基于光纤光度检测技术对经颅磁声电刺激影响APP/PS1小鼠海马CA1区突触可塑性的研究

Abstract

Transcranial magneto-acoustic electrical stimulation (TMAES) is a non-invasive novel neuromodulation technique based on the magneto-acoustic coupling effect. In this study, we employed APP/PS1 transgenic mice as an experimental model, targeting the hippocampus. Cognitive function was assessed through behavioral tests, while neuronal morphology was examined using hematoxylin-eosin and Golgi staining. Additionally, fiber photometry was utilized to measure calcium transient intensity in the CA1 region. By investigating the effects of TMAES on synaptic plasticity in the hippocampus, we aimed to elucidate its potential regulatory mechanisms in improving cognitive function in AD mice. Behavioral results showed that the cognitive and memory abilities of mice in the AD+sham group were significantly lower than those in the WT+sham group, while TMAES intervention could significantly improve the cognitive function of mice in the AD+TMAES group. Morphological detection indicated that the number of pyramidal neurons and the density of dendritic spines in the hippocampal CA1 region of the AD+sham group were decreased, with an increased proportion of immature spines; all the above indicators were significantly improved after TMAES intervention. Fiber photometric detection revealed that the calcium activity and calcium amplitude of neurons in the CA1 region of the AD+TMAES group were significantly enhanced compared with those of the AD+sham group. Pearson correlation analysis showed that cognitive level was positively correlated with calcium amplitude, dendritic spine density, and mature spine proportion. Meanwhile, calcium amplitude was positively correlated with dendritic spine density and mature spine proportion. Therefore, TMAES may alleviate the damage to synaptic plasticity in the hippocampal CA1 region of APP/PS1 mice by regulating the function of calcium ion channels, thereby improving cognitive impairment.

0. 引言

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种与年龄相关的进行性神经退行性疾病，其典型病理特征为β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）异常沉积，核心临床表现为以记忆衰退为主的认知功能损伤，并伴随生活自理能力进行性下降^[1-3]。大脑神经元功能障碍被认为是导致AD患者及模型动物记忆功能缺损的关键因素之一^[4-5]。而海马体作为大脑边缘系统的核心脑区，是记忆编码、储存与提取的关键中枢，其结构与功能完整性对认知功能至关重要^[6-7]。已有研究证实，AD患者和模型鼠中均观察到海马及海马旁区发生选择性突触丢失，这种突触可塑性损伤与认知功能下降密切相关^[8-11]。因此，改善海马区神经元突触可塑性损伤可能是延缓AD认知障碍进展的有效干预策略^[12]。

研究表明，钙稳态失调在AD的病理生理进程中扮演着关键角色^[13]。作为细胞内核心信号分子，钙离子不仅可调控细胞存活、增殖、分化、转录及凋亡等多条基础生理信号通路，其介导的钙信号传导更是记忆形成的核心调控机制之一^[14]。已有研究证实，突触前钙离子流入与浓度动态变化通过精准调控神经递质释放，构成介导长期突触可塑性及相关长期记忆的关键通路，而适度升高的胞内钙离子浓度可显著增强海马CA1区锥体神经元远端树突的突触可塑性^[15-16]。

近年来，非侵入性脑刺激技术已成为神经调控领域干预神经退行性疾病认知与功能障碍的研究热点，为相关疾病的治疗提供了新型策略^[17-19]。已有研究证实，经颅磁刺激、经颅超声刺激及经颅磁声电刺激（transcranial magneto-acoustic electrical stimulation，TMAES）等技术均能够增强大脑认知相关脑区的神经活性^[20-23]。与经颅磁刺激相比，TMAES和经颅超声刺激具有空间分辨率高、穿透深度大的优势，可实现深部脑组织的精准靶向刺激^[24]。且在相同超声强度条件下，TMAES对正常小鼠前额叶皮层神经元簇钙稳态的调控及海马区突触可塑性的改善效果均优于经颅超声刺激，提示TMAES在AD干预中可能具有更显著的应用潜力^[25-27]。然而，TMAES通过何种具体机制调控AD相关的突触可塑性损伤进而改善认知功能，目前尚未完全阐明。

本研究旨在探究TMAES对AD认知功能及突触可塑性损伤的潜在作用机制。通过新物体识别和Y迷宫自主交替两种行为学实验评估小鼠认知功能状态。采用苏木素-伊红染色及Golgi-Cox染色技术观察海马CA1区锥体神经元形态及突触结构特征。运用光纤光度检测技术监测海马CA1区神经元簇的细胞内钙浓度变化。同时，结合皮尔逊相关分析检验各检测指标间的统计关联性，进而探讨TMAES发挥作用的潜在作用机制，为TMAES成为AD无创神经调控治疗的新型手段提供实验依据与理论支撑。

1. 材料和方法

1.1. 实验动物

实验动物为SPF级雄性C57BL/6J小鼠8只、APP/PS1小鼠16只，均4月龄，体重25～35 g。实验小鼠均购自北京华富康生物科技有限公司［SCXK（jing）2019-0008］。小鼠置于12 h光照-黑暗循环中，温度（25 ± 2）℃，湿度50%～65%，自由进食和饮水。将小鼠分为WT+sham组（C57BL/6J）、AD + sham组（APP/PS1）和AD+TMAES组（APP/PS1），每组8只。本实验经河北工业大学生物医学伦理委员会（HEBUTaCUC2022063）批准。

1.2. 病毒注射和光纤植入手术

本研究使用的病毒为raav-camkiia-gcamp6m-wpre-high-polya（武汉索米科技有限公司），以4%异氟醚诱导麻醉小鼠，并将其固定于立体定位仪，后续维持1%异氟醚麻醉状态下进行手术。剃除头部皮毛后，剪开头皮暴露颅骨。在CA1区正上方位置颅骨钻一个小孔，将AAV载体（200 nL）通过连接微量注射泵（KDS LEGATO 130，RWD Life Science，中国）的玻璃微管（外径1.5 mm，内径0.86 mm）注射到小鼠海马CA1区（AP：2.70 mm，ML：2.40 mm，DV：–1.70 mm）。注射病毒后，在注射部位（DV：–1.65～–1.68 mm）植入外径200 μm的光纤陶瓷套管，并将陶瓷套管用牙科水泥固定在颅骨上。

1.3. 经颅磁声电刺激

在病毒表达稳定后两周进行TMAES实验。在刺激期间，小鼠被固定在立体定位仪中，并在整个过程中保持1%异氟醚的轻度麻醉。使用波形发生器和射频功率放大器产生超声波，然后通过超声换能器和准直器聚焦到小鼠海马上。AD+TMAES组静磁场强度为0.1 T，超声脉冲重复频率为1 kHz，基波周期为100次，脉冲重复100次，基波振幅为500 mV。每次刺激5 min，每天1次，连续14 d。WT+sham组和AD+sham组施加伪刺激。刺激完成后进行新物体识别实验和Y迷宫自主交替实验，随后进行Golgi-Cox染色和苏木素-伊红染色。

1.4. 行为学实验

本研究通过新物体识别实验和Y迷宫自主交替实验衡量小鼠的认知记忆能力。新物体识别实验包括四个阶段：适应期、熟悉期、测试I期和测试II期（具体实验流程参见附件1）。认知指数为探索新物体时间与探索新、旧物体总时间的比值，是空间学习和记忆重要评估指标，认知指数越大表示认知功能越强。Y迷宫交替行为实验是一种评估空间工作记忆的实验方法。在进行Y迷宫交替行为测试时，将小鼠放置在Y迷宫的三个臂交汇处，如果小鼠在Y迷宫中连续三次进入不同的臂则视为完成了一次自发交替行为。

1.5. Golgi-Cox染色实验

在本实验中，使用FD Rapid GolgiStain™Kit将新鲜解剖的脑组织浸泡在AB混合溶液中14天（在黑暗中保存），然后转移到溶液C中3天。用振动切片机将脑组织切片成150 µm的薄片，随后脑切片在D、E混合物中孵育10 min，然后在50%、75%、95%乙醇和无水乙醇中脱水。最后，脑切片在二甲苯中透明。

1.6. 苏木素-伊红染色实验

将包埋的脑组织置于预冷的冷冻切片机上，切片成8～12 µm的薄片。脑切片苏木素染色3～5 min，自来水冲洗5～10 min。随后在1%盐酸溶液中分化数秒，然后在0.6%氨溶液中孵育10 min，直至颜色变为蓝色，然后用伊红染色30 s。最后在无水乙醇中脱水4 min，在二甲苯中透明2～3 min。

1.7. 光纤光度检测

钙敏感蛋白GCaMP6通过检测荧光强度的变化可有效地表征神经元活动^[28]。本研究采用光纤光度法测量实时TMAES对CA1海马神经元胞内钙活性的影响。使用光纤测光系统（南京前奥星科生物科技有限公司）采集和分析GCaMP信号，系统通过光纤电缆与植入小鼠大脑的光纤陶瓷套管相连。通过发射480 nm激光束，刺激GCaMP表达，捕获GCaMP激发出的荧光，并使用多功能数据采集软件（南京奇诺辛克生物技术有限公司）记录荧光信号，输出信号通过低通滤波器（40 Hz）后以500 Hz频率采样。光纤光度检测系统连续记录5 min新物体识别测试（测试I期和测试II期）中的荧光信号，并选择探索行为前2 s和行为后10 s的信号数据进行分析。钙振幅可量化分析事件周围荧光强度的相对变化^[29]，其表达式如下：

1

其中为实时记录的钙信号，为钙信号的基值（参考时间内钙信号的平均值），为当前钙信号分析通道的系统偏置数据。为了量化钙信号的累积效应以研究钙信号在神经元中的刺激或抑制作用，计算了荧光信号探索事件期间的曲线下面积（area under the curve，AUC）。

1.8. 皮尔逊相关性分析

皮尔逊相关系数用于衡量两个变量的线性相关程度，其取值范围为–1～1。系数接近1为强正线性相关，接近–1为强负线性相关，等于0则无线性相关。为了探究认知功能与钙浓度、树突棘形态之间的关系，分别计算了认知指数与钙振幅、树突棘密度、成熟棘比例之间的相关性。为进一步探究钙浓度与树突棘形态之间的关系，分别分析了钙振幅与树突棘密度、成熟棘比例之间的相关性。

1.9. 统计分析

结果以均值±标准误（standard error of the mean，SEM）表示。使用SPSS进行统计分析，GraphPad Prism 6生成图表。多重比较采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析，检验水准为0.05。

2. 结果

2.1. 行为学实验结果

2.1.1. 新物体识别实验结果

新物体识别测试结果显示，AD小鼠的认知指数在测试I期和测试II期期间均有所下降，表现出明显的认知记忆障碍，单因素方差分析结果具有统计学意义［测试I期：F（2，21）= 15.16，P < 0.000 1；测试II期：F（2，21）= 15.16，P < 0.000 1］，结果如图1所示。在整个新物体识别测试阶段，WT小鼠较AD小鼠表现出更强的新物体探索行为。在测试I期中，AD小鼠的认知指数明显低于WT小鼠，TMAES刺激后AD小鼠的认知指数显著提高，短期记忆能力增强。在测试II期中，AD + TMAES组表现出类似的趋势。综上所述，AD小鼠存在显著的认知功能减退及学习记忆能力下降，而TMAES可有效改善AD小鼠的短期记忆与长期记忆障碍（各样本原始数据参见附件2）。

图 1.

Results of the novel object recognition experiment (^*P < 0.05, ^***P < 0.001, ^****P < 0.000 1)

新物体识别实验结果（^*P < 0.05，^***P < 0.001，^****P < 0.000 1）

2.1.2. Y迷宫自主交替实验结果

在Y迷宫自主交替实验中，本文评估了TMAES对AD小鼠空间工作记忆能力的影响。通过单因素方差分析，自发交替行为的结果具有显著的组间差异，包括自发交替率［F（2，21）= 56.33，P < 0.000 1］与总自发交替次数［F（2，21）= 12.23，P < 0.001］，结果如图2所示。WT + sham组小鼠展现出了高效的自发交替率，反映了良好的空间记忆能力。相比之下，AD + sham组小鼠自发交替率明显下降，说明AD小鼠在空间记忆上存在明显损伤，而接受TMAES刺激的AD小鼠自发交替率显著上升。总交替次数在AD + sham组和AD + TMAES组间无显著差异，排除运动能力对结果的干扰，说明TMAES对AD小鼠的空间记忆有积极影响，可能部分逆转了AD引起的学习和记忆障碍（各样本原始数据参见附件3～4）。

图 2.

Results of the Y-maze spontaneous alternation test

Y迷宫自主交替实验实验结果

a. 自发交替率；b. 总交替次数。^**P < 0.01，^***P < 0.001，^****P < 0.000 1

a. spontaneous alternation rate; b. total number of alternations. ^**P < 0.01, ^***P < 0.001, ^****P < 0.000 1

2.2. Golgi-Cox染色结果

在本研究中，采用Golgi-Cox染色法评估WT + sham组、AD + sham组和AD + TMAES组小鼠海马CA1区树突棘形态及发育程度，图3显示了100倍放大的海马全域Golgi-Cox染色结果和相应1 000倍放大的单个树突棘灰度图。每组随机选取4只小鼠进行Golgi-Cox染色，每只小鼠选取2～4个形态明显的树突。研究结果表明，三组间树突棘密度结果具有统计学意义［F（2，21）= 9.07，P < 0.01］。与WT + sham组比较，AD + sham组树突棘密度降低。经TMAES治疗后，AD小鼠树突棘密度增加。为了进一步分析TMAES对CA1锥体神经元树突棘发育的影响，对比了四种树突棘类型（丝状伪足型、瘦长型、蘑菇型和粗短型）的比例。丝状伪足型和瘦长型代表未成熟状态，而蘑菇型和粗短型代表成熟状态。AD + TMAES组成熟树突棘比例较AD + sham组提高9.73%。实验结果表明，TMAES可改善AD小鼠突触缺失，促进CA1锥体神经元树突棘成熟，增强神经元突触可塑性（各样本原始数据参见附件5～6）。

图 3.

Results of the Golgi-Cox staining (^*P < 0.05, ^**P < 0.01)

Golgi-Cox染色结果（^*P < 0.05，^**P < 0.01）

2.3. 苏木素-伊红染色结果

为了定量评估CA1区锥体细胞的数量，采用苏木素-伊红染色法测定WT+sham、AD+sham和AD+TMAES小鼠海马CA1区单位面积（1 µm²）的锥体神经元细胞密度。每组随机选取4只小鼠进行苏木素-伊红染色，对每块脑切片CA1区中部和背侧区域进行分析。图4为各组海马CA1区苏木素-伊红染色结果［F（2，21）= 14.82，P < 0.000 1］。研究结果显示，AD组CA1区锥体细胞密度显著降低，说明AD小鼠海马区发生神经元病变。AD+TMAES组锥体细胞密度增加但较WT组仍明显较低，说明TMAES可有效减轻AD小鼠海马CA1区的神经元损伤，但无法使其恢复到正常水平。这些结果表明，TMAES可能通过减少海马CA1区域的锥体细胞神经元损失来改善AD相关的认知缺陷（各样本原始数据参见附件7）。

图 4.

Results of the hematoxylin-eosin staining (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^****P<0.000 1)

苏木素-伊红染色结果（^*P<0.05，^**P<0.01，^****P<0.000 1）

2.4. 光纤光度检测结果

采用光纤记录系统监测表达钙离子浓度敏感蛋白GCaMP6在新物体识别任务中的变化。图5描述了新目标识别任务测试I期和测试II期期间CA1锥体细胞钙活性变化。研究结果显示测试I期阶段，AD小鼠神经元胞内平均钙振幅明显低于WT小鼠。刺激后，AD小鼠的平均钙振幅增加4.3%。重复试验的AUC结果也表现出明显的组间差异［F（2，21） = 4.21，P < 0.05］。测试II期阶段平均钙振幅和对应的AUC结果与测试I期一致，说明TMAES刺激可增强AD小鼠的钙活性。AD小鼠海马CA1锥体神经元细胞内钙活性的变化趋势与其在新物体识别任务中的认知表现一致。AD + TMAES小鼠在新物体探索期间，神经元钙活性显著升高，说明TMAES增强了AD小鼠对新物体刺激的反应，提高了AD小鼠的空间学习记忆能力（各样本原始数据参见附件8）。

图 5.

Results of intracellular calcium activity in CA1 pyramidal neurons (^*P<0.05)

CA1锥体神经元细胞内钙活性结果（^*P<0.05）

2.5. 相关性分析结果

本研究旨在探究认知功能与海马区CA1锥体神经元胞内钙活性及树突棘形态之间的内在联系。通过皮尔逊相关性分析（见图6），发现以下结果：认知指数与树突棘密度（r = 0.825，P < 0.01）、成熟树突棘比例（r = 0.829，P < 0.01）以及钙振幅（r = 0.910，P < 0.01）均呈现出高度正相关，说明它们之间存在强线性依赖性。这些发现凸显了认知功能水平与神经元可塑性以及钙离子通道的动态有直接且强烈的关联。进一步分析平均钙振幅与树突棘发育的具体关系时，发现平均钙振幅与树突棘密度（r = 0.712，P < 0.01）和成熟树突棘比例（r = 0.580，P < 0.01）均存在显著的正相关，表明钙信号的增强与树突棘的增多及成熟分化存在较强相关性。这不仅证实了钙离子在促进新生树突棘形成中的关键作用，也揭示了它在调控树突棘向成熟阶段过渡的重要性。CA1锥体神经元的钙活性与树突棘的精细结构发展之间存在着密切且多层次的相互作用，强调了钙信号传导和树突棘形态在维持和改善认知功能中的重要作用。

图 6.

Pearson correlation analysis results

皮尔逊相关性分析结果

3. 讨论

本研究旨在探讨TMAES对AD导致的海马区神经元突触可塑性损伤的潜在调节机制，重点关注其与细胞内钙稳态的关联。AD可诱导海马神经元损伤，进而导致树突棘发育异常（如数量减少、形态不成熟等）^[30]。多项研究证实，认知功能障碍与海马CA1区锥体神经元的损伤密切相关，且成熟态树突棘数量的增加通常与认知功能改善呈正相关^[31]。本研究结果表明，AD小鼠的认知障碍与CA1锥体神经元的显著损伤相关，与既往研究一致。本研究发现，TMAES可以有效缓解AD小鼠的认知功能障碍，在刺激后观察到CA1神经元数量、树突棘密度和成熟树突棘比例显著增加。因此，TMAES可能通过多种机制对神经元产生积极影响，促进神经元的存活和再生，增强神经元连接的稳定性和复杂性，最终优化神经信号传递的效率。基于上述研究发现，推测TMAES可能通过调控细胞内钙离子通道活性，促进树突棘的形成与成熟，增强神经元间突触连接的有效性，进而提升神经元突触可塑性，最终实现对AD相关认知功能的改善。

钙离子作为细胞内第二信使，在神经元生长分化、突触可塑性及学习记忆等方面发挥着重要的调节作用，在AD病理进程中，β淀粉样蛋白变性会诱发胞内钙稳态失衡^[32]。这种钙信号功能障碍被认为是介导神经退行性病变的最终共同通路，胞内钙离子浓度异常升高会直接损害突触可塑性，最终导致认知记忆功能缺陷^[33]。本研究发现，AD小鼠CA1区钙振幅显著降低，钙活性减弱，该结果与前期研究结论一致。基于我们之前的研究，已经证明TMAES可以调节正常小鼠海马中的钙稳态水平，本研究进一步聚焦其对AD病理状态下钙稳态的干预效应。实验结果表明，TMAES可增加AD小鼠CA1区细胞内钙离子浓度，增强钙活性和钙振幅，进而促进钙稳态平衡。为深入阐明钙离子与CA1区神经元突触可塑性的关联，本研究对钙振幅、树突棘密度及树突棘成熟度指标进行皮尔逊相关性分析，结果显示树突棘密度与成熟度均与钙振幅呈显著正相关，并且神经元结构可塑性与钙稳态的相关性不受基因型调控，提示该调控关联具有相对普遍性。本研究表明钙振幅的升高可能通过促进树突棘发育、增强突触结构与功能可塑性介导其生物学效应，且钙振幅及树突棘形态学特征与AD小鼠的认知功能表现呈显著正相关，表明TMAES介导的钙信号与树突棘可塑性调控可能是改善AD认知障碍的潜在机制。

综上所述，本研究的实验结果表明，神经突触可塑性的增强与钙稳态的改善可能共同参与了认知功能的恢复过程，为TMAES在AD等神经退行性疾病治疗中的潜在应用提供了强有力的实验数据支撑。本研究进一步证实，AD小鼠的认知障碍与海马CA1区神经元胞内钙活性降低密切相关，且这种钙活性下调与神经元突触可塑性损伤存在显著关联。基于上述发现，胞内钙活性降低有望成为评估AD患者认知功能障碍程度的潜在生物标志物。因此，TMAES增强海马区钙活性、维持钙稳态，可能是其改善AD相关认知障碍的潜在作用机制之一。本研究为深入理解TMAES的神经调控效应及AD认知障碍的病理机制提供了新的实验依据，也为后续开发精准靶向的AD无创治疗策略奠定了理论基础。

4. 结论

本研究探讨了AD中TMAES介导的认知障碍及相关神经突触可塑性调节的潜在机制。研究表明，TMAES可以有效改善AD小鼠的认知障碍，增强CA1海马神经元突触可塑性，增加细胞内钙活性，从统计学角度进一步阐明了神经元突触可塑性与钙信号通路的相关性。因此，调节AD诱导的CA1区钙稳态失衡，促进AD海马神经元突触可塑性修复，可能是TMAES改善AD认知障碍的潜在机制之一。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：张帅为基金项目负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改；芈金睿为本研究实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；路小超和徐亦豪参与实验研究与数据分析；徐桂芝参与论文修改。

伦理声明：本研究通过了河北工业大学生物医学伦理委员会批准（批文编号：HEBUTaCUC2022063）。

本文附件见本刊网站的电子版本（biomedeng.cn）。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（52377224）；中央引导地方科技发展资金项目（236Z7711G）