Hippo信号通路在肝癌形成中作用的研究进展

Abstract

The Hippo signaling pathway consists of four core components in mammals, i.e., Mst1/2, WW45, Mob1, and LATS1/2, which can inhibit the transcriptional coactivator YAP from entering the nucleus, maintain the balance between cell proliferation and apoptosis, control organ size, and maintain homeostasis. If the core components of the Hippo signaling pathway are inactivated due to gene mutation or epigenetic alterations, YAP is overexpressed and activated in the nucleus, which then induces excessive cell proliferation and inhibits cell apoptosis. It has been confirmed that this process is closely associated with the formation of various tumors including liver cancer. Research on the Hippo signaling pathway may provide new directions for exploring the pathogenesis of liver tumor and developing effective therapies.

Hippo信号通路是近些年发现并研究的一条具有维持细胞增殖与凋亡平衡、控制器官大小、维持内环境稳定功能的信号通路，它在胚胎正常生长发育^[1]、修复受损组织器官等方面有重要意义^[2]。Yes相关蛋白（yes-associated protein, YAP/Yap）是Hippo信号通路的效应因子，它作为转录辅激活因子活化后可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。随着对这条通路研究的深入，许多学者发现Yes相关蛋白的过度活化与包括肝癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展有密切关系^[3]。而Hippo信号通路对YAP活化具有抑制作用，因此被认为是一条具有潜力的抑癌通路。我们着重就Hippo信号通路在肝脏肿瘤发生发展过程中起到的作用进行综述。

一、Hippo信号通路概述

Hippo信号通路最初是在果蝇属中发现的一条与控制细胞增殖生长、凋亡及器官大小相关的长信号保守通路。自上世纪90年代Hippo通路的4个核心组件Warts（Wts）,Salvador(Sav),Hippo（Hpo）,Mob as tumour suppressor（Mats）被逐一发现^{[4，5，6，7]}。Yorkie（Yki）是用Wts筛选与之相互作用的蛋白质时发现的转录辅激活因子，它是果蝇Hippo通路的效应因子，在细胞核中可以与转录因子Scalloped（Sd）结合而实现其生物学作用^[8]。当Yki在细胞核中过度表达时呈现细胞过度增殖，凋亡障碍，组织过度生长的态势；相反，如果因为基因突变等原因使Yki活性丧失，则减少细胞增殖，加速细胞凋亡，导致组织萎缩^[9]。许多研究结果已表明果蝇Hippo通路对Yki具有负性调节作用，该通路的核心组件之间会发生一系列激酶连锁反应，首先Hpo连接Sav形成复合体，以促进Hpo磷酸化Wts并使Wts活化，同时Hpo也可以磷酸化Mats以增强它活化Wts的能力。活化后的Wts可以磷酸化Yki，使它在细胞质内与14-3-3蛋白结合，阻碍Yki进入细胞核，从而减少在细胞核内发挥生物学作用的Yki，以控制细胞生长增殖，进而控制组织器官的大小^[10]。

果蝇Hippo信号通路的发现为后续该通路在哺乳动物体内的研究奠定了基础。小鼠等哺乳动物与果蝇Hippo通路中的组件有对应的同源体（表1）。果蝇Hippo信号通路中的核心组件Hpo、Sav、Wts和Mats分别对应哺乳动物STE20样蛋白激酶家族1/2（Mst1/2），Salvador 1（Sav1，又被称为WW45），大肿瘤抑制基因1/2（Lats1/2）激酶和MOB kinase activator 1a/1b（Mob1a/1b）。哺乳动物体内Hippo通路的活化过程与果蝇类似，最终抑制的转录辅激活因子在哺乳动物中目前发现有2个，分别是Yes相关蛋白和PDZ-binding motif（TAZ）^[11]。该通路的活化受上游包括Fat（Ft）、Dachsous(Ds)、Four-jointed（Fj）、Expanded/Kibra/Merlin复合体（Ex/Kibra/Mer）在内的多个因子调节^{[12，13，14]}。Moroishi等^[15]还发现小鼠Hippo信号通路中Yap与Lats1/2之间可以形成负反馈调节回路来进行自我调节。

表1. Hippo信号通路组件在果蝇、小鼠、人类中的同源体名称（括号中为缩略形式）.

果蝇	小鼠	人
Hippo	mammalian sterile 20-like kinase 1/2	Mammalian sterile 20-like kinase 1/2
（Hpo/dMst）	（Mst1,Mst2）	（Mst1/STK4,Mst2/STK3）
Salvador（Sav）	Salvador（WW45/Sav1）	Salvador（hWW45/SAV1）
Warts（Wts）	large tumor suppressor homolog1/2（Lats1, Lats2）	Large tumor suppressor homolog1/2（LATS1,LATS2）
Mob as tumor suppressor（Mats）	Mob kinase activator1a/1b（Mob1a, Mob1b）	MOB kinase activator1A/1B（MOBKL1A, MOBKL1B）
Yorkie（Yki）	Yap, TAZ	YAP, TAZ
Scalloped（Sd）	Tead/Tef1-Tef4	TEAD1-TEAD4

注：此表格目的是为了便于读者了解Hippo信号通路组件在不同物种中的名称

二、Hippo信号通路与肝癌形成

1.Hippo信号通路与肝脏再生：哺乳动物的肝脏具有非常强大的再生能力。70%的肝组织切除也能在几天之内通过余下肝脏组织细胞增生来恢复。成人肝脏细胞约180～400d更新1次，这意味着肝脏细胞1年仅增殖分化1～2次，大部分时间处于静止状态^[16]。Hippo通路的失活、YAP过度表达及活化是肝脏再生过程的关键^[17]。Grijalva等^[18]在应用已切除70%肝脏的小鼠模型观察肝细胞增殖期间Hippo信号通路的变化和Yap的活化情况的研究中发现，细胞核内的Yap活化水平及其靶基因的表达在肝脏切除24h内会增加，在肝细胞再生启动之前，Yap活化水平会持续升高72h，Hippo通路中的核心组件Mst1/2活化水平在肝脏切除后的第1天是下降的，Lats1/2及Mob1在切除后的3d内活化水平都是下降的。余下的30%小鼠肝脏大概在7d内恢复至正常大小，这时细胞核内Yap及其靶基因的表达水平会回到基础水平，而Mst1/2活化水平也恢复到在静止肝脏中观察到的水平。Hippo信号通路和Yap的活化水平动态变化的规律可以一定程度上解释肝脏细胞增殖分化与静止之间的动态平衡及如何维持肝脏在体内的正常大小。

2.YAP在肝癌组织中表达、活化及预测作用：Zhao等^[19]用免疫组织化学染色的方法估计YAP在正常人肝细胞及肝癌细胞中的表达情况，他们发现在115例肝癌病例中有63例（54%）显示明显的YAP染色表达，而95%的正常肝细胞中只会显示出非常弱的表达，说明在正常肝组织细胞和肝癌组织中，YAP蛋白的表达水平有明显的不同。Xu等^[20]对177例临床和病理都诊断肝细胞癌并接受肝癌切除术的患者的癌组织及癌旁正常组织，应用免疫组织化学、蛋白免疫印迹、定量聚合酶链反应等方法测定YAP的表达，发现YAP在62%肝癌病例中都显著表达，且YAP主要集中在肿瘤的核心位置表达。并且发现肝癌组织中YAP的过度表达与肿瘤的低分化程度及血清高甲胎蛋白水平有显著相关性。这些研究都证明肝细胞癌中确实有YAP的异常表达，也说明YAP表达水平与肝癌形成有着密切关系。Xu等还发现在接受肝癌切除术后，肝癌组织中YAP表达阴性患者5年生存率为58%，而YAP表达阳性的患者的5年生存率只有36%；YAP阴性的患者的无瘤生存中位时间是27.1个月，而YAP阳性的患者的无瘤生存中位时间只有14.5个月，他们认为YAP的表达水平是肝癌患者接受肝癌切除术后总生存时间及无瘤生存率的独立预测因素。这个结论在Li等^[21]的研究中也得到了证实，他们对105例行肝脏移植术的原发性肝癌患者的数据进行回顾性分析，发现肝癌组织中YAP表达阴性的患者肝移植术后无病生存率要明显高于YAP在肝癌组织中表达阳性的患者，多因素COX回归分析结果显示YAP在肝癌组织中的表达是肝细胞癌患者肝移植术后无瘤生存率的独立预测因素。

3.Hippo信号通路各组件表达水平与肝癌形成：YAP在细胞恶性增殖和逃避凋亡的过程中发挥着关键作用。Hippo信号通路可以抑制YAP活性，但是在肿瘤的发生过程中会出现失常，已有研究结果显示Hippo信号通路核心组件或上游因子出现突变或功能障碍与肿瘤的发生、形成相关。Lu等^[22]在Mst1/2功能均失活的突变小鼠模型中观察到，在小鼠1个月龄时肝脏便进行性增大至正常肝脏的2倍，3个月龄时，已经长到正常大小的3倍。到5～6个月龄时，肝脏中已经出现很多个肿瘤病灶。在哺乳动物的Hippo信号通路中，Mst1/2要靠Sav1介导才可以活化，他们同时还建立了Sav1功能失活的小鼠模型，发现了与Mst1/2同时失活类似的结果。说明Mst1/2同时失活或Sav1失活会破坏Hippo信号通路控制器官大小的功能，导致肝细胞过度增殖，最终肿瘤形成。Zhou等^[23]也通过Mst1/2失活的小鼠模型中证实功能正常的Mst1/2与抑制肝癌形成有关。Wang等^[24]在研究人肝癌组织中YAP表达水平与LATS1表达水平关系的实验中发现，与癌旁正常组织相比，肝癌组织中表达的YAP水平更高，而YAP的上游Hippo信号通路中的LATS1在癌组织中的表达水平则较癌旁正常组织低，并在进一步细胞试验中证实在肝癌细胞系中过表达的YAP与LATS1的表达呈负相关，可以推测，肝癌的形成可能与Hippo信号通路抑制YAP活化的能力下降有关。

4.Hippo信号通路与卵圆细胞：干细胞在成年哺乳动物及人类肝脏中，以卵圆细胞（oval cell）形式存在于终末小胆管（Hering管），具有多潜能分化能力，可分化为肝细胞和胆管上皮细胞^[25]。在成人正常的肝脏中，卵圆细胞通常不存在或含量甚微，只有肝组织受到严重损害，且残存肝细胞再生能力障碍的时候，肝卵圆细胞开始增殖分化，被认为起到修复受损的肝脏的作用^[26，27]。但也有学者认为肝卵圆细胞的多潜能分化能力与肝癌形成有关，卵圆细胞是肝癌形成过程中最普遍和最早发生的情况，且被认为是致肝癌发生物质的一个可能靶点^[28]。在研究肝癌发生机制的过程中，有学者发现Hippo信号通路与卵圆细胞增殖及分化也具有关系。Lee等^[29]发现在特异性敲除WW45的小鼠模型中（WW45-Liv-c KO小鼠）肝脏显著的大于对照组，肝脏内卵圆细胞数量比对照组明显增多，肝脏内Yap呈现超活化态式，并且发现包括Yap在内的Hippo通路的核心组件主要聚集在WW45-Liv-c KO小鼠肝脏卵圆细胞丰富的部分。而WW45-Liv-c KO小鼠肿大的肝脏最终发展成为具有肝细胞癌和胆管上皮癌混合表型的肿瘤，这些肿瘤看起来起源于卵圆细胞。他们推测敲除WW45-Liv-c KO对Hippo通路造成的变化及最终导致的Yap超活化的结果都是特异性针对卵圆细胞的。因此他们认为哺乳动物Hippo信号通路抑制卵圆细胞增殖，控制肝脏正常大小，阻碍有卵圆细胞衍生的肿瘤发展。Miki等^[30]在因Mob1a/1b缺失而导致Hippo信号通路失活的突变小鼠模型中也得到了类似的结论。

5.YAP与乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）：乙型肝炎病毒（HBV）持续感染是发生原发性肝癌的高危因素之一，经过肝炎-肝纤维化（肝硬化）-肝癌这一经典肝病发展模式，是肝癌临床最重要的病理演进过程^[31]。但是这其中的演变机制却不清楚。HBx蛋白是有HBx基因编码的一种多功能蛋白，可以通过反式激活Ras/Raf、核因子-κ等多种途径干扰正常的肝细胞增殖、凋亡的周期，近年来的研究结果显示HBx在肝细胞癌的发生发展中有重要作用^[32，33]。那么HBx是否也对Hippo这条抑癌通路产生影响？Zhang等^[34]在HBx转染小鼠的肝癌组织和HBV感染的HepG2.2.15肝癌细胞株中都检测到Yap的表达明显提高。并在HBx转染的HepG2/H7402细胞株中发现HBx过度表达可以导致Yap水平上调，应用HBx RNA干扰HBx表达时，可以下调Yap水平。在进一步探究HBx调节Yap机制中，Zhang等还发现萤光素酶报告基因分析显示HBx调节Yap的启动区域定位在nt-232/+115，这个区域包括反应结合蛋白。染色质免疫沉淀法显示HBx能够和Yap的启动子结合，而当反应结合蛋白沉默的时候HBx便不能再和Yap结合起调节作用。之后他们又通过电泳迁移实验和萤光素酶报告基因分析确定HBx能通过反应结合蛋白活化Yap启动子。这一研究为探索HBV持续感染诱发肝细胞癌发生机制研究提供了新的研究方向。

三、小结和展望

Hippo信号通路失活在肝癌形成过程中的作用，除了导致肝细胞过度增殖，凋亡障碍，还能诱发具有多分化潜能的与肝癌形成有关的卵圆细胞大量增殖。并且，有学者认为YAP受HBVx蛋白调节，在我国原发性肝癌患者中有90%与HBV感染有关，这是否是解释HBV持续感染与肝癌形成之间关系的钥匙，还需要更多的研究来证实。由于Hippo通路激活和调节的机制复杂，且可以与Wnt，Notch，UPR信号等其他能够调节细胞增殖的信号通路相互作用^{[35，36，37]}，Hippo信号通路还有很多没有被人类认知的信息。尽管如此，已有研究显示抑制YAP/TAZ活化可能成为新的治疗肿瘤的手段，包括进展迅速、预后不良、放化疗均无良好效果的肝癌。Perra等用可以分解YAP/TAZ-TEAD结构的维替泊芬（VP）治疗二乙基亚硝胺处理后的小鼠肝癌模型，发现癌前病变明显减少了，卵圆细胞的增殖能力也减弱了，并在进一步的体外细胞研究中得到了相同的结论。而Hippo信号通路作为对YAP/TAZ活化有抑制作用的通路，将为寻找新的肝癌治疗手段提供方向。深入研究Hippo信号通路的生物学功能将对人类更好的认识自身具有重要意义。

利益冲突

无

作者贡献声明

原琳：撰写文章；李智伟：校审并定稿