TRB3对人肝癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响

Abstract

Objective

To explore the regulatory role and mechanism of tribbles pseudokinase 3 (TRB3) on hepatocarcinoma (HCC) cells proliferation, apoptosis and migration.

Methods

Immunohistochemistry and Western blot were used to detect TRB3 expression in cancerous and adjacent cancerous liver tissues of HCC patients. TRB3 expression was detected in vitro in HepG2 and Huh7 hepatocarcinoma celllines. Simultaneously, CCK8 and EdU were used to detect cell proliferation after TRB3 targeted inhibition with small interfering RNA. CCK8 and EdU were used to detect cellproliferation. Flow cytometry assay was used to detect apoptosis. Transwell assay was used to evaluate migration ability. Simultaneously, Western blot was used to detect changes in apoptosis, migration-related proteins and AKT phosphorylation activity. The mean comparison between the two groups was performed by t-test, and the comparison between multiple groups was performed by one-way analysis of variance.

Results

Western blot showed that the expression of TRB3 was significantly up-regulated in HCC tissues. Compared with normalliver tissues adjacent to cancer,the relative expression levels were 0.78 ±0.12 and 0.29 ±0.09, respectively, P＜0.01, and the difference was statistically significant. After interfering siRNAinhibited TRB3, CCK8 and EdU tests showed that the proliferation activity of HepG2 and Huh7 cells were significantly weakened (P＜0.05). Flow cytometry results showed that the apoptotic proportions of HepG2 and Huh7 cells was significantly increased (P＜0.01). Western blot also showed that the expression of apoptosis regulatory proteins BAX and BIM were significantly increased (P＜0.01). Transwell assay results showed that the migration ability of HepG2 and Huh7 cells was decreased (P＜0.05), and the expression of migration regulatory proteins MMP4 and MMP9 was also significantly down-regulated. Western blot results showed that the AKT phosphorylation level was significantly increased.

Conclusion

TRB3 regulates hepatocarcinoma cells proliferation, apoptosis and migration by inhibiting the AKT phosphorylation activity. Therefore, TRB3 may be a potential target site for the liver cancer treatment.

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是由肝细胞发展而来的一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤^[1]。流行病学调查显示，肝癌已成为全球第三大肿瘤死亡原因，也是我国第二大肿瘤致死病因^[2]。由于我国乙型肝炎患者人数众多，每年约有38.3万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的50%^[3]。随着医学技术的进步，肝癌的治疗方法多种多样，如手术切除、肝移植、化疗、介入治疗等，大大提高了肝癌患者的生存率。然而，肝癌首次诊断时转移率高，导致肝癌总体生存率极为低下^[4]。因此，迫切需要探索肝癌进展的新的分子机制，以探索更多肝癌的治疗靶点，为肝癌的诊断和治疗提供新的方向。

毛球族同源蛋白3（tribbles homolog 3, TRB3）是tribbles家族中的假性激酶。研究发现，乳腺癌和结直肠癌患者中TRB3表达增加，且与总体生存率负性相关^[5]；最近研究表明，TRB3通过介导内质网应激与AKT信号通路逆转肝癌细胞的化疗耐药性^[6]；在肺癌的研究中表明，TRB3作为一种应激和代谢传感器，通过与SMAD3信号分子相互作用，在转化生长因子β1（TGF-β1）介导的肿瘤侵袭和迁移中发挥重要作用^[7]。最新研究还发现，在肝脏肿瘤细胞的研究中发现，胞质中的TRB3可以和AKT直接结合并抑制其磷酸化，从而调节细胞的增殖、分化、迁移等生物学行^[8]。但是，目前关于TRB3在调控人肝癌细胞增殖、凋亡、迁移的机制并无统一意见。本研究旨在通过探讨TRB3对人肝癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及潜在机制，为进一步阐明肝癌进展的病理生理过程提供实验依据，为肝癌的临床精准靶向治疗提供新的治疗思路和策略。

材料和方法

1.实验材料：二甲基亚砜、EdU、胎牛血清、DMEM培养基、抗体：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase, Akt）、p-Akt、Bax、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、基质金属蛋白酶-4（matrix metalloproteinase-4, MMP-4）、MMP-9、甘油三醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、SP试剂盒和DAB试剂盒、TRIzol、逆转录试剂盒、小干扰RNA-TRB3（small interfering RNA-TRB3, si-TRB3）以及对照组si-NC、Transwell培养板、免疫组织化学及免疫荧光试剂盒。

2.组织标本来源及人肝癌细胞系的培养：本研究由湖北民族大学伦理委员会和湖北民族大学附属民大医院伦理委员批准（伦理学批件号：2016HBMY10236）。所有的标本均来自于2017年4月-2018年4月在湖北民族大学附属民大医院进行肝癌手术切除的患者，术前未进行任何形式的化疗和/或放疗。共获得16例肝癌组织标本和匹配的非肿瘤正常组织标本。所有患者或家属均签署书面知情同意。

人肝癌细胞系HepG2和Huh7按实验室规范，常规培养。

3.细胞转染：购买广州Ribobio公司合成的3条特异靶向TRB3小干扰siRNA。细胞转染按照Lipofectamine 2000（购自美国Invitrogen公司）说明书进行。使用的siRNA序列为：si-TRB3（5′-CGAGCUCGAAGUGGGCCCC-3′）；si-NC（5′-GCGCGCUUUGUAGGAUUCG-3′)。

4.免疫组织化学：组织固定包埋后，切取为4μm石蜡切片，然后脱蜡、抗原修复，随后加入TRB3抗体（1∶100），孵育过夜。第二天，加入第二抗体，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，加入DAB溶液，显色，苏木精复染，自来水冲洗返蓝。在倒置显微镜下，随机选取5个视野，每个视野（×400），然后通过Image Pro 6.0软件进行半定量分析。

5.CCK8实验：细胞接种于96孔板中，24h后转染si-TRB3或si-NC。然后分别培养细胞培养48、72h。加入CCK-8染色剂，常温避光孵育1h。放入酶标仪中获取450nm处的吸光度（A）值，然后统计分析。

6.EdU细胞荧光染色检测：细胞种植于96孔板中，24h后转染si-TRB3或si-NC。4%多聚甲醛固定30min后，使用0.2%Triton X-100破膜，加入Apollo^TM 567，然后再加入Hoeschst 33342反染。

7.蛋白质印迹法（Western blot）检测：细胞干预后，收取细胞，并按照比例加入细胞裂解液。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），第一抗体配比浓度：Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶800)、Bax（1∶2000)、Bcl-2（1∶800)、MMP4（1∶1000）、MMP9（1∶800）、GAPDH4（1∶3000）下，4℃孵育过夜，孵育第二抗体（1∶4000）1h，使用Image-J分析软件分析吸光度值的变化。

8.流式细胞学检测：使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡。在6孔板中培养过夜后，取细胞，离心，洗涤，按照标准方案与Annexin V-FITC/PI孵育。最后，用简易细胞仪检测和分析细胞凋亡。

9.跨膜迁移实验：在Transwell上室加入预处理的肝癌细胞（1×10⁴个），培养24h后置入90%乙醇中固定10min，结晶紫染色10min，流水冲洗，取下滤膜，在显微镜下随机选择视野，照相并计数迁移到滤膜下面的肿瘤细胞。

10.统计学方法：结果采用GraphPad Prism 5统计软件处理，每组实验重复3次，数值用均数±标准差（±s）表示，多组间比较分析用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

1.TRB3在肝癌组织中表达增加：免疫组织化学检测，TRB3在肝癌组织中的表达显著上调，与癌旁正常肝组织相比，其蛋白相对表达水平分别为0.64±0.13对比0.17±0.07,P＜0.05，差异有统计学意义。W estern blot检测验证，与正常肝组织（0.29±0.09）比较，肝癌中TRB3的表达（0.78±0.12）显著增加（P＜0.01），差异有统计学意义（图1）。

图1. TRB3在肝癌组织中表达增加.

注：A：免疫组织化学检测TRB3在正常肝组织和肝癌组织中的表达；B：W estern blot分析TRB3在正常肝组织及肝癌组织中的表达；C：图B的定量分析数据（n=3）；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01；TRB3：假性蛋白激酶毛球族同源蛋白3；GAPDH：甘油三醛-3-磷酸脱氢酶

2.TRB3参与肝癌细胞HepG2和Huh7的增殖：在细胞水平探究TRB3对肝癌细胞生物学行为的影响。用RT-PCR检验正常肝细胞HL7702以及肝癌细胞HepG2和Huh7中TRB3的表达，如图2A所示，与正常肝脏细胞HL7702细胞相比，HepG2和Huh7中TRB3的mRNA相对表达水平分别为3.72±0.74、4.36±0.63，P＜0.05，其中以Huh7细胞系最为显著（P＜0.01）。构建si-TRB3在蛋白水平进行了验证（图2B），CCK8增殖实验结果表明：si-TRB3下调TRB3，显著抑制肝癌细胞HepG2和H uh7的增殖（抑制前分别为1.22±0.14、1.42±0.11，si-TRB3转染72h后增殖活性为0.64±0.13、0.81±0.16，P值均＜0.01，差异均有统计学意义），见图2C～D。EdU检测同样发现，si-TRB3转染后，HepG2和H uh7的增殖明显减少（抑制前EdU阳性率分别为0.62±0.14、0.71±0.19，si-TRB3转染72h后分别为0.17±0.13、0.22±0.16，P值均＜0.05，差异均有统计学意义），见图3。

图2. TRB3参与肝癌细胞HepG2和Huh7的增殖.

注：A：RT-PCR检测TRB3相对表达量；B：细胞转染si-TRB3或si-NC后检测小干扰的抑制效率；C：抑制TRB3后对HepG2细胞增殖活性的影响；D：抑制TRB3后对Huh7细胞增殖活性的影响（n=3）；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01；TRB3：假性蛋白激酶毛球族同源蛋白3；GAPDH：甘油三醛-3-磷酸脱氢酶；si-TRB3：携带抑制TRB3的小干扰RNA组；si-NC：小干扰对照组

图3. EdU实验结果显示阻断TRB3后，HepG2和Huh7细胞的增殖减低（n=3）.

注：TRB3：假性蛋白激酶毛球族同源蛋白3；DAPI：细胞核染料；EdU：增殖荧光染料；Merged：图像合并；si-TRB3：携带抑制TRB3的小干扰RNA组；si-NC：小干扰对照组

3.抑制TRB3可促进HepG2和H uh7细胞的凋亡：促进肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤进展的有效方式^[9]。抑制TRB3是否也可以调控肝癌细胞的凋亡，目前尚不明确。通过流式细胞术检测发现，抑制TRB3后，si-TRB3组与si-NC对照组相比，HepG2和H uh7的凋亡细胞数明显增加（凋亡细胞率分别为0.16±0.02和0.17±0.04，P＜0.05）（图4A～B）。此外，还检测了凋亡相关蛋白的表达。HepG2细胞中，si-TRB3组与si-NC对照组相比，促进凋亡相关蛋白Bax、Bim相对表达水平明显增高（Bax蛋白相对表达水平：0.16±0.08对比0.78±0.14，P＜0.01；Bim：0.19±0.13对比0.69±0.15，P＜0.01），差异均有统计学意义。Huh7细胞中，si-TRB3组与si-NC对照组相比，促进凋亡相关蛋白Bax、Bim相对表达水平明显增高（Bax蛋白相对表达水平：0.23±0.09对比1.02±0.22，P＜0.01；Bim蛋白相对表达水平：0.34±0.11对比0.94±0.29，P＜0.01），差异均有统计学意义，见图4C～E。

图4. 抑制TRB3后显著促进HepG2和Huh7细胞的凋亡.

注：A：代表性的碘化丙啶（PI）（Y轴）和Annexin v-荧光素异硫氰酸酯（FITC）（X轴）流式细胞术散点图；B：3次独立流式细胞术实验平均定量数据；C：Western blot分析Bax、Bim的表达；D～E：图C的定量数据分析（n=3）；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01；TRB3：假性蛋白激酶毛球族同源蛋白3；GAPDH：甘油三醛-3-磷酸脱氢酶；BAX、Bim：凋亡相关蛋白；si-TRB3：携带抑制TRB3的小干扰RNA组；si-NC：小干扰对照组

4.下调TRB3可抑制HepG2和Huh7细胞的迁移：迁移是恶性细胞的标志，也是肿瘤转移和扩散的基础。抑制肿瘤细胞的迁移是有效治疗肿瘤的基石^[10]。通过Transwell实验，如图5A～B所示，下调TRB3后，si-TRB3组与si-NC对照组相比，HepG2细胞迁移数分别为198±25和87±39，P＜0.05；Huh7细胞迁移数分别为204±37和94±0.24，P＜0.05。同时，检测抑制TRB3后，对迁移相关蛋白MMP4和MMP9的影响。通过Western blot检测发现，干扰TRB3的表达后，si-TRB3组与si-NC对照组相比，HepG2细胞迁移调控蛋白相对表达水平：MMP4分别为1.01±0.06和0.52±0.11，P＜0.05；MMP9分别为1.53±0.13和0.87±0.11，P＜0.05；Huh7细胞迁移调控蛋白相对表达水平：MMP4分别为1.42±0.14和0.41±0.08，P＜0.01；MMP9分别为1.24±0.31和0.55±0.09，P＜0.01（图5C～YE）。

图5. 抑制TRB3后显著抑制HepG2和Huh7细胞的迁移.

注：A：采用Transwell试验（×200）评估细胞的迁移能力；B：计算膜底表面迁移细胞数量；C：Western blot分析MMP4、MMP9的表达；D～E：图C的定量数据分析（n=3）；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01；TRB3：假性蛋白激酶毛球族同源蛋白3；GAPDH：甘油三醛-3-磷酸脱氢酶；MMP4：基质金属蛋白酶4；si-TRB3：携带抑制TRB3的小干扰RNA组；si-NC：小干扰对照组

5.TRB3可能通过抑制Akt的磷酸化发挥生物学效应：TRB3作为假性激酶通常与Akt直接结合抑制后者磷酸化而发挥生物学效应。有研究^[11]已证实，Akt参与促进肿瘤细胞的增殖、凋亡耐受和促进迁移的调控。为了验证TRB3对Akt活化的影响，用Western blot检测抑制TRB3后Akt活性的变化。抑制TRB3后，si-TRB3组与si-NC对照组相比，HepG2和Huh7细胞的Akt活性（p-Akt）的表达明显上调（HepG2细胞相对表达分别为0.81±0.10和0.39±0.11，P＜0.05；Huh7细胞相对表达分别为0.58±0.06和0.17±0.09，P＜0.01），见图6。

图6. 抑制TRB3后对HepG2和Huh7细胞Akt活化的影响.

注：A：Western blot检测p-Akt/Akt的表达水平；B：图A的定量数据分析（n=3）；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01；TRB3：假性蛋白激酶毛球族同源蛋白3；GAPDH：甘油三醛-3-磷酸脱氢酶；Akt：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；si-TRB3：携带抑制TRB3的小干扰RNA组；si-NC：小干扰对照组

讨论

有研究结果显示，肝癌的高侵袭性、高转移率与肝癌细胞的增殖活性、凋亡耐受、迁移增加密切相关^[12]。因此，从调节肝癌细胞增殖、凋亡、迁移的角度去探究肿瘤细胞活性增加的生物机制，从而为靶向抑制肿瘤细胞的进展提供理论依据。

tribbles基因家族最初在果蝇中被检测，现已被证实在细胞的发育过程中可以调节细胞的增殖、迁移和形态发生^[13]。TRB3是tribbles基因家族中常见的基因，研究表明，与TRB3相互作用的分子包括转录因子，如泛素连接酶和BMP Ⅱ型受体，它们是MAPK和PI3K信号通路的工具分子^[14]；研究还发现，TRB3与SMAD3相互作用，促进肿瘤细胞迁移和侵袭^[15]；越来越多的研究证实，TRB3被认为是多种肿瘤的致癌基因，包括乳腺癌、结直肠癌、口腔舌鳞癌^[16]。因此，TRB3可能是治疗人类肿瘤的潜在治疗靶点。

在本研究中，发现TRB3在肝癌患者癌组织中表达异常丰富，因而推测TRB3可能是促进肝癌恶性进展的致病因素。进一步在肝癌细胞中验证了，TRB3可显著促进肝癌细胞增殖，抑制其凋亡，促进其迁移。依据这些结果推论，TRB3可通过调控肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移从而促进肝癌的进展。然而，遗憾的是，由于标本量较少，观察时间较短，缺乏TRB3的上调与肝癌转移灶增多、复发率高、以及总的生存期是否密切相关的确切数据。这有待于下一步大样本的临床试验研究。

既往研究报道促凋亡因子Bax可增强细胞色素C的释放，激活Caspase 9和Caspase 3执行凋亡程序^[17]；本研究在抑制TRB3的表达后，HepG2和Huh7细胞的凋亡数目增加。更令人欣喜的是，抑制TRB3不仅增加肝癌凋亡细胞数，而且上调Bax和Bim这两种凋亡蛋白的表达。因此，抑制TRB3的表达，不仅仅对肝癌细胞产生形态学上的改变，还启动了肿瘤细胞的凋亡程序。在理论上，这是遏制肝癌进展的理想目标。

转移是肝癌患者死亡的主要原因。因此，寻找有前效的抗转移药物来预防或抑制肝癌的转移至关重要。本研究发现，抑制TRB3能够有效抑制肝癌细胞的迁移能力。此外，肿瘤细胞中MMP4、MMP9表达异常增加，会导致细胞粘附降低，迁移和侵袭增强，从而促进肿瘤进展^[18]。本项目研究的结果显示，抑制TRB3能显著降低MMP4和MMP9的表达，提示靶向抑制TRB3可能是治疗肝癌转移的有效手段。

进一步，本研究探讨了TRB3促进肝癌细胞增殖，抑制凋亡，刺激迁移的深入机制。实验结果表明，抑制TRB3后Akt的活化增加。因此可以推论，TRB3通过抑制Akt的磷酸化发挥促进肝癌细胞增殖，抑制凋亡，刺激迁移的作用。但是，由于本研究实验平台有限，未能进一步增加Akt解救实验，Akt的激活剂能否有效逆转TRB3抑制后的生物学效果，还为未可知。

总之，本研究表明，肝癌患者癌组织中TRB3表达升高。此外，TRB3下调可诱导肝癌细胞增殖减少，凋亡增加，抑制迁移。而这种生物学行为，可能与抑制Akt的磷酸化活性密切相关，这为进一步阐明肝癌的发病机制以及探索新的防治靶点提供了较科学的基础实验依据。因此，TRB3可能是一种潜在的治疗肝癌的靶向位点。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

李俊：实采集数据，分析、解释数据以及起草文章；谭庆丰：行政、技术的支持；黄强：负责对文章的知识性内容作批评性审阅；翟东升：分析数据以及数据质量控制；陈洪流：实验材料以及实验进展的执行；张泽：临床样本的收集；王凤亮：酝酿、设计和指导实验