肌肽二肽酶作为肝细胞癌诊断及预后评估潜在新型标志物的初步探讨

Abstract

Objective

To explore carnosine dipeptidase 1 (CNDP1) potential value as a diagnostic and prognostic evaluator of hepatocellular carcinoma (HCC).

Methods

A gene chip and GO analysis were used to screen the candidate marker molecule CNDP1 for HCC diagnosis. 125 cases of HCC cancer tissues, 85 cases of paracancerous tissues, 125 cases of liver cirrhosis tissues, 32 cases of relatively normal liver tissue at the extreme end of hepatic hemangioma, 66 cases from serum samples of HCC, and 82 cases of non-HCC were collected. Real-time fluorescent quantitative PCR, immunohistochemistry western blot, and enzyme-linked immunosorbent assay were used to detect the differences in m RNA and protein expression levels of CNDP1 in HCC tissue and serum. Receiver operating characteristic (ROC) curves and Kaplan-Meier survival were used to analyze and evaluate the value of CNDP1 in the diagnosis and prognosis of HCC patients.

Results

The expression level of CNDP1 was significantly reduced in HCC cancer tissues. The levels of CNDP1 were significantly lower in the cancer tissues and serum of HCC patients than those in liver cirrhosis patients and normal controls. ROC curve analysis showed that the area under the curve of serum CNDP1 in the diagnosis of HCC patients was 0.7532 (95% CI0.676-0.8305), and the sensitivity and specificity were 78.79% and 62.5%, respectively. The combined detection of serum CNDP1 and serum alpha-fetoprotein (AFP) significantly improved the diagnostic accuracy (AUC=0.8206, 95% CI 0.7535-0.8878). The diagnostic sensitivity and specificity of serum CNDP1 for AFP-negative HCC patients were 73.68% and 68.75% (AUC=0.7931, 95% CI 0.7088-0.8774), respectively. In addition, the level of serum CNDP1 distinguished small liver cancer (tumor diameter＜3cm) (AUC=0.7571, 95% CI 0.6374-0.8768). Kaplan-Meier survival analysis showed that CNDP1 was associated with a poor prognosis in HCC patients.

Conclusion

CNDP1 may be a potential biomarker for the diagnostic and prognostic evaluation of HCC, and it has certain complementarity with serum AFP.

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）全球发病率和死亡率仍居高不下，2020年新增病例达90.6万例^[1，2]，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染是HCC发病的主要危险因素^[3]。迄今尚缺乏高特异性和敏感性的HCC早筛、早诊及预后判断的无创标志物，致使HCC早期诊断率偏低，临床上根治性手术率不足20%，HCC患者整体预后较差。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）是HCC筛查的传统血清标志物，但AFP诊断HCC患者的总体敏感性仅为60%^[4]，且临床上约30%～40%的HCC患者血清AFP呈阴性（≤20ng/ml）^[5]。由于HCC易发生复发、肝内外转移，肝切除术后5年生存率仅70%～80%^[6]。为此，临床上迫切需要寻找灵敏度高、特异度好的有效地诊断及预后评估的HCC标志物。肌肽二肽酶（carnosine dipeptidase 1, CNDP1）属于M20金属肽酶家族，由位于18号染色体上的CNDP1基因编码，可特异性将肌肽水解为β-丙氨酸和L-组氨酸^[7]。CNDP1在蛋白翻译后水平的调控、细胞周期调控及组织修复等多种生物学功能中发挥重要作用^[8]。研究发现胶质母细胞瘤患者的血浆样本中CNDP1水平下降^[9]，转移的前列腺癌患者血清中CNDP1水平更低^[10]。迄今有关CNDP1在HCC中的研究尚鲜见报道。

本研究通过生信分析筛选并鉴定出HCC相关候选基因CNDP1，通过临床组织和血清样本检测其在HCC组织及血清中的表达水平，并与非HCC样本相比较，探讨CNDP1在HCC诊断和预后评估中的临床价值。

资料与方法

1.数据来源：从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载用于本研究分析基因表达谱及相关临床特征的微阵列数据集GSE40367，数据集基于GPL570（Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）分析平台。GSE40367共纳入61例组织样本，其中包括56例HCC癌组织和5例正常肝组织样本。利用limma包分析HCC癌组织与正常组织中差异表达的基因。

2.研究对象：收集解放军总医院第五医学中心（2018年1月至2022年2月）125例HCC患者癌组织，85例配套癌旁组织，125例肝硬化组织，肝血管瘤手术切除远离部位相对正常肝组织32例，48例肝硬化患者和66例HCC患者外科手术治疗前及34例健康体检者血清样本。手术切除的组织样本快速存放于液氮冰冻以提取总蛋白和RNA。所有标本均按照2019版世界卫生组织（WHO）肝和肝内胆管肿瘤组织学分类进行病理诊断及评价。收集患者基本信息、临床病理资料和血清学指标，包括年龄、性别、肿瘤大小和数目、分期和血清AFP测定等。研究对象均签署患者知情同意书，实验获解放军总医院第五医学中心伦理委员会批准（批准文号：2016043D）。

3.实时荧光定量PCR（RT-q PCR）：采用RNA提取试剂盒（购自中国百泰克公司）从组织样本中提取总RNA，使用Prime Script RT-PCR Kit（购自日本Takara公司）逆转录为c DNA，以SYBR Green（购自美国Thermo公司）和实时荧光定量PCR系统进行RT-q PCR检测，采用β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照。CNDP1引物序列：正向为5′-AGCCAGCAATCACTTACGGAACC-3′，反向为5′-GAGAAGAGCAACCAGATCAGCCATT-3′。

4.蛋白质印迹法（western blot）：通过细胞裂解液（购自杭州碧云天公司）制备细胞和组织的蛋白样品。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳将蛋白样品分离并转移至聚偏氟乙烯膜上，CNDP1单克隆抗体（1∶1000，美国R&D Systems）、β-actin抗体（1∶1000，购自中国中杉金桥公司）在4℃孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Ig G（1∶1000，购自中杉金桥公司）在室温下孵育。化学发光试剂（1∶1，购自美国Bio-Rad公司）显示蛋白条带。

5.酶联免疫吸附试验：采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（购自中国博士德公司）测定血清CNDP1浓度。将100 μl标准品或者血清样品（1∶1000稀释）加入预涂有抗人CNDP1抗体的微孔板中37℃孵育90min；100 μl生物素标记的抗人CNDP1抗体37℃孵育60min；与亲和素-过氧化物酶复合体工作液孵育30min；加入90 μl TMB底物溶液反应25～30min。加终止液100 μl，终止反应。

6.免疫组织化学染色及半定量评分：组织样本于10%中性福尔马林中常规固定24h，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片。二甲苯溶液脱蜡，梯度乙醇水化。p H 9.0的EDTA修复液高压抗原修复3min。在过氧化氢溶液中浸泡10min，一抗CNDP1（1∶200，美国R&D Systems）、Ki67（1∶200，购自中国中杉金桥公司）室温下孵育1h。室温下用辣根过氧化物酶标记的Ig G孵育20min。DAB染色，苏木精复染细胞核，中性树脂胶封片。免疫组织化学染色结果：以阳性细胞比例计分：0分（0～5%），1分（6%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）；染色强度计分：0分（未着色），1分（浅黄色），2分（棕黄色），3分（深褐色）。根据染色强度和阳性细胞百分比的乘积用于半定量分析。其中＞6分为高表达，≤6分为低表达。

7.统计学方法：采用Graph Pad 8.0软件进行统计分析。非正态分布连续变量用中位数表示，采用Mann-Whitney U检验进行分析比较。绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic, ROC）评估诊断效能。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并使用对数秩检验比较分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

结果

1.候选基因CNDP1筛选分析：从GEO数据库（GSE40367）微阵列数据进行生物信息学分析以筛选HCC相关候选基因，利用基因表达芯片对非HCC肝组织及HCC组织进行聚类和差异分析（图1A），共获得差异基因731个，其中482个下调基因，249个上调基因（图1B）。依据差异变化倍数和GO分析结合文献鉴定非HCC肝组织与HCC组织之间差异表达的基因，最终将目标分子聚焦于CNDP1基因上。利用芯片数据分析，与配对的非HCC肝组织比较，CNDP1在HCC组织中表达下调44.32倍（图1C）。

图1. HCC候选基因的筛选.

注：CNDP1：肌肽二肽酶；HCC：肝细胞癌；A、B：HCC和非HCC肝组织差异表达的聚类分析和火山图；C：芯片数据中CNDP1在HCC癌组织及其对照组织中的表达水平

2.CNDP1在HCC癌组织中显著性表达下调：RT-q PCR检测结果显示，85例配对样本中CNDP1在癌组织中表达量显著低于癌旁组织（P＜0.001）（图2A），以32例肝血管瘤手术切除远离部位相对正常肝组织作为对照，HCC患者（n=85）癌组织中CNDP1的表达量显著降低（图2B）。通过免组织化学方法检测125例肝癌组织和肝硬化组织中CNDP1蛋白的表达情况，结果显示CNDP1蛋白表达主要分布于细胞质中，呈棕黄色或棕褐色颗粒，在肝癌组织和肝硬化组织中CNDP1高表达率分别为29.6%和57.6%。肝癌组织中CNDP1高表达率显著低于肝硬化组织（x²=19.926,P＜0.001）（图2C）。Western blot结果表明CDNP1在HCC患者癌组织中的蛋白水平显著低于癌旁组织（图2D）。同时，148例患者血清通过ELISA检测显示，HCC患者和肝硬化患者血清CNDP1水平均显著低于健康对照（P＜0.001），且HCC患者血清CNDP1水平显著低于肝硬化患者（图2E）。基线资料见表1。

图2. CNDP1在HCC癌组织中显著性表达下调.

注：CNDP1：肌肽二肽酶；HCC：肝细胞癌；A：RT-q PCR测定CNDP1在HCC癌组织及癌旁组织中的表达水平；B：CNDP1在HCC及正常肝组织中的表达水平；C：HCC癌组织和肝硬化组织中CNDP1的免疫组化染色结果；D：HCC癌及癌旁组织中CNDP1的蛋白表达；E：血清CNDP1在HCC、肝硬化患者及健康对照中的表达水平

表1. 研究对象的一般情况.

组别	例数	年龄 （岁）	性别 （男/女）	病因 （HBV/HCV/非感染）	AFP （μg/L）	TNM分期 （Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ）	肿瘤数目 （单发/多发）	瘤体直径 （< 3 cm/3~9 cm/> 9 cm）
健康对照组	34	49.07	23/11	NA	2.21	NA	NA	NA
肝硬化组	48	49.74	31/17	38/5/5	6.24	NA	NA	NA
HCC组	66	53.72	56/10	54/3/9	382.07	3/45/18	20/46	25/30/11

注：HCC：肝细胞癌；HBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒；AFP：甲胎蛋白；NA：无适用数据

3.CNDP1用于HCC诊断效能的评价：采用ROC曲线评估血清CNDP1对HCC患者潜在的诊断价值。当CNDP1的诊断临界值为198ng/ml时，其诊断HCC患者的敏感度为78.79%，特异度为62.5%（AUC=0.7532,95% CI 0.676～0.830,P＜0.001）。血清AFP诊断HCC患者的敏感度为51.52%，特异度为83.56%（AUC=0.7723,95% CI 0.6952～0.8494,P＜0.001）。CNDP1联合血清AFP诊断HCC患者的敏感度为83.75%，特异度为68.18%（AUC=0.8206,95% CI 0.7535～0.8878,P＜0.001）（图3A）。值得注意的是CNDP1诊断血清AFP阴性HCC患者的敏感度为73.68%，特异度为68.75%（AUC=0.7931,95% CI 0.7088～0.8774,P＜0.001）（图3B）。为进一步评估CNDP1诊断小肝癌患者的效能，血清学检测结果显示CNDP1能够有效区分瘤体直径小于3cm的小肝癌患者（AUC=0.7571,95% CI 0.6374～0.8768,P＜0.001），敏感度为76.19%，特异度为63.75%（图3C）。

图3. CNDP1用于HCC诊断效能的评价.

注：CNDP1：肌肽二肽酶；HCC：肝细胞癌；AFP：甲胎蛋白；ROC：受试者操作特征曲线；A：CNDP1、AFP及CNDP1协同AFP诊断HCC患者的ROC曲线；B：CNDP1诊断AFP阴性HCC患者的ROC曲线；C：CNDP1区分瘤体直径＜3cm的小肝癌患者的ROC曲线

4.HCC患者血清CNDP1水平分层分析：根据不同的临床病理特征对HCC患者CNDP1水平进行分层分析，进一步发现无论是HBV或HCV感染还是非感染性（酒精性等）肝硬化背景的HCC患者CNDP1水平均显著低于对照组（P值均＜0.01），但不同病因背景的HCC患者中CNDP1的表达差异无统计学意义（图4A、B）。有趣的是，检测结果显示瘤体直径＜3cm、3～9cm、＞9cm的HCC患者血清CNDP1水平均低于对照组（图4C）。TNM分期Ⅰ期的HCC患者血清CNDP1水平均高于TNM分期Ⅱ期、Ⅲ期的HCC患者（图4D）。单发和多发性癌灶HCC患者血清CNDP1水平均低于对照组（图4E）。然而，不同瘤体直径、TNM分期、肿瘤数量的HCC患者之间CNDP1的表达无显著差异。根据血清CNDP1浓度，随机选取血清水平较高（＞300ng/ml）和血清水平较低（＜60ng/ml）的HCC患者，分析血清CNDP1表达与组织内肿瘤细胞增殖标志物Ki67之间的关系，结果表明血清CNDP1表达量低的HCC患者Ki67水平表达较高（图4F、G）。为了分析CNDP1表达与HCC患者预后的关系，我们利用TCGA数据库中HCC患者CNDP1的表达数据及临床资料进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示CNDP1低表达的HCC患者总生存期显著低于CNDP1高表达的HCC患者且CNDP1表达较低的HCC患者肿瘤倍增时间较短（58d比96d）（图4H）。

图4. HCC患者血清CNDP1水平临床病理分层分析.

注：CNDP1：肌肽二肽酶；HCC：肝细胞癌；HBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒；HE：苏木精-伊红；A、B：CNDP1在不同病因背景的HCC患者中的表达；C：CNDP1在不同瘤体直径的HCC患者中的表达；D：CNDP1在不同TNM分期的HCC患者中的表达；E：CNDP1在不同瘤体数目的HCC患者中的表达；F：不同浓度CNDP1的HCC患者HE、CNDP1和Ki67染色结果；G：不同浓度CNDP1的HCC患者中Ki67的表达水平分析；H：CNDP1与HCC患者总生存期（OS）曲线

讨论

CNDP1作为肌肽水解的关键酶，在蛋白翻译后水平的调控、组织修复以及细胞周期调控等多种生物学功能中发挥重要作用。Perrin等^[11]发现CNDP1在轻度痴呆患者血清中降低。有研究表明CNDP1的多态性可导致肌肽降解活性和糖尿病肾病风险显著降低^[12，13]。有关胃肠癌研究中，CNDP1在血浆中的水平降低，并与分解代谢和不良预后有关^[14]。关于CNDP1在HCC中的研究至今鲜见报道。本研究结果显示，CNDP1在HCC组织中的表达明显低于肝硬化组织和癌旁组织，这与CNDP1在胃肠癌、转移的前列腺癌患者血清中低表达的文献报道一致。结合文献及我们的研究结果，推测CNDP1可能在HCC等肿瘤的发生和发展中发挥抑癌基因的作用。

AFP作为目前临床上诊断HCC的主要血清学标志物，其诊断效能尚低。近年来，几个新型血清标志物陆续被鉴定和评估用于HCC筛查，如AFP-L3、脱-γ-羧基-凝血酶原、高尔基体蛋白73等，但这些新型血清标志物的诊断效能尚不理想，并缺乏大样本、多中心、前瞻性设计的临床队列验证，目前尚不能替代AFP。临床上并非所有HCC患者皆分泌AFP，且大多数AFP阴性的HCC往往是小肝癌，缺乏典型的影像学特征。AFP阴性的HCC的诊断在临床实践中很重要，因为AFP阴性的HCC患者的预后优于AFP阳性HCC患者^[15]。所以寻找新的检测HCC的潜在血清生物标志物仍然是一个重要的课题。我们以健康对照和肝硬化患者作为对照组绘制ROC曲线发现，当CNDP1的诊断临界值为198ng/ml时，CNDP1可以有效诊断HCC，其诊断HCC的敏感度高于AFP。CNDP1与AFP联合检测能显著提高诊断效能。值得关注的是，CNDP1能够有效地区分瘤体直径小于3cm的HCC组织。此外，血清CNDP1在AFP阴性HCC患者也显示出较高的敏感度和特异度。结果表明，CNDP1有望成为AFP的互补指标，联合应用提高HCC患者的确诊率，具有潜在的临床应用前景。

多种因素影响HCC的生存率及复发率，微血管侵犯、肿瘤体积大、多发性、血清AFP水平升高等是HCC预后不良的已知危险因素^[16]。肿瘤细胞增殖指数Ki67是目前公认的灵敏度最高的组织学标志物，是有效的预后判断的指标，Ki67高表达与肿瘤不良的生物学行为相关^[17]。我们对HCC患者血清CNDP1水平进行分层分析，发现CNDP1在不同病因背景的HCC患者中均显著下调。值得关注的是，瘤体直径＜3cm、3～9cm、＞9cm的HCC患者中血清CNDP1的表达水平均低于对照组。单发和多发性癌灶HCC患者血清CNDP1水平均低于对照组。TNM分期Ⅱ期和Ⅲ期的HCC患者血清CNDP1水平低于TNM分期Ⅰ期。此外，Kaplan-Meier生存分析发现CNDP1与HCC患者不良预后相关，CNDP1可能作为监测治疗预后的潜在标志物，对提高HCC总体生存率有重要意义。

目前，CNDP1参与肿瘤发生与进展的机制尚不清楚，研究发现胞质非特异性肌肽酶2（cytosolic nonspecific dipeptidase 2, CNDP2）作为CNDP1的同源蛋白^[18]，在HCC中表达下调，并参与调节HCC细胞的生长、集落形成和侵袭^[19]。CNDP2通过PI3K/AKT信号通路促进卵巢癌的发生和发展^[20]，这对我们后续研究CNDP1在HCC发生和进展中的分子调控机制研究有所启示。

总之，我们的研究结果初步显示CNDP1是一个有潜力的HCC诊断和预后的血清标志物，且对AFP阴性的HCC患者有一定的诊断价值。但本研究尚存在局限性，譬如检测HCC患者样本数量相对较少，且为单中心来源，有必要扩大队列进一步验证CNDP1在HCC中的诊断价值。此外，CNDP1在HCC中的调控机制有待阐明。

引用本文：

李欣，李妍，李曦，等.肌肽二肽酶作为肝细胞癌诊断及预后评估潜在新型标志物的初步探讨[J].中华肝脏病杂志，2023,31(6):627-633.DOI:10.3760/cma.j.cn501113-20230220-00069.

作者贡献声明

李欣：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，统计分析；李妍：酝酿和设计实验，实施研究，指导；李曦：酝酿和设计实验，指导；蒋丽娜：对文章的知识性内容作批评性审阅，指导；朱莉：分析/解释数据，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献；赵景民：酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费，指导，支持性贡献；鲁凤民：对文章的知识性内容作批评性审阅，指导

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81673654）

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81673654)