一抗体稀释液（1∶1000；抗-AFP，ab169552，Abcam，英国；抗-ORM1，ab134042，Abcam，英国；抗-MMP9，ab246539，Abcam，英国；抗-Haptoglobin，ab256454，Abcam，英国；抗-Arginase，ab124917，Abcam，英国；抗-FCGR3B，A7894，ABclonal，中国；抗-COTL1，A4550，ABclonal，中国；抗-甘油醛-3-磷酸脱氢酶，5174S，Cell Signaling Technology，美国）4℃孵育12h，再将膜用1×TBST洗3次。将膜放入第二抗体稀释液中（1∶5000；购自美国Santa Cruz Biotechnology公司）在常温下孵育1h，再用1×TBST洗3次。以1∶1的比例制备ECL试剂，使用Chemi Doc MP成像系统分析条带（Bio-Rad Laboratories）。
9.免疫组织化学：利用组织芯片的免疫组织化学染色检测AFP，α-1-酸性糖蛋白1（ORM1）和触珠蛋白（haptoglobin, HP）在肝癌组织中的表达。组织芯片（OD-CT-Dg Liv03-003，购自中国上海芯超公司），包括31个HCC组织和31个匹配的癌旁组织。将组织切片在二甲苯和乙醇梯度下复水，用双蒸馏水洗涤，在3%过氧化氢中浸泡10 min，以淬灭内源过氧化物酶活性。用BSA封闭组织芯片30min，然后在AFP、ORM1和HP的第一抗体稀释液4℃条件下孵育过夜。使用DAKO En Vision+System,HRP（Dako Cytomation, Glostrup, Denmark）在200倍放大下检测AFP、ORM1和HP表达。核染色强度分为阴性、弱、中、强，分别用数字0、1、2、3表示。阳性细胞数分为0、1、2、3、4级，分别占细胞总数的0、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。染色指数定义为核染色强度评分与阳性细胞数评分的乘积（范围：0～12）。
10.ELISA检测和实验指标检测：使用ELISA试剂盒对来自验证队列的160份唾液样本中AFP（ELH-AFP-1，Raybiotech，Peachtree Corners，GA，美国）和ORM1（243675，购自英国Abcam公司）检测，检测方法按照相应ELISA试剂盒的说明书执行。用liaseroin s.p.a.（意大利）自动化学发光分析仪测定血清AFP水平。唾液和血液测试由不同的研究人员在两个不同的实验室独立进行。由于标本是随机编号的，研究人员不知道患者的基本信息。
11.统计学方法：所有实验至少进行了3次。采用SPSS 20.0（购自美国IBM公司）进行统计分析。正态分布的定量变量以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用Student′s t检验，多组间比较采用方差分析。非正态分布的定量变量以中位数（P25, P75）表示，两组间采用Mann-Whitney U检验。多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验进行分析。对于分类变量，我们采用卡方检验分析组间差异，用Spearman相关分析来确定两个连续变量（唾液AFP和血清AFP）之间的相关性。采用受试者操作特征（ROC）曲线分析评价目标蛋白的诊断效能。对于两个标志物的联合诊断模型，使用二元逻辑回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义，所有显著性检验均为双侧检验。为便于统计分析，我们对其中部分数值进行了赋值。如果检测值超出检测范围上限，则由最高上限值赋值（例如临床指标血清AFP＞1210ng/ml，则赋值血清AFP为1210ng/ml）；当然，对于唾液AFP，唾液ORM1和唾液HP若超出ELISA检测上限，则将其稀释适当比例后再进行检测。如果检测值低于检测范围的下限，则用最低下限值的1/2表示（例如用ELISA试剂盒检测不到唾液AFP，而此试剂盒的最低检测下限为6pg/ml，则赋值唾液AFP为3pg/ml）。
结果
1.受试者的人口学和临床特征：本研究共纳入200例受试者。发现队列共有40例受试者，其中HCC组10例，LC组10例，CHB组10例，NC组10名。两组之间在性别和年龄方面差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。各组间天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、AFP、HBV DNA水平因疾病状态不同而有所差异（P＜0.05）。验证队列共160例，其中HCC组60例，LC组40例，CHB组40例，NC组20名，各组间年龄和性别差异无统计学意义（P＞0.05），组间AST、ALT、AFP、HBV DNA水平差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。
表1. 发现队列的人口统计学和临床特征.
| 组别 | 例数 | 年龄 (岁) |
性别 （男/女） |
丙氨酸转氨酶 (IU/ml) |
天冬氨酸转氨酶 （IU/ml） |
甲胎蛋白 （μg/L） |
HBV DNA （log IU/ml） |
HBeAg (阳性/阴性) （n） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 肝细胞癌组 | 10 | 51.60±7.95 | 8/2 | 63（45.75,71.00) | 109.5（49.50，172.75) | 1210（884.98，1210.00） | 4.4（2.85,5.69） | 1/9 |
| 肝硬化组 | 10 | 52.90±11.06 | 8/2 | 22（14.25,40.00) | 34.5（20.75，55.00) | 2.41（2.00，3.17） | 1.69（1.69,1.69） | 0/10 |
| 慢性乙型肝炎组 | 10 | 45.60±11.00 | 8/2 | 1020（259.50,1496.50） | 443.0（168.50，994.50) | 43.19（12.03，162.75） | 6.53（4.10,7.97） | 2/8 |
| 正常对照组 | 10 | 49.40±9.73 | 8/2 | 22（16.25,24.25) | 27.5（20.25，34.50) | NA | NA | 0/10 |
| P值 | NSa，b，c | NSa，b，c | P <0.05a，b，c | P <0.05a，b，c | P <0.05a，b | P <0.05a, NSb | NSa，b，c |
注：发现队列的人口统计学和临床特征正态分布的定量变量表示为均值±标准差（±s）， t检验用于两组之间的比较，方差分析用于多组之间的对比。非正态分布的定量变量用中位数（P25， P75）表示，两组之间使用曼惠特尼 U检验。a:HCC组比LC组；b:HCC组比CHB组；c:HCC组比NC组。NC：正常对照；CHB：慢性乙型肝炎；LC：肝硬化；HCC：肝细胞癌；NA：无数据
表2. 验证队列的人口统计学和临床特征.
| 组别 | 例数 | 年龄 (岁) |
性别 （男/女） |
丙氨酸转氨酶(IU/ml) | 天冬氨酸转氨酶 （IU/ml） |
甲胎蛋白 （μg/L） |
HBV DNA （log IU/ml） |
HBeAg (阳性/阴性) （n） |
TNM Ⅰ~Ⅱ（n） |
TNM Ⅲ~Ⅳ（n） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 肝细胞癌组 | 60 | 52.47±8.65 | 55/5 | 54.5（30.25，86.75） | 81.95（42.00，176.30） | 611.3（60.70，1210） | 3.11（1.70，4.91） | 17/43 | 24 | 36 |
| 肝硬化组 | 40 | 51.93±12.18 | 32/8 | 35（19.25，94.00） | 49（33.25，121.50） | 11.57（3.14，31.78） | 1.70（1.70，3.56） | 9/31 | NA | NA |
| 慢性乙型肝炎组 | 40 | 47.88±9.36 | 32/8 | 428.5（122.0，690.8） | 190（93.0，435.5） | 13.52（4.27，65.28） | 5.56（3.60，7.85） | 21/119 | NA | NA |
| 正常对照组 | 20 | 48.20±10.76 | 17/3 | 26（19.25，34.75） | 25.5（17.25，30.75） | NA | NA | 0/20 | NA | NA |
| P值 | NSa，b，c | NSa，b，c | NSa， P <0.05b，c | Na， P<0.05b，c | P <0.05a，b | P <0.05a，b | NSa， P <0.05b，c |
注：正态分布的定量变量表示平均值±标准差（±s）， t检验用于两组之间的比较，方差分析用于多组之间的对比。非正态分布的定量变量用中位数（ P25， P75）表示，两组之间使用曼惠特尼 U检验。a：HCC组比LC组；b：HCC组比CHB组；c：HCC组比NC组。缩写：NC：正常对照；CHB：慢性乙型肝炎；LC：肝硬化；HCC：肝细胞癌；NA：无数据
2.唾液蛋白质组学：HCC组与LC组、CHB组、NC组比较，共鉴定出DEPs 1623个。在3个对照组中都存在，且满足变化倍数＞1.3或＜0.77（1/1.3），肽段≥2的DEPs有152个（补充材料）。这152个DEPs有41个DEPs上调，111个DEPs下调。上调DEPs排名前10的蛋白质分子见表3。
表3. 前10上调了差异表达的蛋白质.
| 蛋白质编号 （uniport） |
基因特征 | 说明 | Peptides （95%） |
HCC组比 NC组（FC） |
HCC组比 CHB组（FC） |
HCC组比 LC组（FC） |
均值 （FC） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Q9Y3C6 | PPIL1 | Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 1 | 2 | 2.43 | 2.51 | 2.28 | 2.41 |
| P02771 | AFP | Alpha-fetoprotein | 11 | 2.53 | 2.47 | 2.19 | 2.39 |
| O75015 | FCGR3B | Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B | 2 | 1.65 | 2.12 | 2.09 | 1.95 |
| P00738 | HP | Haptoglobin | 9 | 1.35 | 2.22 | 2.19 | 1.92 |
| P14780 | MMP9 | Matrix metalloproteinase-9 | 25 | 1.68 | 1.63 | 1.87 | 1.72 |
| Q14019 | COTL1 | Coactosin-like protein | 6 | 1.87 | 1.37 | 1.88 | 1.71 |
| P05089 | ARG1 | Arginase-1 | 10 | 1.82 | 1.39 | 1.88 | 1.70 |
| O43516 | WIPF1 | WASL-interacting protein family member 1 | 4 | 1.77 | 1.64 | 1.65 | 1.69 |
| P02763 | ORM1 | Alpha-1-acid glycoprotein 1 | 5 | 1.33 | 1.68 | 1.86 | 1.62 |
| P07737 | PFN1 | Profilin-1 | 14 | 1.76 | 1.41 | 1.68 | 1.62 |
注：NC：正常对照；CHB：慢性乙型肝炎；LC：肝硬化；HCC：肝细胞癌；FC：差异倍数
3.目的蛋白的验证与测定：（1）免疫印迹：根据上调前10位DEPs的抗体试剂的可获得性，通过免疫印迹对4组混合唾液样本中的AFP、HP、ORM1、ARG1、COTL1、FCGR3B和MMP9的表达水平进行分析。AFP、ORM1、HP和MMP9在HCC组的表达明显高于非HCC组（P＜0.05）（图1A）。在发现队列中随机抽取3例受试者的唾液样本，并采用Western blot检测AFP、ORM1、HP、MMP9和ARG1的表达水平。只有AFP、ORM1和HP在HCC组中显著高于非HCC组（P＜0.05）（图1B）。（2）免疫组织化学：在肝癌组织和癌旁组织中比较AFP、ORM1和HP的表达水平。AFP和ORM1在肝癌组织中呈强染色，比较同一患者肝癌组织与正常癌旁组织的染色指数，结果显示肝癌组织中AFP和ORM1的表达明显高于正常组织（P＜0.05）（图2A，图2B）。而HP染色强度和染色指数在肝癌组间差异无统计学意义（P=0.155）（图2C）。（3）ELISA和实验指标：血清AFP、唾液AFP、ORM1、HP定量分析结果见表4。HCC组血清AFP水平高于LC和CHB组（P＜0.001）（图3A）。HCC组的唾液AFP水平高于非HCC组（P＜0.001）（图3B）。HCC组唾液ORM1水平高于非HCC组（P＜0.001）（图3C）。唾液HP在HCC组中的表达显著高于LC组（P=0.018），但在HCC组分别与CHB组和NC组比较，唾液HP的表达差异无统计学意义（P＞0.05）（图3D）。晚期肝细胞癌（TNMⅢ～Ⅳ）血清AFP和唾液AFP水平显著高于早期肝细胞癌（TNMI～Ⅱ）（P＜0.001）（图4A，图4B）。唾液ORM1在晚期HCC组的表达显著高于早期HCC组（P=0.02）（图4C）。早期和晚期肝癌患者的唾液HP水平差异无统计学意义（P=0.182）（图4D）。我们用同样的蛋白质组学方法检测到AFP和ORM1在肝癌患者的血液和尿液中液高于非肝癌受试者[18，19]。因此，我们以唾液中的AFP和ORM1作为目标蛋白，进一步研究这两种唾液蛋白在肝癌中的诊断作用。（4）唾液AFP与血清AFP的相关性分析：我们分析唾液AFP和血清AFP的相关性（图5），Spearman相关系数r=0.909（P＜0.001）。唾液AFP极有可能来自血液。（5）唾液AFP和唾液ORM1的诊断效能：我们绘制了血清AFP、唾液AFP、唾液AFP+ORM1的ROC曲线（图6～图8）。根据约登指数（敏感度+特异度-1）评估截断值。在慢性肝病不同阶段下，唾液AFP或唾液ORM1用于诊断HCC的受试者操作特征曲线下面积（area under curve, AUC）值均低于血清AFP，而唾液AFP+ORM1联合诊断HCC的AUC值高于血清AFP（图6）。当我们把LC组、CHB组和NC组作为对照组，唾液AFP的AUC是0.8169（95%CI：0.7440～0.8898），在截断值为107.5pg/ml时，敏感度为61.67%，特异度为93%，阳性预测值（PPV）为84.1%，阴性预测值（NPV）为80.2%（图7A，表5）；唾液ORM1的AUC为0.77（95%CI：0.6898～0.8502），当截断点设为2484ng/ml时，其敏感度为53.33%，特异度为93.00%，PPV为82.10%，NPV为76.70%（图7B，表6）；唾液AFP+ORM1联合的AUC为0.8726（95%CI：0.8104～0.9347），敏感度为78.3%，特异度为88.0%，PPV为79.7%，NPV为87.1%（图7C，表7）。
图1. 各实验组蛋白质印迹验证结果.
注：HCC：肝细胞癌；LC：肝硬化；CHB：慢性乙型肝炎；NC：正常对照；AFP：甲胎蛋白；ORM1：α-1-酸性糖蛋白1；HP：触珠蛋白；MMP9：基质金属蛋白酶9；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶
图2. 各实验组免疫组织化学验证结果.
表4. 各组甲胎蛋白、ORM1和HP的表达情况.
| 分组 | 血清甲胎蛋白（ng/ml） | 唾液甲胎蛋白（pg/ml） | 唾液ORM1（ng/ml） | 唾液HP（pg/ml） |
|---|---|---|---|---|
| 肝细胞癌组 | 611.3（60.70，1210.0） | 206.50（12.25，3662.00） | 3176（1034，4973） | 21648（13579，85267） |
| 肝硬化组 | 11.57（3.14，31.78） | 3.00（3.00，11.75） | 857（421，1730） | 15464（3332，37297） |
| 慢性乙型肝炎组 | 13.52（4.27，65.28） | 5.50（3.00，63.75） | 1073.0（570.5，1851.0） | 20920（11628，46777） |
| 正常对照组 | NA | 3（3，19） | 438.5（329.5，518.0） | 10958（1448，89910） |
| TNM Ⅰ~Ⅱ | 84.14（12.25，411.70） | 22.0（6.0，132.8） | 1464.0（644.3，4626.0） | 15899（11960，79457） |
| TNM Ⅲ~Ⅳ | 1210.00（472.70，1210.00） | 1816.0（131.3，11812.0） | 3802（1605，6252） | 28449（14351，94037） |
注：非正态分布的定量变量用中位数（P25，P75）表示；ORM1：α-1-酸糖蛋白1；HP：触珠蛋白；NA：无数据
图3. 各实验组酶联免疫吸附验证结果.
注：HCC：肝癌组；LC：肝硬化组；CHB：慢性乙型肝炎组；NC：空白对照组
图4. 晚期肝癌和早期肝癌中标志物的表达差异比较.
图5. 唾液甲胎蛋白和血清甲胎蛋白的相关性.
图6. 不同疾病状态标志物的受试者操作特征曲线分析.
注：AUC：受试者操作特征曲线下面积；Sensitivity：敏感度；Specificity：特异度
图8. 受试者操作特征曲线合并比较.
图7. 以对照组为肝硬化、慢性乙型肝炎、正常对照时唾液标志物诊断肝细胞癌的受试者操作特征曲线.
注：AUC：受试者操作特征曲线下面积；Sensitivity：敏感度；Specificity：特异度
表5. 唾液中的甲胎蛋白阳性对新诊断肝癌的预测价值.
| 分组 | 唾液甲胎蛋白阳性 | 唾液甲胎蛋白阴性 | 合计 |
|---|---|---|---|
| 肝细胞癌组 | 37 | 23 | 60 |
| 非肝细胞癌组 | 7 | 93 | 100 |
| 合计 | 44 | 116 | 160 |
表6. 唾液α-1-酸性糖蛋白1阳性对新诊断HCC的预测价值.
| 分组 | 唾液α-1-酸性糖 蛋白1阳性 |
唾液α-1-酸性糖 蛋白1阴性 |
合计 |
|---|---|---|---|
| 肝细胞癌 | 32 | 28 | 60 |
| 非肝细胞癌 | 7 | 93 | 100 |
| 合计 | 39 | 121 | 160 |
表7. 唾液甲胎蛋白和α-1-酸性糖蛋白1阳性对新诊断肝细胞癌的预测价值.
| 分组 | 唾液甲胎蛋白或α-1-酸性糖蛋白1阳性 | 唾液甲胎蛋白和α-1-酸性糖蛋白1均为阴性 | 合计 |
|---|---|---|---|
| 肝细胞癌 | 47 | 13 | 60 |
| 非肝细胞癌 | 12 | 88 | 100 |
| 合计 | 59 | 101 | 160 |
讨论
目前，有肝癌危险因素的人每3～6个月进行1次肝癌筛查[20]。由于缺乏特异的临床症状和有效的筛查方式，高比例的HCC患者被发现时已进入晚期。但肝癌是一种进展迅速的癌症，确诊后的1年生存率仅为36%[21]。因此，探索一种既经济又方便，对患者和医务人员都适用的肝癌筛查方法就显得尤为重要。
在本研究中，AFP和ORM1被发现是HBV相关肝癌的潜在唾液标志物。唾液AFP联合唾液ORM1对肝癌的诊断效果优于血清AFP。虽然已有关于肝癌唾液蛋白质组学的研究，但本研究涉及HCC与LC、CHB和健康人比较，最终发现不同的肝癌唾液标志物[22]。
AFP是妊娠期间在胎儿卵黄囊和肝脏中合成的一种糖蛋白[23]。在HCC患者中，AFP可被重新激活参与肝癌发病机制的调控和化学治疗敏感度的调控，是肝癌的经典标志物[24，25]。AFP仍然是临床实践中最广泛使用的标记物，尽管新的和较为可靠的标记物已经被开发出来[26]。临界值为20ng/ml时，血清AFP诊断肝细胞癌的敏感度为40%～60%，特异度为80%～90%。血清AFP诊断乙型肝炎相关肝癌的敏感度为68%～87%，特异度为74%～90%。通过相关性分析，我们发现唾液AFP与血液AFP具有显著的相关性，唾液AFP的表达水平可以间接反映血液AFP的水平，这与之前的研究一致[9]。然而，在一些LC和慢性病毒性肝炎患者中，AFP也可能升高。ORM1是脂质蛋白家族成员之一，也被称为急性期蛋白，可以在炎症损伤、炎症、感染和其他应激条件下表达。ORM1可诱导肝损伤，激活肝细胞周期，实现肝再生。研究结果表明，尿和血清ORM1可作为膀胱癌、肺鳞状细胞癌、乳腺癌和肝细胞癌的诊断和预后的生物标志物。ORM1在AFP阴性的HCC患者中的敏感度和特异度分别为82%和90%，在AFP升高的HCC患者中的敏感度和特异度分别为62%和82%。血清AFP和ORM1联合诊断HCC的敏感度和特异度分别为85%～89%和83%～90%。目前，ORM1作为标志物在HCC诊断研究仅限于血液和尿液，本研究首次将唾液中的ORM1作为HCC的生物标志物。
这项研究也存在一些不足；首先，本研究纳入的受试者数量较少，还需要进一步研究扩大样本量来检验我们的实验结果；其次，本研究纳入的HCC患者的病因为HBV感染，其他病因引起的HCC还有待进一步研究。当然，唾液检测也受口腔疾病的影响，在某些情况下不能替代血液检测。
引用本文：
卢燕辉，卢秋燕，颜治云，等.乙型肝炎相关肝癌在唾液中生物学标志物的研究与探索[J].中华肝脏病杂志，2023,31（5）:495-503.DOI:10.3760/cma.j.cn501113-20230210-00047.
作者贡献声明
卢燕辉、卢秋燕：实施研究，采集数据，分析解释数据和撰写文章；颜治云：收集数据；徐成润：实验设计，对文章内容作批判性审阅及指导性贡献
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
Funding Statement
基金项目：厦门大学附属东南医院青年苗圃基金（20YQ011）
Fund program: Youth Nursery Fund of Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University(20YQ011)
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