活体靶向羧酸酯酶1f基因敲减对急性肝衰竭小鼠枯否细胞极化活性的影响

Abstract

Objective

To investigate the effect of targeted carboxylesterase 1f (Ces1f) gene knockdown on the polarization activity of Kupffer cells (KC) induced by lipopolysaccharide/D-galactosamine (LPS/D-Gal N) in mice with acute liver failure.

Methods

The complex si RNA-Endo Porter formed by combining the small RNA (si RNA) carrying the Ces1f-targeting interference sequence and the polypeptide transport carrier (Endoporter) was wrapped in β-1, 3-D glucan shell to form complex particles (Ge RPs). Thirty male C57BL/6 mice were randomly divided into a normal control group, a model group (LPS/D-Gal N), a pretreatment group (Ge RPs), a pretreatment model group (Ge RPs+LPS/D-Gal N), and an empty vector group (Endo Porter). Real-time fluorescent quantitative PCR and western blot were used to detect Ces1f m RNA and protein expression levels in the liver tissues of each mouse group. Real-time PCR was used to detect the expression levels of KC M1 polarization phenotypic differentiation cluster 86(CD86) m RNA and KC M2 polarization phenotypic differentiation cluster 163 (CD163) m RNA in each group. Immunofluorescence double staining technique was used to detect the expression of Ces1f protein and M1/M2 polarization phenotype CD86/CD163 protein in KC. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological damage to liver tissue. A one-way analysis of variance was used to compare the means among multiple groups, or an independent sample nonparametric rank sum test was used when the variances were uneven.

Results

The relative expression levels of Ces1f m RNA/protein in liver tissue of the normal control group, model group, pretreatment group, and pretreatment model group were 1.00±0.00, 0.80±0.03/0.80±0.14, 0.56±0.08/0.52±0.13, and 0.26±0.05/0.29±0.13, respectively, and the differences among the groups were statistically significant (F=9.171/3.957, 20.740/9.315, 34.530/13.830, P＜0.01). The percentages of Ces1f-positive Kupffer cells in the normal control group, model group, pretreatment group, and pretreatment model group were 91.42%,±3.79%, 73.85%±7.03%, 48.70%±5.30%, and 25.68%±4.55%, respectively, and the differences between the groups were statistically significant (F=6.333, 15.400, 23.700, P＜0.01). The relative expression levels of CD86 m RNA in the normal control group, model group, and pretreatment model group were 1.00±0.00, 2.01±0.04, and 4.17±0.14, respectively, and the differences between the groups were statistically significant (F=33.800, 106.500, P＜0.01). The relative expression levels of CD163 m RNA in the normal control group, the model group, and the pretreatment model group were 1.00±0.00, 0.85±0.01, and 0.65±0.01, respectively, and the differences between the groups were statistically significant (F=23.360, 55.350, P＜0.01). The percentages of (F4/80⁺CD86⁺) and (F4/80⁺CD163⁺) in the normal control group and model group and pretreatment model group were 10.67%±0.91% and 12.60%±1.67%, 20.02%±1.29% and 8.04%±0.76%, and 43.67%±2.71% and 5.43%±0.47%, respectively, and the differences among the groups were statistically significant (F=11.130/8.379, 39.250/13.190, P＜0.01). The liver injury scores of the normal control group, the model group, and the pretreatment model group were 0.22±0.08, 1.32±0.36, and 2.17±0.26, respectively, and the differences among the groups were statistically significant (F=12.520 and 22.190, P＜0.01).

Conclusion

Ces1f may be a hepatic inflammatory inhibitory molecule, and its inhibitory effect production may come from the molecule's maintenance of KC polarization phenotypic homeostasis.

急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）是肝组织免疫炎症损伤性疾病^[1]，肝内枯否细胞（kupffer cell，KC）在肝固有免疫反应和炎性损伤反应中发挥了关键作用^[2]。损伤因素如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可诱导KC发生M1极化释放炎症介质，如分化簇86（cluster of differentiation 86, CD86）、诱导型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase, i NOS）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）^[3]等，引起肝脏免疫性炎症和ALF^[4]。此外，KC还可向M2极化释放抗炎介质如CD163、IL-10、精氨酸酶1（arginase-1, Arg-1）等，参与组织修复、重构和免疫调控^[3，5]。近年有不少科学家期望通过调控巨噬细胞极化特性，来治疗免疫炎症性疾病，以达到减轻甚至避免组织器官损伤的目的^[6]。

羧酸酯酶1f（carboxylesterase 1f, Ces1f）是羧酸酯酶1（carboxylesterase 1, Ces1）家族成员之一，Ces1活性不足可造成肝代谢失调引起肝损伤^[7]。研究发现核转录因子肝X受体α（liver X receptor α，LXR α）可调控巨噬细胞内脂质代谢过程^[8]。LXR α活化促进肝内Ces1f表达，减轻了实验鼠肝脂肪沉积所引起的肝组织炎症损伤性反应^[9]。体外实验证实，LXR α激活可诱导LPS刺激KC由M1极化表型向M2表型转化^[10]。这提示，Ces1f可能在LXR α调控的肝组织炎症和KC极化活性中有重要作用。LPS联合D-半乳糖胺（D-galactosamine, D-Gal N）腹腔注射通常用于建立肝功能衰竭的动物模型^[11]。为探讨上述问题，我们在本实验中采用LPS/D-Gal N诱导ALF动物模型，进行动物活体内KC定向Ces1f基因敲减实验，研究Ces1f对该疾病KC极化活性的影响。研究成果将有助于阐明Ces1f在ALF发生中的作用及其机制。

资料与方法

1.主要试剂与耗材：LPS及D-Gal N购自美国Sigma公司；Endo Porter购自美国Gene Tools公司；β-1,3-D葡聚糖购自美国Thermo公司；si RNA及引物合成于上海生物工程有限公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自日本Ta Ka Ra公司。Ces1f抗体订制于上海艾比玛特医药科技有限公司；小鼠F4/80多克隆抗体购自美国Proteintech公司；兔CD86单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；兔CD163单克隆抗体购自美国Abcam公司。磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris/EDTA、BCA蛋白浓度测定试剂盒、乙酸钠、肌动蛋白（β-actin）抗体、山羊抗小鼠Ig G-辣根过氧化物酶（HRP）、山羊抗兔Ig G-HRP购自上海碧云天公司。

6周龄健康雄性C57BL/6小鼠，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018-0004。动物饲养于东华大学实验动物中心动物房。实验前禁食12h，不禁水。所有动物实验均符合国家实验动物的护理和使用指南，并经南京医科大学实验动物福利伦理委员会的审查批准（批文号：IACUC-2106040）。

2.β-1,3-D-葡聚糖包裹Endoporter-si RNA颗粒（β-1,3-D-glucan encapsulated Endoporter-si RNA particles, Ge RPs）的制备：参照文献[12]：（1）在Gen Bank中获取小鼠Ces1f基因序列，依据si RNA设计原则合成Ces1f-si RNA序列的正义链（5′→3′：GCUGGCUUCUGCCAACAAUTT）、反义链（5′→3′:AUUGUUGGCAGAAGCCAGCTT）^[13]。（2）将5nmol的Ces1f-si RNA与50nmol的多肽转运载体（Endo Porter）混合，并用30mmol/L乙酸钠（p H4.8）定容到20μl，4℃孵育15min；在Ces1f-si RNA-Endo Porter溶液中加入1mg β-1,3-D-葡聚糖，涡旋混合30s后4℃孵育1h。（3）在上述复合体颗粒（Ge RPs）中加入Tris/EDTA（p H8.0）缓冲液，4℃孵育15min；4℃3000～4000r/min离心30s（r=8cm），弃上清液。（4）PBS重新悬浮Ge RPs后等量分装，液氮速冻后-80℃储存。

3.动物处理及分组：30只小鼠随机为5组，每组6只：正常对照组、模型组、预处理组、预处理模型组、空载体组。正常对照组（A）和模型组（B）小鼠第1、3、6、9、12、15天尾静脉注射PBS，第16天正常对照组小鼠腹腔注射PBS而模型组小鼠腹腔注射50 μg/kg LPS+800mg/kg D-Gal N；预处理组（C）和预处理模型组（D）小鼠第1、3、6、9、12、15天尾静脉注射Ge RPs，第16天预处理组小鼠腹腔注射PBS而预处理模型组小鼠腹腔注射50 μg/kg LPS+800mg/kg D-Gal N；空载体组（E）小鼠第1、3、6、9、12、15天尾静脉注射Endo Porter，第16天腹腔注射PBS。6h后将小鼠麻醉处死并收集血清和肝组织。

4.实时荧光定量PCR技术：总RNA的提取及PCR操作方法按照试剂盒说明书进行。采用2^-ΔΔCt相对定量法对数据进行分析。目的基因和内参照基因引物序列见表1。

表1. 引物序列.

基因	上游引物	下游引物
Ces1f	5'-TTTGCACTGCCTACCAGAGTC-3'	5'-GGTGGTGAAGAGGGGTTTCC-3'
CD163	5'-TGGGTGGGGAAAGCATAACT-3'	5'-AAGTTGTCGTCACACACCGT-3'
CD86	5'-TCCAAGTTTTTGGGCAATGTC-3'	5'-CCTATGAGTGTGCACTGAGTTAAACA-3'
GAPDH	5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'	5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'

注：Ces1f：羧酸酯酶1f；CD：分化簇；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

5.蛋白质免疫印迹（western blot）：适量小鼠肝组织研磨匀浆，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取组织总蛋白。然后，将样品以12000r/min（r=8 cm）在4℃离心10min。肝组织总蛋白浓度用BCA试剂盒检测。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。与兔多克隆抗体Ces1f（1∶2000）于4℃孵育过夜，肌动蛋白（β-actin）为内参照蛋白，随后与HRP标记的第二抗体室温孵育2h，采用增强化学发光试剂盒鉴定免疫反应条带。采用分子成像仪进行成像拍照，Bio-Rad Quantity one version 4.6.7软件对相应条带进行灰度分析。

6.免疫荧光双染：肝组织切片石蜡包埋，60℃烤片1.5h，二甲苯脱蜡（3次，每次10min）和梯度乙醇水化（无水乙醇与95%、80%、75%乙醇溶液及蒸馏水）各3次，每次10min。3%过氧化氢室温处理10min，阻断内源性过氧化物酶活性；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（p H 6.0）微波修复抗原15min，冷却至室温；10%山羊血清37℃封闭30min；加入第一抗体Ces1f（1∶2000）、F4/80 (1∶500)、CD86(1∶500)、CD163（1∶500）,4℃孵育过夜；PBS漂洗3次，每次5min；加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔和Cy3标记的山羊抗小鼠第二抗体，4℃避光孵育12h，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min，滴加含DAPI的抗荧光淬灭剂后封片。

7.肝组织病理形态：肝组织在4%多聚甲醛溶液中固定24h后脱水，并包埋在石蜡中，制成5 μm切片，然后用苏木精-伊红（HE）染色。由3位病理科医师进行双盲读片，并对观察到的切片进行肝损程度评分。评分方法参照文献[14]；肝损伤严重程度分为：0：轻度或无损伤迹象；1：轻度损伤，包括局灶性核固缩和胞质空泡化；2：中-重度损伤，伴有广泛的核固缩，细胞间边界消失，胞质高嗜酸性粒细胞增多；3：严重出血、坏死，肝索解体，中性粒细胞浸润。

8.统计学方法：数据用均数±标准差（±s）表示，实验数据的处理和分析采用Graph Pad Prism 8软件，多组间均数比较采用单因素方差分析，采用S-N-K或LSD进行两两比较；方差不齐则采用独立样本非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.各组小鼠肝组织Ces1f m RNA表达情况：A、B、C、D、E组小鼠肝组织Ces1f m RNA的相对表达水平分别为1.00±0.00、0.80±0.03、0.56±0.08、0.26±0.05和1.0±0.07。经统计学分析，B、C组和D组Ces1f m RNA表达水平较A组均显著降低；而B组和C组较D组水平则显著升高（P值均＜0.01），差异均存在统计学意义；A组和E组之间比较，差异不明显。见图1。

图1. 各组肝组织Ces1f m RNA表达水平.

注：Ces1f：羧酸酯酶1f；A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；与A组比较，^a P＜0.01；与B组和C组比较，^b P＜0.01

2.各组小鼠肝组织Ces1f蛋白表达情况：A、B、C、D组和E组小鼠肝组织Ces1f蛋白的相对表达水平分别为1.00±0.00、0.80±0.14、0.52±0.13、0.29±0.13和0.94±0.16。经统计学分析，B、C组和D组Ces1f蛋白表达水平较A组均显著降低；而B组和C组较D组水平则显著升高（P值均＜0.01），差异均存在统计学意义。A组和E组之间比较，差异不明显。见图2。

图2. 各组小鼠肝组织Ces1f蛋白表达水平.

注：Ces1f：羧酸酯酶1f；β-actin：肌动蛋白；A：Ces1f蛋白印迹图；B：Ces1f蛋白表达水平统计直方图；1：正常对照组；2：模型组；3：预处理组；4：预处理模型组；5：空载体组；与1组比较，^a P＜0.01；与2组和3组比较，^b P＜0.01

3.各组小鼠肝M1极化标志物CD86 m RNA表达：A、B、C、D、E组小鼠肝组织CD86 m RNA相对表达水平分别为1.00±0.00、2.01±0.04、1.03±0.05、4.17±0.14、1.01±0.05。统计学分析显示，与A组比较，B组和D组CD86 m RNA表达水平明显升高（P值均＜0.01）；与D组比较，B、C组和E组CD86 m RNA表达水平明显降低（P值均＜0.01），差异均存在统计学意义；A、C、E组3组间两两比较，差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。见图3。

图3. 各组小鼠M1极化标志物表达水平.

注：CD86：分化簇86；A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；与A组比较，^a P＜0.01；与B组比较，^b P＜0.01

4.各组小鼠肝M2极化标志物CD163 m RNA表达：A、B、C、D、E组小鼠肝组织CD163 m RNA相对表达水平分别为1.00±0.00、0.85±0.01、1.01±0.02、0.65±0.01、1.02±0.02。经统计学分析，B组和D组M2极化标志物CD163 m RNA相对表达水平较A、C、E组低（P值均＜0.01），而D组较A、B、C、E组低（P值均＜0.01），差异具有统计学意义；A、C、E组两两间比较，差异无统计学意义（P值均＞0.05）。见图4。

图4. 各组小鼠M2极化标志物表达水平.

注：CD163：分化簇163；A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；与A组比较，^a P＜0.01；与B组比较，^b P＜0.01

5.各组小鼠KC的Ces1f表达水平：各组小鼠KC表面标志物F4/80（绿色）和Ces1f（红色）荧光双染色结果显示，5组的F4/80⁺Ces1f⁺双阳性细胞（箭头所示黄色）所占百分比分别为91.42%±3.79%、73.85%±7.03%、48.70%±5.30%、25.68%±4.55%和91.54%±1.69%。经统计学分析，与A组相比，B组、C组、D组双阳性细胞占比明显下降（P值均＜0.01）；与B组相比，C组和D组双阳性细胞占比也显著下降（P值均＜0.01），差异均具有统计学意义。A组和E组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5. 各组小鼠KC的Ces1f表达免疫荧光×400.

注：Ces1f：羧酸脂酶1f；KC：枯否细胞；A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；F：Ces1f阳性百分比直方图；与A组比较，^a P＜0.01；与B组比较，^b P＜0.01

6.各组小鼠KC的M1极化表型分析：各组小鼠KC标志蛋白F4/80（绿色）和M1表型标志蛋白CD86（红色）荧光双染色结果显示，5组小鼠肝组织F4/80⁺CD86⁺双阳性细胞（箭头所示黄色）占F4/80⁺单阳性细胞的百分比分别为10.67%±0.91%、20.02%±1.29%、10.73%±0.56%、43.67%±2.71%和10.69%±0.72%。经统计学分析，与A组比较，B组和D组F4/80⁺CD86⁺双阳性细胞占比升高（P值均＜0.01）；与B组比较，D组F4/80⁺CD86⁺双阳性细胞占比明显升高，差异均存在统计学意义（P值均＜0.01）；A组、C组、E组两两比较，差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。见图6。

图6. 各组小鼠KC的M1极化水平免疫荧光×400.

注：CD86：分化簇86；KC：枯否细胞；A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；F：CD86阳性百分比直方图；与A组比较，^a P＜0.01；与B组比较，^b P＜0.01

7.各组小鼠KC的M2极化表型变化：各组小鼠KC标志蛋白F4/80（绿色）和M2表型标志蛋白CD163（红色）荧光双染色结果显示，5组的F4/80⁺CD163⁺双阳性细胞（箭头所示黄色）占F4/80⁺单阳性细胞的百分比分别为12.60%±1.67%、8.04%±0.76%、12.40%±1.65%、5.43%±0.47%和12.32%±1.60%。经统计学分析，与A组比较，B组和D组F4/80⁺CD163⁺双阳性细胞占比降低；与B组比较，D组占比明显降低，差异均具有统计学意义（P值均＜0.01）；A组、C组、E组两两比较，差异无明显统计学意义（P值均＞0.05）。见图7。

图7. 各组小鼠KC的M2极化水平免疫荧光×400.

注：CD163：分化簇163；KC：枯否细胞；A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；F：CD163阳性百分比直方图；与A组比较，^a P＜0.01；与B组比较，^b P＜0.01

8.各组小鼠肝组织病理评分：A组、C组和E组肝细胞形态正常，肝小叶结构完整清晰，无炎性细胞浸润；B组肝细胞水肿，肝细胞核固缩，核染色质边集，小叶结构紊乱；D组肝细胞明显肿胀变性（绿色箭头），炎性细胞浸润（绿色五角星），细胞膜破碎、溶解，大量肝细胞核破碎或消失，弥漫分布的点灶状坏死（图8A～E）。采用肝损伤量化评分，5组小鼠肝组织损伤评分结果分别为0.22±0.08、1.32±0.36、0.25±0.12、2.17±0.26和0.23±0.12。经统计学分析，B组和D组较A组损伤评分增高，D组较B组评分高，差异均存在统计学意义（P值均＜0.01）；A组、C组和E组评分差异无统计学意义（P值均＞0.05，图8F）。

图8. 各组小鼠肝脏病理变化HE×400.

注：A：正常对照组；B：模型组；C：预处理组；D：预处理模型组；E：空载体组；F：肝组织炎症损伤评分直方图；与A组比较，^a P＜0.01；与B组比较，^b P＜0.01

讨论

ALF是一种进展迅速、病死率高的的急性损伤性疾病，发病机制与免疫炎性反应密切相关，主要表现为肝细胞大量死亡、肝功能快速恶化^[1]。我们前期研究发现LPS/D-Gal N诱导的ALF小鼠肝内Ces1f m RNA表达下调^[13]，而体外培养原代KC的Ces1f m RNA表达则上调^[15]。

为进一步分析Ces1f在ALF肝脏炎症损伤中的作用与机制，我们通过尾静脉注射把Ge RPs输送到小鼠肝脏^[12]，由于β-1,3-D-葡聚糖可被KC表面Dectin-1受体特异性识别，Ge RPs被KC摄取并吞噬，随后Endoporter促使囊泡酸化，在囊泡上打开一个“门”，吞噬囊泡释放出si RNA，从而靶向干扰KC内Ces1f基因的表达^[16]。本研究中，预处理组和预处理模型组肝内Ces1f m RNA和蛋白的表达均明显降低，同时肝组织KC的Ces1f疫荧光染色显示，预处理组和预处理模型组F4/80⁺Ces1f⁺双阳性细胞比例显著下调。这表明，Ge RPs靶向递送系统可有效敲低动物活体KC内Ces1f基因的表达。随后，我们检测了Ces1f敲减对ALF肝脏炎症损伤的影响。结果显示，Ge RPs注射后，伴随着KC内Ces1f的表达下调，ALF小鼠肝组织炎症损伤进一步加重。这提示，Ces1f可能有抑制肝脏炎症损伤的效应。

最后，我们分析了Ces1f对KC极化活性的影响。本研究结果显示，LPS/D-Gal N攻击后，M1标志物表达水平上调，而M2标志物表达水平下调，肝内M1/M2标志物水平出现明显失衡。通过尾静脉注射Ge RPs敲减Ces1f基因后ALF小鼠肝内M1标志物水平上调/M2标志物水平下调更为显著。采用荧光双染技术对KC的M1/M2表型细胞百分比进行进一步分析，结果显示M1/M2表型变化趋势与上述标志物表达失衡相似。这表明LPS/D-Gal N诱导肝脏炎症损伤期间，Ces1f敲减可能诱导了抗炎或修复型M2细胞向炎症型M1细胞转化，加重了ALF小鼠KC表型失衡状态，此时肝组织炎症损伤程度也明显加重。

综上所述，本研究结果提示定向敲减KC内Ces1f基因可通过诱导抗炎型M2细胞向促炎型M1细胞转化加重ALF小鼠肝脏炎症损伤。因此，我们可以得出以下结论，Ces1f可能是肝脏炎症抑制分子，其对肝脏炎症损伤的抑制效应可能缘自该分子对KC极化表型平衡状态的维持。相关的研究成果有助于阐明ALF发生过程中物质代谢影响炎症反应的新机制，这可能为将来ALF治疗提供一个以物质代谢酶系统作为药物靶标的新途径。

引用本文：

赵赛，杨雪，于倩，等.活体靶向羧酸酯酶1f基因敲减对急性肝衰竭小鼠枯否细胞极化活性的影响[J].中华肝脏病杂志，2023,31(6):582-588.DOI:10.3760/cma.j.cn501113-20220330-00151.

作者贡献声明

赵赛：实施研究，统计分析，采集数据，分析/解释数据，起草文章；杨雪：实施研究，采集数据，技术支持和指导；于倩：材料支持，采集数据；刘亮明：酝酿和设计实验，统计分析，解释数据，获取研究经费，对文章的知识性内容作批评性审阅，指导

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金项目（81770612、81070357、30660066）

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81770612, 81070357, 30660066)