独立型常染色体显性多囊肝家系的临床及遗传学分析

Abstract

Objective

To analyze and clarify the clinical and pathogenic gene variation and genetic etiology of polycystic liver disease.

Methods

The proband clinical data and family history were collected. Whole-exome sequencing technology was used to detect the proband gene variations. Fluorescence quantitative PCR validation was performed on the proband and his family to screen out pathogenic gene variation.

Results

A multiple liver cyst was found in an 18-year-old male proband during a physical examination. There were no abnormalities in his liver function, and both his father and grandfather had multiple liver cysts without any obvious discomfort or other special manifestations. Whole exome sequencing suggested a heterozygous deletion in exon 1 (Exon 1) of the SEC63 gene in the proband. Real-time fluorescence quantitative PCR confirmed that the heterozygous deletion variation of the SEC63 gene Exon 1 of the proband came from his father, and the same heterozygous deletion was detected in his grandfather. The gene variant had a pathogenic variation that had been rarely reported before and was in accordance with the the American college of Medical Genetics and Genomics (ACMG) guidelines.

Conclusions

The genetic etiology of this autosomal dominant polycystic liver disease has been clarified, and the heterozygous deletion of Exon1 of the SEC63 gene is a newly discovered gene variation that broadens the variation spectrum of the SEC63 gene.

多囊肝（polycystic liver disease，PLD）是一类以进行性胆管扩张和囊肿发展为特征的单基因遗传病，最早由Bristowe于1856年提出，常伴随其他脏器尤其是肾脏的多囊病变，囊肿形成与胆管上皮初级纤毛发育异常导致胆管上皮细胞过度扩增和液体分泌过多有关^［1］。患者起病比较隐匿，早期无症状，30岁后可因肝脏囊肿体积增大出现腹部胀痛、腹部包块、呼吸困难，少数患者可并发囊肿破裂、感染及出血等。根据是否合并多囊肾，多囊肝可以分为两类：伴发于常染色体显性多囊肾或常染色体隐性多囊肾的多囊肝和独立型常染色体显性多囊肝。独立型常染色体显性多囊肝相对比较罕见，发病率为1∶100 000，国内尚鲜见报道，目前已知致病基因包括PRKCSH、SEC63、ALG8、SEC61B和GANAB等^［2-4］。本研究针对一个独立型多囊肝家系，采用全外显子组测序筛查出先证者可疑致病基因变异，实时荧光定量PCR对疑似致病变异基因进行验证，明确了该多囊肝家系的遗传学病因，同时发现了一个新的SEC63基因变异。

资料与方法

1. 临床资料：先证者男性（Ⅲ-1），29岁，10年前体检时发现肝脏存在多发囊肿，后不定期复查肝脏彩色多普勒超声，最近一次彩色多普勒超声提示肝脏形态失常，内可见多个囊性回声，其中一个范围约67 mm×16 mm，囊腔互不连通，内透声可（图1）。实验室检查结果显示，丙氨酸转氨酶：12 U/L（正常参考值0～40 U/L），天冬氨酸转氨酶：18 U/L（正常参考值0～40 U/L），甲胎蛋白：2.41 µg/L（正常参考值1～10 µg/L），父亲（Ⅱ-3）、姑母（Ⅱ-1）和祖父（Ⅰ-1）肝脏均存在多发囊肿，肝功能正常且均无特殊不适，母亲及其他家属体健无特殊（图2）。本研究获得郑州大学第一附属医院伦理委员会批准（KS-2018-KY-36），获得先证者及其父母知情同意。

图1. 多囊肝患者肝脏彩色多普勒超声结果.

注：红色箭头处可见多个囊性回声

图2. 常染色体显性多囊肝家系图谱.

注：先证者及其父亲、大姑和祖父均为患者

2. 标本采集及DNA提取：经知情同意后，抽取先证者及其父亲和祖父静脉血2 ml置于EDTA抗凝管，4 ℃保存。基因组DNA提取试剂盒（购自德国Qiagen公司）提取先证者及其家系成员基因组DNA，分光光度计检测基因组DNA浓度和纯度，-20 ℃保存。

3. 全外显子组测序：取先证者全基因组DNA 200 ng，采用Illumina DNA Prep with Enrichment试剂盒（购自美国Illumina公司）构建文库。取500 ng文库和探针进行杂交，捕获目标区域DNA文库后进行扩增、纯化、定量和质量检测，在Illumina NovoSeq6000测序仪上进行测序。使用Illumina Dynamic Read Analysis for GENomics Bio-IT平台将测序原始下机数据拆分为Fastq文件；采用上海瀚垚生物医学亿解基因数据解读系统对变异位点进行注释和解读。依据美国医学遗传学与基因组学学会标准和指南^［5］对基因变异致病性进行评级。

4. 实时荧光定量PCR验证：针对筛选出的疑似致病变异基因，根据SEC63基因第1外显子及下游第2外显子编码区序列设计引物（表1）。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参照基因、先证者母亲为对照，按DNA 25 ng、引物1 μl、SYBR酶Mix 10 μl、Low ROX 0.4 μl和双蒸水8.27 μl共20 μl体系；退火温度63 ℃，40个循环，在ABI QuantStudio5实时荧光定量PCR仪上进行定量PCR扩增。

表1. SEC63基因外显子引物序列及目的片段大小.

外显子	引物序列		产物片段 （bp）
	上游引物	下游引物
1	5’-AGGTTGATCTCTTGGGGGAAACA-3’	5’-GTCCCCAAGTTTCCTGAAGTGC-3’	219
2	5’-AACTATTAGCGTGGTAATGAAGGT-3’	5’-AATCTGTTCAGACTGTTCCCACA-3’	363

结果

1.全外显子组测序结果及基因变异致病性分析：全外显子组测序结果提示先证者SEC63基因第1外显子（Exon1）存在杂合缺失（图3）。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南，SEC63基因Exon1杂合缺失可判定为致病变异（PVS1+PM2_supporting+PP4），证据如下：一个非常强致病性证据：PVS1（该变异导致编码蛋白结构改变影响蛋白功能）；两个支持证据：PM2_Supporting（该变异在人群基因组突变频率数据库和参考人群千人基因组中没有发现）和PP4（该基因变异携带者表型和家族史均高度符合常染色体显性多囊肝）。

图3. 先证者SEC63基因21个外显子拷贝数情况.

注：normal：正常；VUS：意义未明；SEC63基因第1外显子杂合缺失

2.实时荧光定量PCR结果：先证者SEC63基因Exon1存在杂合缺失，Exon2拷贝数未见异常（图4）；先证者父亲和祖父与先证者均存在SEC63基因Exon1杂合缺失（图5）。

图4. SEC63基因第1外显子和第2外显子实时荧光定量PCR结果.

注：SEC63E：SEC63基因外显子；先证者SEC63基因第1外显子定量值为0.5，第2外显子为1，对照均为1

图5. SEC63基因第1外显子实时荧光定量PCR结果.

注：自左向右依次为健康对照、先证者、先证者父亲和祖父，其定量值依次为1、0.5、0.5、0.5

讨论

SEC63基因位于6q21，含21个外显子，编码蛋白包含760个氨基酸。SEC63蛋白包含3个跨膜结构域，其中内质网内J结构域与SEC62相互作用促进前体多肽通过SEC61通道向内质网转运，参与内质网内糖蛋白的成熟和易位^［6-7］。SEC63基因变异可导致SEC63蛋白功能异常，影响多囊蛋白1的生物合成和定位^［3，8］，而多囊蛋白1和多囊蛋白2均为纤毛膜上的跨膜蛋白，可形成复合物参与调控囊肿形成的重要信号转导通路^［8］。因此，作为一个内质网相关致病基因，SEC63基因通过调控多囊蛋白1的合成及其在初级纤毛上的定位参与肝脏囊肿形成。截至目前，HGMD数据库收录多囊肝相关SEC63基因变异共37个，包含无义变异、错义变异、剪接区变异及微缺失微重复变异^［9-11］。

目前，多囊肝的诊断主要依据影像学检查，超声是最常用的影像学方法。根据囊肿的分布、数量和肝实质体积，Gigot等将多囊肝分为3型：Ⅰ型：囊肿直径＞10 cm，数目＜10个；Ⅱ型：肝实质内弥漫分布中等大小的囊肿，大部分为肝实质；Ⅲ型：肝实质内弥漫分布小或者中等大小的囊肿，肝实质只占小部分^［12］。Gigot Ⅱ型和Ⅲ型多囊肝影像学表型比较典型，囊肿分布累及全肝，临床诊断相对简单，Gigot Ⅰ型影像学表现多不典型，需要与多发单纯性肝囊肿鉴别。多囊肝可由多囊肾相关基因PKD1/PKD2基因或独立型多囊肝基因如PRKCSH/SEC63等基因突变所致，因此分子诊断成为诊断多囊肝的相对特异性方法。

本研究中先证者无症状情况下体检时超声发现肝脏存在多发囊肿，因先证者父亲和祖父均存在多囊肝，考虑为基因突变所致家族性多囊肝可能性大。全外显子组测序提示先证者SEC63基因Exon1存在杂合缺失，实时荧光定量PCR证实先证者SEC63基因Exon1杂合缺失遗传自其父亲和祖父。Müller等^［13］报道发现SEC63蛋白C端26个氨基酸（为第1外显子编码）可与SEC62蛋白N端结构域直接相互作用发挥生物学功能，因此SEC63基因Exon1杂合缺失可导致SEC63蛋白功能异常。经检索人类基因突变数据库、Clinvar数据库及NCBI数据库，该缺失变异未见报道，为新发现的变异。

多囊肝目前无有效治疗方法，治疗策略旨在缩小肝脏体积，缓解症状以提高患者生存质量。大多数多囊肝患者临床症状不明显，无需治疗，有症状患者可给予药物和外科治疗。药物主要使用生长抑素类似物（如奥曲肽）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂及其他对症治疗，但疗效有待验证；外科治疗包括囊肿穿刺引流联合硬化剂注射、囊肿开窗术、选择性肝动脉栓塞、肝切除及肝移植等^［14-15］，但易发生并发症，复发率较高，远期疗效不理想。根据2022年欧洲肝病学会临床实践指南^［16］，考虑到本研究多囊肝家系尚未出现症状，经咨询建议患者定期复查，余无需特殊治疗。

综上所述，本研究明确了一个独立型多囊肝家系的遗传学病因，SEC63基因Exon1杂合缺失为新发现的变异，丰富了SEC63基因变异谱，同时也为患者临床诊断、治疗及预后评估提供了依据，但该变异对SEC63蛋白生物学功能的影响及其在肝囊肿形成中的作用机制尚待进一步研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

引用本文：

苏利沙, 刘宁, 孔祥东. 独立型常染色体显性多囊肝家系的临床及遗传学分析[J]. 中华肝脏病杂志, 2024, 32(10): 935-939. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20230825-00069.

作者贡献声明

苏利沙：论文撰写、数据整理；刘宁：材料支持、指导研究；孔祥东：指导及支持性贡献