Abstract
目的
明确膜棕榈酰化蛋白6（MPP6）在肝细胞癌（HCC）中的表达，分析其表达与HCC患者临床病理特征和预后的关系，探讨其对HCC细胞生物学行为的影响。
方法
选取2017年1月~2019年12月在我院行手术治疗的118例HCC患者肿瘤及癌旁组织标本，收集患者的临床病理资料，随访患者总生存期。采用免疫组化分析MPP6在肿瘤和癌旁组织中的表达水平；采用Cox回归分析MPP6表达水平与HCC患者临床病理特征和患者总生存期的相关性；采用平板克隆、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测MPP6对HCC细胞Hep3B生物学行为的影响。
结果
与癌旁组织相比，MPP6在HCC组织中高表达（P<0.001）；MPP6表达水平与患者肝硬化背景（P=0.028）和基线白蛋白水平（P=0.035）相关；生存分析提示，高表达MPP6患者预后较差（P<0.001）；Cox回归分析显示，MPP6表达水平是患者总生存期的独立预测因素（P=0.012，HR：2.335，95% CI： 1.502~3.629）。体外敲减MPP6可致Hep3B细胞增殖、迁移及侵袭能力下降（P<0.05），并阻滞细胞周期于G0/G1期（P<0.001）。
结论
MPP6在HCC组织中高表达，并与HCC患者重要临床病理特征、不良预后相关；体外敲减MPP6可抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力并阻滞细胞周期于G0/G1期。
Keywords: 肝细胞癌, 膜棕榈酰化蛋白6, 预后, 恶性生物学行为
Abstract
Objective
To investigate the expression of membrane protein palmitoylated 6 (MPP6) in hepatocellular carcinoma (HCC) and analyze its correlation with clinicopathological features and patient prognosis and its impact on biological behaviors of HCC cells.
Methods
We examined MPP6 expressions using immunohistochemistry in tumor and adjacent tissues from 118 HCC patients undergoing surgeries in our hospital from January, 2017 to December, 2019, and analyzed the correlation of MPP6 expression levels with clinicopathological data and overall survival (OS) of the patients using Cox regression analysis. In human hepatoma Hep3B cells, the effects of lentivirus-mediated MPP6 knockdown on biological behaviors of the cells were evaluated using colony formation assay, wound-healing assay, Transwell assay and flow cytometry.
Results
Compared with adjacent tissues, HCC tissues showed significant overexpression of MPP6 (P<0.001), whose expression levels was correlated with liver cirrhosis (P=0.028) and baseline albumin level (P=0.035) of the patients. Survival analysis suggested that HCC patients with a high expression of MPP6 had a worse prognosis (P<0.001); Cox regression analysis indicated that MPP6 expression (P=0.012, HR: 2.335, 95% CI: 1.502-3.629) was an independent predictor of OS of HCC patients following hepatectomy. In Hep3B cells, MPP6 knockdown obviously inhibited cell proliferation, migration and invasion (P<0.05) and caused cell cycle arrest in G0/G1 phase (P<0.001).
Conclusion
MPP6 is highly expressed in HCC tissues and correlates with important clinicopathological features and unfavorable prognosis of the patients. MPP6 knockdown inhibits proliferation, migration and invasion and blocks cell cycle progression in G0/G1 phase.
Keywords: hepatocellular carcinoma, membrane protein palmitoylated 6, prognosis, malignant biological behaviors
原发性肝癌（PLC）是常见的消化系统恶性肿瘤，其在全球和中国癌症相关死亡原因中均位居第2位［1， 2］。PLC主要的病理类型是肝细胞癌（HCC），约占90%［3］。尽管HCC的诊断与治疗策略近年来有所进展［4， 5］，但患者仍普遍面临早期诊断率低［6， 7］和预后不良［8， 9］的严峻挑战。因此，为实现早期预警、准确评估HCC患者预后以及开发靶向治疗策略，挖掘新的、有效的预后标志物并深入研究其调控机制显得尤为重要。膜棕榈酰化蛋白6（MPP6）是膜相关鸟苷酸激酶家族的重要成员［10］，最初作为外泌体相关RNA结合蛋白参与rRNA成熟过程［11］。近年研究发现，MPP6在多种肿瘤中既具有关键作用，又表现出功能异质性。在卵巢癌中，MPP6展现出对肿瘤的抑制作用，其低表达与患者较短的总生存期（OS）显著相关［12］；然而在胰腺导管腺癌中，MPP6则展现出对肿瘤的促进作用［13］。这些研究提示MPP6是肿瘤发生发展中一个值得关注的关键分子，但其在HCC中具体作用和机制尚缺乏研究。
本课题组前期基于公共数据库发现，MPP6在HCC组织中高表达，且其表达水平与患者恶性表型及不良预后密切相关［14］，但目前尚缺乏对临床样本的验证，其发挥作用的分子机制也有待进一步探索。本研究系统性地结合临床研究与基础实验，利用独立的研究者队列验证MPP6在HCC中的表达模式及其作为独立预后标志物的价值；并通过体外功能学实验探索MPP6调控HCC细胞恶性生物学行为的作用及潜在机制。研究以期在临床和功能学层面系统评估MPP6在HCC中的预后价值和生物学功能，为探寻HCC新的潜在预后标志物和治疗靶点提供实验数据和理论依据。
1. 资料和方法
1.1. 研究对象
选取我院2017年1月~2019年12月共118例HCC患者的术后肿瘤标本，其中59例有配对癌旁（ANT）组织，ANT组织定义为：癌旁肝组织、手术切缘距肿瘤边界大于1.0 cm［15］。患者纳入标准：确诊为HCC；术前未接受过抗肿瘤治疗；临床病理资料相对完整。排除标准：合并其他组织起源的恶性肿瘤。采集的临床资料包括肝硬化背景、甲胎蛋白、Child-Pugh分级、肿瘤包膜情况、肿瘤数目、BCLC分期、术后治疗方式等。其中术后治疗定义为：HCC手术切除后为预防肿瘤复发、延长患者OS而采取的一系列辅助治疗。本研究术后治疗方式包括：局部治疗、靶向治疗、中医中药治疗等。通过病历系统和电话随访获得患者OS，OS定义为患者从确诊HCC至因任何原因而死亡的时间。本研究获得我院伦理委员会的审批（伦理批号：BYYFY-2018KY46）。
1.2. 材料与试剂
人正常肝细胞系LO2（南京凯基生物），HCC细胞系Huh7、Hep3B、BEL-7404和SMMC-7721（中国科学院上海细胞库）；MPP6抗体、GAPDH抗体（Proteintech）；胎牛血清、RPMI 1640培养基、抗青霉素链霉素双抗混合液、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶（Gibco）；SDS-PAGE凝胶试剂盒（上海雅酶生物）；细胞周期试剂盒（联科生物）；基质胶和Transwell小室（Corning）；特异性敲减MPP6基因的慢病毒载体及对照空载质粒（上海吉凯基因）；嘌呤霉素（Biosharp）。
1.3. 免疫组织化学（IHC）染色分析HCC组织和ANT组织中MPP6的表达情况
将HCC组织及ANT组织制备成厚度为4 μm的切片，60 ℃恒温箱中3~4 h，切片依次经脱蜡水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶及10%山羊血清封闭后，4 ℃孵育一抗（MPP6，1∶200）16 h、25 ℃孵育二抗2 h、DAB显色、苏木素复染细胞核，再经分化和返蓝后进行封片。免疫组化最终结果根据“染色强度（0~3分）×阳性细胞（0~4分）占比”的乘积（0~12分）判断，将中位值6分作为截断值［16］，≤6分为低表达组（n=48），>6分为高表达组（n=70）。
1.4. MPP6在HCC细胞系中的体外功能学分析
1.4.1. 细胞培养、慢病毒转染和分组
将LO2、Huh7、Hep3B、BEL-7404和SMMC-7721细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中（37 ℃，5%CO2），选择合宜的HCC细胞用于慢病毒转染。当该细胞密度达20%~30%时，分别将空载体、敲减MPP6载体（sh-GTTAGAAGAGACTGGGACAAT、sh-ACCTCCATC AAGCCCAGAAAT、sh-GTGGCAGAATTGGTTGGT ATA）转染至细胞中，实验分组为：Control、sh NC、sh MPP6-1、sh MPP6-2、sh MPP6-3。待细胞密度长到70%时使用嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞株。
1.4.2. Western blotting检测MPP6蛋白表达水平
加入裂解液裂解细胞并提取总蛋白，后经电泳、转膜、5%牛血清白蛋白25 ℃封闭2 h，一抗MPP6（1∶4000）4 ℃孵育16 h，二抗（1∶5000）25 ℃孵育1.5 h，TBST洗膜后用ECL化学发光液显影并采集图片，采用Image J软件对结果进行定量分析，以GAPDH为内参，计算MPP6的相对表达量。
1.4.3. 平板克隆实验检测MPP6对HCC细胞增殖能力的影响
将含空载体和敲减效率最佳的2组细胞以1×103/孔接种于6孔板中，培养14 d后经4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色并拍照保存，记录各组克隆数。
1.4.4. 流式细胞术检测MPP6对HCC细胞周期的影响
收集约5×105个细胞，离心弃上清。PBS洗涤后按照细胞周期试剂盒分别加入破膜剂和DNA 染色溶液，涡旋振荡5~10 s混匀。25 ℃避光孵育30 min；选择最低上样速度，以标准程序用流式细胞仪检测，实验结果采用Flow Jo软件分析。
1.4.5. 划痕实验检测MPP6对HCC细胞迁移能力的影响
将细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞生长至90%左右，用无菌的200 μL吸头划出直线划痕，PBS洗去漂浮细胞，更换为无胎牛血清的RPMI 1640培养基，分别于0 h、48 h在倒置显微镜下观察（×40）并采集照片。
1.4.6. Transwell实验检测MPP6对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响
迁移实验：无胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬各组细胞，将细胞浓度稀释为3×104/孔并滴加至上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，并于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；移除小室内培养基，经固定、染色和镜下观察（×100）并拍照后，计数迁移细胞数量。侵袭实验：在Transwell上室中预铺基质胶，其余步骤同迁移实验。
1.5. 统计学分析
使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0进行统计分析。采用t检验比较两组间计量资料的差异，采用单因素方差分析Dunnett法比较多组间差异。采用χ2检验比较计数资料的组间差异。生存曲线（K-M）采用log-rank检验比较MPP6表达水平对HCC患者预后的影响。采用Cox回归模型预测影响HCC患者术后生存的独立危险因素。P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. MPP6在HCC组织中高表达
IHC染色结果显示，MPP6主要分布于细胞质（图1A）。非配对样本差异分析显示，HCC组织MPP6高表达的比例为62.7%（74/118），高于ANT组织的20.3%（12/59）（P<0.001，图1B）；配对样本差异分析显示，HCC组织MPP6高表达的比例为50.8%（30/59），高于ANT组织的20.3%（12/59）（P<0.001，图1C）。
图1.
MPP6在HCC组织中的表达情况
Fig.1 Expression of MPP6 in HCC tissues. A: Representative images of differential expression of MPP6 in HCC and ANT tissues. B: Differential expressions of MPP6 in 118 HCC tissues and 59 ANT tissues. C: Differential expressions of MPP6 in 59 pairs of HCC and ANT tissues. ***P<0.001 vs ANT.
2.2. MPP6表达水平与患者临床病理特征的相关性
临床病理特征相关性分析结果显示，MPP6表达与年龄、性别、Child-Pugh分级、甲胎蛋白、谷丙转氨酶、谷氨酰转移酶、肿瘤大小、肿瘤数目、BCLC分期、肿瘤包膜和门静脉分支癌栓无关，而与HCC患者是否有肝硬化背景（P=0.028）以及基线白蛋白水平（P=0.035）相关（表1）。
表1.
MPP6表达与HCC患者临床病理特征的相关性分析
Tab.1 Correlation analysis between MPP6 expression and clinicopathological features of HCC patients
| Factor | n | Low MPP6 expression | High MPP6 expression | P |
|---|---|---|---|---|
| Age (year) | ||||
| ≤60 | 75 | 29 (38.7%) | 46 (61.3%) | 0.557 |
| >60 | 43 | 19 (44.2%) | 24 (55.8%) | |
| Gender | ||||
| Female | 24 | 12 (50.0%) | 12 (50.0%) | 0.298 |
| Male | 94 | 36 (38.3%) | 58 (61.7%) | |
| Hepatic sclerosis | ||||
| No | 23 | 14 (60.9%) | 9 (39.1%) | 0.028 |
| Yes | 95 | 34 (35.8%) | 61 (64.2%) | |
| Child-Pugh | ||||
| A | 109 | 42 (38.5%) | 67 (61.5%) | 0.156 |
| B | 9 | 6 (66.7%) | 3 (33.3%) | |
| Alpha-fetoprotei (ng/mL)# | ||||
| ≤20 | 53 | 19 (35.8%) | 34 (64.2%) | 0.348 |
| >20 | 63 | 28 (44.4%) | 35 (55.6%) | |
| Alanine aminotransferase (U/L) | ||||
| ≤45 | 92 | 35 (38.0%) | 57 (62.0%) | 0.273 |
| >45 | 26 | 13 (50.0%) | 13 (50.0%) | |
| Glutamyltransferase (U/L) | ||||
| ≤45 | 61 | 28 (45.9%) | 33 (54.1%) | 0.232 |
| >45 | 57 | 20 (35.1%) | 37 (64.9%) | |
| Albumin (mg/L) | ||||
| ≤40 | 55 | 28 (50.9%) | 27 (49.1%) | 0.035 |
| >40 | 63 | 20 (31.7%) | 43 (68.3%) | |
| Tumor size (cm) | ||||
| ≤5 | 65 | 29 (44.6%) | 36 (55.4%) | 0.335 |
| >5 | 53 | 19 (35.8%) | 34 (64.2%) | |
| Tumor number | ||||
| Single | 98 | 40 (40.8%) | 58 (59.2%) | 0.628 |
| Multiple | 20 | 8 (40.0%) | 12 (60.0%) | |
| Tumor capsule | ||||
| Complete | 3 | 1 (33.3%) | 2 (66.7%) | 0.793 |
| Incomplete | 115 | 47 (40.9%) | 68 (59.1%) | |
| Portal vein branch tumor thrombus | ||||
| Yes | 5 | 1 (20.0%) | 4 (80.0%) | 0.336 |
| No | 113 | 47 (41.6%) | 66 (58.4%) | |
| BCLC staging | ||||
| 0-A | 49 | 24 (49.0%) | 25 (51.0%) | 0.127 |
| B-C | 69 | 23 (33.3%) | 46 (66.7%) |
#Alpha-fetoprotein data are available in 116 patients.
2.3. MPP6高表达与HCC患者预后不良相关
生存分析结果显示，HCC术后患者预后在MPP6高表达者组较低表达者组更差（P<0.001，图2）。单因素Cox分析结果显示，MPP6蛋白表达水平（P<0.001）及肿瘤大小（P=0.024）与HCC术后患者OS相关（表2）；多因素Cox分析显示，MPP6蛋白表达水平是HCC术后患者OS的独立预测因素（P=0.012，表3）。
图2.
MPP6不同表达水平下HCC患者的OS生存曲线
Fig.2 Survival curve for overall survival (OS) of HCC patients with low and high MPP6 expression levels.
表2.
HCC术后患者OS预后因素的单因素Cox回归分析
Tab.2 Univariate Cox regression analysis of prognostic factors for OS in postoperative HCC patients
| Factor | n | HR | 95%CI | P |
|---|---|---|---|---|
| Age (year) | ||||
| ≤60 | 75 | 1.404 | 0.932-2.114 | 0.105 |
| >60 | 43 | |||
| Gender | ||||
| Female | 24 | 1.027 | 0.621-1.697 | 0.919 |
| Male | 94 | |||
| Hepatic sclerosis | ||||
| No | 23 | 0.769 | 0.471-1.257 | 0.295 |
| Yes | 95 | |||
| Child-Pugh | ||||
| A | 109 | 0.925 | 0.448-1.912 | 0.834 |
| B | 9 | |||
| Alpha-fetoprotei (ng/mL)# | ||||
| ≤20 | 53 | 0.746 | 0.500-1.113 | 0.151 |
| >20 | 63 | |||
| Alanine aminotransferase (U/L) | ||||
| ≤45 | 92 | 1.441 | 0.909-2.287 | 0.120 |
| >45 | 26 | |||
| Glutamyltransferase (U/L) | ||||
| ≤45 | 61 | 1.464 | 0.983-2.180 | 0.061 |
| >45 | 57 | |||
| Albumin (mg/L) | ||||
| ≤40 | 55 | 1.064 | 0.712-1.591 | 0.761 |
| >40 | 63 | |||
| Tumor size (cm) | ||||
| ≤5 | 65 | 1.578 | 1.062-2.346 | 0.024 |
| >5 | 53 | |||
| Tumor number | ||||
| Single | 98 | 1.297 | 0.786-2.140 | 0.309 |
| Multiple | 20 | |||
| Tumor capsule | ||||
| Complete | 3 | 2.083 | 0.655-6.623 | 0.214 |
| Incomplete | 115 | |||
| Portal vein branch tumor thrombus | ||||
| Yes | 5 | 2.437 | 0.985-6.028 | 0.054 |
| No | 113 | |||
| BCLC staging | ||||
| 0-A | 49 | 1.497 | 0.995-2.251 | 0.053 |
| B-C | 64 | |||
| Postoperative treatment | ||||
| No | 42 | 0.771 | 0.511-1.612 | 0.214 |
| Yes | 76 | |||
| MPP6 Expression | ||||
| Low | 48 | 2.450 | 1.584-3.788 | <0.001 |
| High | 70 |
#Alpha-fetoprotein data are available in 116 patients.
表3.
HCC术后患者OS预后因素的多因素Cox回归分析
Tab.3 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors for OS in postoperative HCC patients
| Factor | n | HR | 95% CI | P |
|---|---|---|---|---|
| Tumor size (cm) | ||||
| ≤5 | 65 | 1.405 | 0.941-2.098 | 0.096 |
| >5 | 53 | |||
| MPP6 Expression | ||||
| Low | 48 | 2.335 | 1.502-3.629 | 0.012 |
| High | 70 |
HR: Hazard ratio; CI: Confidence interval.
2.4. 成功构建稳定敲减MPP6基因的Hep3B细胞模型
Western blotting结果显示，与正常肝细胞LO2相比，Huh7、Hep3B、BEL-7404、SMMC-7721四种HCC细胞中的MPP6蛋白表达量均升高（P<0.05，图3A）。鉴于Hep3B细胞表达量适宜，后续以该细胞为主要细胞学工具。慢病毒转染后，sh MPP6-1和sh MPP6-3组细胞的MPP6表达水平下降（均P<0.001，图3B），提示稳定敲减MPP6基因的Hep3B细胞模型构建成功。
图3.
敲减MPP6基因的Hep3B细胞筛选与构建
Fig.3 HCC cell screening and construction of Hep3B cells with MPP6 gene knockdown. A: Western blotting for detecting expression level of MPP6 in different HCC cell lines (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs LO2 cells). B: Western blotting for assessing efficiency of MPP6 gene knockdown in Hep3B cells (***P<0.001 vs sh NC).
2.5. 敲减MPP6基因抑制Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭
克隆形成实验结果显示，与sh NC组相比，sh MPP6-1组（P=0.007）和sh MPP6-3组（P=0.016）的克隆形成数目减少（图4A）；划痕实验结果显示，相对于sh NC组，sh MPP6-1和sh MPP6-3组48 h的细胞划痕愈合率降低（P<0.001，图4B）；Transwell实验结果显示，sh MPP6-1和sh MPP6-3组细胞迁移和侵袭数较sh NC组减少（P<0.001，图4C）。
图4.
敲减MPP6基因对Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的影响
Fig.4 Effect of MPP6 knockdown on proliferation, migration and invasion of Hep3B cells. A: Colony formation assay for assessing cell proliferation following MPP6 knockdown. B: Wound-healing assay for assessing migration ability of Hep3B cells with MPP6 knockdown (Original magnification: ×40). C: Transwell assay for assessing migration and invasion capabilities of Hep3B cells with MPP6 knockdown (×100). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs sh NC.
2.6. 敲减MPP6基因致Hep3B细胞G0/G1期阻滞
细胞周期实验显示，与sh NC组相比，sh MPP6-1组的G0/G1期细胞数量增加，而S期和G2/M期细胞的比例降低（P<0.001）；sh MPP6-3组的G0/G1期细胞数量增加，S期细胞占比下降（P<0.001），而G2/M期细胞占比虽有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05，图5）。
3. 讨论
本研究通过临床样本分析证实，MPP6在HCC组织中显著高表达，且其表达水平与HCC患者的关键临床病理特征和不良预后密切相关。Kaplan-Meier生存分析表明，MPP6高表达的HCC患者预后较差。单因素及多因素Cox分析进一步证实，MPP6高表达是影响HCC术后患者OS的独立危险因素。体外细胞学实验表明，敲减MPP6基因能够抑制HCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力并阻滞细胞周期于G0/G1期。
既往研究表明，MPP6在不同肿瘤类型中的作用存在差异：在胰腺导管腺癌相关成纤维细胞中发挥促瘤作用［13］，而在卵巢癌中则表现出抑癌效应，其低表达与患者不良预后相关［12］。然而，MPP6在胰腺导管腺癌和卵巢癌中的具体调控机制尚不明确。与上述研究聚焦的癌种不同，本研究专注于MPP6在HCC中的作用。本团队前期基于公共数据库的分析揭示MPP6在HCC中高表达且与患者恶性表型及不良预后相关［14］。然而，该发现仅限于生物信息学预测层面，缺乏来自独立临床队列的样本验证，尤其是MPP6蛋白表达水平与HCC患者预后的直接临床证据尚未确立。本研究通过独立的研究者队列，不仅利用临床样本证实了MPP6在HCC组织中的高表达及其与患者不良预后的关联性，更进一步通过体外功能学实验在细胞水平证实了MPP6对HCC细胞恶性表型的促进作用，并据此提出MPP6可能通过调控DNA复制和细胞周期等通路促进HCC进展的新假设。这些发现深化了对MPP6在HCC中致癌作用的认识，并为探索其分子机制提供了新方向。
在临床病理特征关联方面，本研究也提供了新的发现：前期研究利用TCGA数据库的分析表明，MPP6的表达水平与T分期、病理学分期和组织学分级密切相关［14］。本研究基于中国人群的研究者队列分析则进一步揭示，MPP6的高表达还与患者肝硬化病史以及基线白蛋白浓度存在相关性。本研究与TCGA数据库结果在关联特征上存在差异，推测其原因可能与样本的种族异质性有关，TCGA数据库的数据主要基于欧美人群，而本研究样本则来源于中国人群。这一发现提示MPP6的临床意义可能具有人群特异性，值得在更大规模的族群研究中验证。此外，本课题组前期基于数据库的研究表明，MPP6的表达水平与血管生成相关因子（如VEGFA、VEGFR2和CD34）的表达显著正相关［14］，且已知VEGF/VEGFR信号在诱导血管生成中发挥核心作用［17］，而血管生成及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是影响HCC进展和患者预后的关键因素［18-20］。基于以上研究基础，结合本研究发现的MPP6与临床病理特征、不良预后及体外促恶性功能的关联，我们推测MPP6可能通过刺激受损肝细胞如存在肝硬化背景的肝脏组织的血管生成，加剧肝细胞的恶性行为，最终导致HCC患者不良预后结局。
包括HCC在内的多种肿瘤的发生发展与细胞周期紊乱［21-23］及DNA复制调控异常［24］密切相关，这些使得肿瘤细胞获得持续增殖的能力［25］。本研究旨在前期生物信息学研究基础上［14］，通过细胞学实验进一步验证MPP6对HCC细胞生物学功能的影响。实验结果显示，敲减MPP6基因抑制了Hep3B细胞的增殖能力。流式细胞术分析进一步揭示，MPP6基因敲减导致细胞周期在G0/G1期发生阻滞。这些实验结果在功能层面证实了MPP6对HCC细胞周期进程的调控作用，与前期基于数据库的分析结果高度一致，共同支持了MPP6可能通过干扰DNA复制稳态和破坏细胞周期调控来影响HCC进展的假设。
Wnt信号通路是肿瘤发生发展过程中的关键调控通路，其异常激活被证实广泛参与HCC细胞的增殖、分化、迁移等生物学过程［26-28］。本团队前期基于TCGA的基因集分析结果显示，MPP6的高表达水平与DNA复制、细胞周期以及Wnt信号传导通路相关的基因集富集显著相关［14］。结合本研究中发现的MPP6对细胞周期的调控作用，提示MPP6有可能通过Wnt信号通路或其交叉调控网络影响HCC进展。然而，MPP6是否以及如何直接调控Wnt通路的具体分子机制，目前仍缺乏实验证据，这是本研究后续需重点探索的方向。
本研究存在一定局限性：首先，临床样本来自单中心，尚需大规模、多中心的研究进一步验证；其次，缺乏体内实验数据以更全面地评估MPP6在动物水平上以及肿瘤微环境中促进HCC恶性进程的作用；最后，关于MPP6是否以及如何调控Wnt通路或其他下游信号通路的分子机制尚不明确，需深入机制研究阐明。
综上，本研究通过独立临床队列和体外功能实验，发现MPP6在HCC组织中高表达，与HCC患者关键临床病理特征、不良预后相关，且是OS的独立危险因素；敲减MPP6基因可显著抑制HCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力并诱导G0/G1 期阻滞。这提供了MPP6新的临床关联特征和细胞功能证据，支持MPP6作为HCC新型预后生物标志物和潜在治疗靶点。
基金资助
安徽省高校自然科学研究重点项目（2024AH051288）；安徽省教育厅新时代育人质量工程项目（2024xscx134）；安徽省高校自然科学研究创新团队项目（2025AHGXZK10010）
参考文献
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