原发性胆汁性胆管炎关键基因及分子机制的生物信息学分析

Abstract

Objective

To extract the differentially expressed key genes of primary biliary cholangitis（PBC）using bioinformatics methods, so as to provide information for further study into the mechanism.

Methods

The GSE119600 dataset was downloaded from the GEO database to obtain differentially expressed genes. Gene ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analyses were performed for differentially expressed genes. Protein-protein interaction（PPI）network reconstruction, Cytoscape software visualization, and core gene screening were performed. The area under the receiver operating characteristic curve（ROC AUC）was used to assess the diagnostic effectiveness of genes and plot the pROC software package. The x-Cell software was used to calculate the enrichment score of 34 immune cells in each sample. Finally, four key genes（PSMA4, PSMA1, PSMB1, and PSMA3）were selected. Blood samples were analyzed using the qPCR method.

Results:

A total of 373 immune-related differentially expressed genes were identified. Eight genes（PSMC6, PSMB2, PSMB1, PSMA3, PSMA4, PSMA1, PSMD7, and PSMB5）were screened from the 178 nodes and 596 edges as hub genes of the PPI network, which were significantly related to amino acid metabolism, hematopoietic stem cell differentiation, cell cycle, and immune processes. PSMA4, PSMA1, PSMB1, and PSMA3 were defined as immunological biomarkers for PBC with an AUC value of the ROC curve＞0.7. Immunoinfiltrating cell analysis showed that the proportion of eosinophils was significantly higher in PBC patients compared to the control group, whereas the proportion of CD4+ memory T cells, plasma cells, Th2 cells, and cDC cells was significantly lower in PBC patients than the control group. Plasma cells were associated with all four immunological biomarkers. Seven PBC patients and seven healthy subjects were selected for peripheral blood qPCR validation, which demonstrates that PSMB1, PSMA3, PSMA1, and PSMA4 levels were significantly lower in PBC patients than healthy subjects, with a statistically significant difference.

Conclusion:

Bioinformatics screened eight key genes, of which four were key immunological markers and may serve as a basis for clinical diagnosis and mechanism exploration.

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种典型的自身免疫性肝病，男女比例1:10，其特征是肝内破坏性的淋巴细胞性胆管炎，导致胆汁淤积、进行性纤维化，最终导致肝硬化或肝衰竭。目前熊去氧胆酸是一线用药，约有30%～50%患者应答不佳。奥贝胆酸可获得部分应答，但对于肝功能Child-Pugh B级～C级安全性不高；环孢素、皮质醇、霉酚酸酯等其他免疫抑制剂效果均不理想^[1]。抗线粒体自身抗体（anti-mitochondrial autoantibodies，AMA）常被作为PBC的血清学诊断标志，约10%的PBC患者中AMA呈现阴性或者未能被检测到。然而，AMA阳性的人群频率很高（高达1/1000），而PBC患病率较低（高达0.4/1000）^[2]。因此，寻找更加有效的PBC诊断标志物较为重要。同时PBC的发病机制未完全阐明，目前焦点集中在胆管微环境变化所引起的胆汁酸细胞毒性增加和对于胆管上皮细胞的自身免疫反应增强。其中，Th17、Th1和滤泡辅助T淋巴细胞促进PBC的发展；在PBC晚期，产生了大量的免疫相关因子，如白细胞介素（IL）-17、IL-6，这些免疫因子加快了PBC的纤维化进程^{[3, 4]}。探索PBC发生、发展的分子机制亦迫在眉睫。因此，为了深入了解PBC中与免疫相关的潜在因素，本研究主要基于数据集GSE119600中的免疫相关基因（immune-related genes，IRGs）进行分析，通过生物信息学的方法鉴定了关键的免疫标志物，并探索了这些免疫标志物的诊断价值及潜在的分子调控机制。

资料与方法

1.数据来源：本研究通过ImmPort（https://www.immport.org/home）和AmiGO（http://amigo.geneontology.org/amigo/search/bioentity）获得IRGs。从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载数据集GSE119600 PBC及正常样本的转录组测序数据及样本信息。

2.差异IRGs的鉴定：从数据集GSE119600中获取IRGs的表达数据，使用limma包^[5]分析它们在GSE119600的PBC患病和对照样本之间的表达差异，筛选条件为：校正后的P值＜0.05，使用火山图来展示差异表达的基因（differentially expressed genes，DEGs）；用R语言VennDiagram包（版本为1.6.20）对上述获得差异表达的基因及IRGs取交集，获得差异表达的免疫相关基因（differentially expressed immune-related，DE-IRGs），并绘制韦恩图。使用pheatmap包（版本为1.0.12）绘制DE-IRGs Top100的表达热图，以对交集基因的表达趋势进行可视化。

3.功能和通路富集分析：首先本研究使用R语言“clusterProfiler”包（版本为3.18.0）^[6]分别对上调、下调表达的DE-IRGs进行了基于GO及KEGG的富集分析，筛选条件为P＜0.05，计数＞2。并使用enrichplot包（版本为1.10.2）及ggplot2包（版本为3.3.3）绘制条形图对富集结果进行可视化。

4.蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）网络构建，利用在线数据库STRING（https://www.string-db.org/）对DE-IRGs进行PPI网络构建。设置置信度为0.95，去除离散蛋白，得到基因与基因的互作关系，并将互作关系网络导入Cytoscape进行美化。使用Cytoscape（版本为3.8.2）的cytoHubba插件对网络进行分析，利用MCC、MNC、DMNC 3种算法筛选hub基因，取3种算法Top10基因交集，结果获得的hub基因。

5.关键免疫标志物的筛选：再次使用R语言“clusterProfiler”（版本为3.18.0）对上述获得的hub基因进行了基于GO及KEGG的富集分析，筛选条件为P＜0.05。并使用enrichplot包（版本为1.10.2）绘制条形图及气泡图对富集结果进行可视化。本研究对上述获得的hub基因的诊断价值进行评估，使用R语言pROC包（版本为1.17.0.1）^[7]绘制单基因的受试者操作特征曲线，受试者操作特征曲线下面积值＞0.7者被当作关键免疫标志物进行后续分析。

6.关键免疫标志物与免疫细胞的关系：对免疫细胞在正常组及PBC组之间的差异进行秩和检验，并使用R语言ggpubr（版本为0.4.0）及ggplot2（版本为3.3.3）包绘制箱线图进行可视化；再通过x Cell^[8]（https://xcell.ucsf.edu/）对GSE119600的PBC样本和对照样本中34种免疫细胞比例进行计算。使用R语言pheatmap包（版本为1.0.12）绘制热图对差异免疫细胞的比例进行可视化。对差异的免疫细胞及关键免疫标志物进行了批量的Pearson相关性分析，并使用R语言ggplot2包（版本为3.3.3）绘制了相关性热图。

7.差异基因验证：本研究筛选临床外周血全血样本验证的代表性差异基因。选择江苏省中医院肝病门诊PBC患者7例及健康体检者7名，采集静脉血标本。采用qPCR法对具有代表性的差异基因外周血标本进行检测和比较。本研究中涉及人类参与者的所有程序均符合《赫尔辛基宣言》（2013年修订）。本研究经江苏省中医院伦理委员会批准（批件号2021NL-101-03），并在所有患者中取得知情同意。

8.统计学方法：所有分析均采用R编程语言进行，不同组数据比较采用Wilcoxon检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.DE-IRGs的鉴定：ImmPort数据库，下载获得1793个IRGs；AmiGO筛选后获得3279个IRGs。两数据库获得基因取并集，并去重后，共获得4004个IRGs；GSE119600测序平台为“GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip”，包含90个PBC样本，47个正常样本。在PBC/正常样本之间共存在1797个DEs，其中1107个基因在PBC样本中上调表达，690个基因在PBC样本中下调表达，见图1A。通过1797个DEGs和4004个IRGs取交集，得到PBC和对照样品之间的373个DE-IRGs，见图1B。其中，290个上调表达，83个下调表达。再对Top 100的交集基因的表达趋势进行可视化，结果见图1C。

图1. 差异表达的基因分析.

注：A：对照样本与原发性胆汁性胆管炎样本差异表达基因的火山图；B：IRGS与DEGs的维恩图；C：DE-IRGs热图；红色表示上调基因，蓝色表示下调基因

2.DE-IRGs功能富集分析：（1）上调的DE-IRGs功能：GO富集分析结果显示，在生物过程方面，共获得1195个条目，上调的IRGs与细胞-细胞黏附调节、白细胞活化的正调控、先天免疫反映的正调节、生物刺激反应的调节等显著相关；在细胞组成方面，共获得94个条目，与液泡膜、初级溶酶体、吞噬泡膜、溶解酶泡膜等显著相关；在分子功能方面，共获得53个条目，与脱氧核糖核酸-转录因子结合、肾上腺素受体结合、磷酸酶结合、泛素类蛋白连接酶结合等显著相关。见图2A。KEGG富集分析，得到87条相关通路，我们使用条形图对Top20通路进行展示，一些细菌感染、NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路、B淋巴细胞受体信号通路等通路与上调表达的IRGs显著相关，见图2B。（2）下调的DE-IRGs功能：GO富集结果进行展示，在生物过程方面，共获得177个条目，下调的IRGs与造血干细胞分化的调控、造血祖细胞分化的调控、细胞氨基酸代谢过程的调控、抗原加工及呈递等显著相关；在细胞组成方面，共获得19个条目与核糖核蛋白颗粒、蛋白酶体辅助复合物、肽酶复合物、蛋白酶体复合物；在分子功能方面，共获得6个条目，与氧化还原酶活性、抗氧化活性、胞苷脱氢酶等显著相关。见图2C。KEGG功能富集分析，得到11条相关通路，我们使用条形图对这些通路进行展示，一些神经退行性变的途径、加压素调节的水重吸收、病毒感染等通路与下调表达的IRGs显著相关，见图2D。

图2. 差异基因的GO及KEGG富集分析.

注：A：上调DEIRGs基因本体（GO）富集分析，纵坐标表示GO条目横标表示IRGs的数量；B：上DERGs的京都基因和基因组百科全书KEGG）通路富集分析；纵坐标表示KEGG通路，横坐标表示IRGs的数量；C：下调DE-RGs的GO富集分析，D：下调DE-IRGs的KEGG通路富集分析

3.DE-IRGs的PPI网络：对上述373个DE-IRGs进行PPI网络构建，得到178个基因基因的互作关系，包括 178个节点，596条边，见图3A。接着，用MCC、MNC、DMNC 3种算法筛选hub基因，见图3B。取 3种算法Top10基因取交集，共获得8个hub基因，见图3C。hub基因为PSMC6、PSMB2、PSMB1、PSMA3、PSMA4、PSMA1、PSMD7、PSMB5。

图3. DE-IRGs蛋白相互作用及关键模块.

注：A：DE-IRGs蛋白-蛋白相作用PPD网络图，线条表示各基因之间的相作用；B：DMNC、MCC、MNC 3种算法hub基网络图；C：DMNC、MCC、MNC 3种算法hub基因的交集；绿色代表MNC，蓝色代表DMNC，粉色代表MCC

4.关键免疫标志物筛选：对上述8个hub基因进行了基于GO及KEGG的富集分析。8个hub基因没有在KEGG通路上显著富集。GO富集分析：在生物过程方面，共获得110个条目，hub基因与细胞氨基酸代谢过程的调控、造血干细胞分化的调控、依赖复杂过程的分解代谢等显著相关；在细胞组成方面，共获得15个条目，hub基因与肽酶复合物、蛋白酶复合物、蛋白酶体调节颗粒等显著相关；在分子功能方面，共获得5个条目，与脂多糖结合、异肽酶活性、苏氨酸型肽酶活性等显著相关见图4A。对8个hub基因的诊断价值进行评估，见图4B。PSMA4、PSMA1、PSMB1、PSMA3的AUC值＞0.7，因此被当作关键免疫标志物。

图4. hub基因功能及诊断价值分析.

注：A：hb基因的GO富气泡图。纵坐标表示富集的GO条目，气泡大小表示该GO条目富集到DE-IRGs的个数颜色从蓝到红表示结果的可信度从低到高；B：ROC曲线对交集基因诊断价值评估；AUC指ROC曲线下的表面积；ROC：受试者操作特征曲线

5.关键免疫标志物与免疫细胞的关系：（1）免疫细胞比例：本研究对免疫细胞在正常组及PBC组之间的差异绘制的箱线图见图5A。CD4⁺记忆T淋巴细胞，嗜酸性粒细胞，浆细胞，Th2细胞和经典树突细胞，共5种免疫细胞在PBC样本及正常样本之间差异有统计学意义（P＜0.05）。根据xCell计算得到每种免疫细胞在各个样本中所占的比例，绘制热图见图5B。（2）关键免疫标志物与免疫细胞的关系：对5个差异的免疫细胞及4个关键免疫标志物的Pearson相关性分析，绘制热图见图5C。嗜酸性粒细胞与关键免疫标志物之间存在显著的负相关关系；而CD4⁺记忆T淋巴细胞、浆细胞、Th2细胞、经典树突细胞与关键免疫标志物存在显著的正相关关系。浆细胞与PSMB1、PSMA3、PSMA4、PSMA1均存在较强的正相关关系。

图5. 关键免疫标志物与免疫细胞的关系.

注：A：免疫细胞比例的箱线图，红色代表PBC样本；蓝色代表正常样本，^a：P＜0.05；^b：P＜0.01；^c：P＜0.001；^d：P＜0.0001；B：差异免疫细胞在样本中的比例热图；C：关键免疫标志物与差异免疫细胞的相关性热图；红代表正相关，蓝色代表负相关；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01

6.关键基因临床样本验证：通过生物信息学方法及查阅文献，选择PSMB1、PSMA3、PSMA1、PSMA4作为代表性差异基因进行外周血样本验证。qPCR结果显示，7例PBC患者外周血PSMB1、PSMA3、PSMA1、PSMA4水平显著低于健康人，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图6。

图6. 原发性胆汁性胆管炎患者与健康者外周血hub基因水平的比较.

注：纵坐标表示基因水平、横坐标表示受试者；^a：P＜0.05；^b：P＜0.01

讨论

根据2009年美国肝病研究协会诊断标准，存在胆汁淤积生物化学证据（碱性磷酸酶升高）、AMA阳性、组织上表现非化脓性破坏性胆管炎三者满足两项者可诊断^[9]。可见AMA阳性并非必要条件。今年来虽研究者发现抗核包膜蛋白gp210抗体以及抗核蛋白spl00抗体对PBC有高度的特异性（＞95%），但敏感性低。同时，关于PBC的发病机制主要集中在HLA-限制性、IL12-IFNγ驱动、免疫介导的淋巴细胞胆管炎以及胆管上皮细胞损伤反应^[10]，尤其是免疫相关的机制仍未完全阐明。

本研究筛选出373个DE-IRGs，其中290个上调表达，83个下调表达。GO富集显示，上调的DE-IRGs多与T淋巴细胞活化、细胞调节-细胞黏附、泛素类蛋白连接酶结合等。下调多与造血干细胞分化的调控、氨基酸代谢、抗体提呈处理有关。而KEGG富集显示，上调基因与一些细菌感染、趋化因子信号通路、Th17分化通路相关。下调基因主要富集于蛋白酶体、一些神经退行性病变的途径等通路。细菌感染，特别是大肠杆菌或芳香杆菌感染，可能通过人与细菌间的PDC-E2分子模拟从而触发PBC ^[11]。Varyani等^[12]通过病例对照研究观察到，诊断前1年内发生尿路感染、诊断前5年内发生肾盂肾炎与PBC发病有强相关性。Millar等^[13]通过对PBC血清蛋白组学分析，在未经治疗的PBC组的一个重要组成部分，甚至在熊去氧胆酸之后仍然存在，是一个趋化因子网络（CCL20，CCL19，CXCL9，CXCL10，CXCL11和CXCL13）。因此，特定趋化因子可能成为高危疾病的预测生物标志。

PPI网络筛选出8个hub基因，其中PSMB1、PSMB2、PSMB5、PSMA1、PSMA3、PSMA4均为20S蛋白酶体亚基，PSMC6、PSMD7为26S蛋白酶体亚基，表明蛋白酶体尤其是20S蛋白酶体在PBC的发病中发挥作用。20S蛋白酶体（20S proteasome）是一种保守的降解机制，对于维持细胞内稳态至关重要。在正常情况下，组成20S蛋白酶体降解细胞中错误折叠和不必要的蛋白质，降解产物可能用于氨基酸回收。在炎症的发展过程中，蛋白酶体还通过抑制蛋白IκB的蛋白水解或核因子κB（nuclear factor -κB，NF-κB）前体加工成成熟形式NF-κB，这是调节免疫反应的关键蛋白^[14]。目前关于蛋白酶体在自身免疫性疾病中作用研究较少。Bakutenko等^[15]从自身免疫性肝炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等患者血清中发现循环蛋白酶体水平显著升高，提示其与疾病活动有关。本研究纳入7例PBC患者及7名健康人外周血qPCR验证，PSMB1、PSMA3、PSMA1、PSMA4水平显著低于健康人，差异有统计学意义，与数据库生物信息结果一致。同时，4个hub基因与浆细胞、CD4⁺记忆T淋巴细胞关系最为密切。为减少浆细胞AMA的产生、改善线粒体功能障碍，B淋巴细胞耗竭疗法被提出^[16]。Khanna等^[17]纳入57例伴有中重度疲劳症状的PBC患者，利妥昔单抗对熊去氧胆酸有反应的早期疾病阶段队列中的碱性磷酸酶水平具有有益作用，但无改善PBC疲劳的有效证据。因此，识别潜在的生物标志物对探索药物靶点似乎意义重大。

本研究也有一定局限性，基于公共数据库的分析还需要独立的体外实验结果来证实或进一步探索其临床实用性。总之，本研究共鉴定出373个差异表达基因，包括在nod样受体信号通路、趋化因子信号通路等通路中富集的基因。8个中心基因与维持细胞内稳态的蛋白酶体相关。所有4种免疫生物标志物都与浆细胞相关。以上均为更好地探索PBC发病机制提供思路。

引用本文：

陈沁磊，乔飞，陆玮婷，等.原发性胆汁性胆管炎关键基因及分子机制的生物信息学分析[J].中华肝脏病杂志，2023，31（11）: 1209-1216.DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20220315-00110.

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

陈沁磊、周春祥：实验设计及实施，采集分析数据，起草文章，统计分析；乔飞、陆玮婷、史会连：对文章的知识性内容作批评性审阅，行政、技术或材料支持，支持性贡献。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（82074504）

Fund program: National Natural Science Foundation（82074504）