Abstract
目的
探讨微血管密度(microvessel density，MVD)、微淋巴管密度(microlymphatic vessel density，MLVD)对下咽鳞状细胞癌(hypoparyngeal squamous cell carcinoma，HPSCC)患者预后的影响，并基于病理特征构建预后预测模型。
方法
回顾性分析2010年6月至2020年6月就诊于我院并行手术治疗的HPSCC患者的临床病理资料及随访资料，对HPSCC肿瘤组织及切缘正常组织蜡块行免疫组织化学染色，分析MVD和MLVD与HPSCC临床病理特征的关系，通过单因素及多因素Cox回归分析影响HPSCC患者术后总生存期(overall survival，OS)的危险因素，将独立预后影响因素纳入并构建预后模型，采用C指数(C-index)、受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线和校准曲线对模型的预测预后准确性进行评价与验证。
结果
MVD、MLVD在HPSCC肿瘤组织中呈高表达，且高MVD组、高MLVD组患者OS显著低于低MVD组、低MLVD组。单因素和多因素Cox回归分析显示，N分期、肿瘤复发、神经侵犯、淋巴结包膜侵犯、MVD及MLVD均为影响OS的独立危险因素。基于以上结果构建HPSCC的1、3和5年OS的列线图模型，该模型在C指数、ROC曲线下面积和校准曲线方面表现良好，并且在预测OS方面优于AJCC TNM分期系统。
结论
MVD、MLVD显著影响HPSCC患者预后，表达越高提示患者预后越差。基于病理特征构建的HPSCC预后列线图模型有利于临床评估和指导临床决策。
Keywords: 下咽鳞状细胞癌, 微血管密度, 微淋巴管密度, 列线图
Abstract
Objective
This study aims to investigate the influence of microvessel density(MVD) and microlymphatic vessel density(MLVD) on the prognosis of patients with hypopharyngeal squamous cell carcinoma(HPSCC) and to develop a nomogram prediction model for prognosis based on pathological characteristics.
Methods
A retrospective analysis was conducted on clinicopathological and follow-up data from HPSCC patients who underwent surgical treatment at our institution between June 2010 and June 2020. Immunohistochemical staining was performed on tumor tissues and adjacent normal margin tissues to evaluate MVD and MLVD. The associations among MVD, MLVD, and clinicopathological features were analyzed. Univariate and multivariate Cox regression analyses were conducted to identify independent risk factors affecting overall survival(OS). Based on these findings, a nomogram model was constructed and its predictive accuracy was assessed using C-index, receiver operating characteristic(ROC) curve, and calibration curve.
Results
Both MVD and MLVD were significantly higher in HPSCC tumor tissues compared to normal tissues. Patients in the high MVD and high MLVD groups exhibited significantly lower OS rates than those in the low MVD and low MLVD groups. Multivariate Cox regression analysis revealed that N stage, recurrence, nerve invasion, lymph node capsule invasion, MVD, and MLVD were independent prognostic factors of OS. Based on these factors, a nomogram prognosis model was successfully constructed. The nomograms demonstrated superior performance in terms of C-index, area under the ROC curve, and calibration, outperforming the AJCC TNM staging system.
Conclusion
Elevated MVD and MLVD levels are associated with poorer prognosis in HPSCC patients. The nomogram model based on pathological features provides valuable insights for clinical assessment and decision-making.
Keywords: hypopharyngeal squamous cell carcinoma, microvessel density, microlymphatic vessels density, nomogram
下咽鳞状细胞癌(hypoparyngeal squamous cell carcinoma，HPSCC)约占头颈部鳞状细胞癌的8%~9%[1]，恶性程度高，具有发病部位隐匿、早期症状无特异性、易局部浸润扩散和淋巴结转移等特点，80%的患者就诊时已是晚期[2-3]。临床上HPSCC常采用手术、术后放疗、同步放化疗、术前诱导化疗和免疫治疗等综合的治疗方法，尽管术前诱导化疗和同步放疗提高了HPSCC患者的喉功能保留率，但患者的5年生存率仍较低，仅为25%~40%[4-6]，肿瘤的复发与转移是影响预后的主要原因。研究表明，血管生成和淋巴管生成在恶性肿瘤的生长、浸润和转移等方面发挥重要作用，并且微血管密度(microvessel density，MVD)和微淋巴管密度(microlymphatic vessel density，MLVD)与多种恶性肿瘤的预后有关[7-9]。
近来，较多学者利用美国Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) 数据库或单中心病例资料，构建预测HPSCC预后或转移的Nomogram模型[10-14]，然而这些模型中的变量大多为临床特征，对病理特征相关指标关注较少。本研究基于我院收治的HPSCC患者的临床病理资料和随访资料，研究MVD、MLVD与患者临床病理特征的关系及对预后的影响，并利用有影响的病理参数建立Nomogram模型，再对模型进行评价和验证，以期能够构建准确预测HPSCC患者预后的预测模型。
1. 对象与方法
1.1. 研究对象
回顾性分析2010年6月至2020年6月就诊于我院耳鼻咽喉头颈外科并行手术治疗的136例HPSCC患者的临床病历资料，并进行随访。纳入标准：①术后病理明确诊断为鳞状细胞癌；②手术前未接受放疗、化疗、新辅助化疗等；③有完整的临床病历和随访资料。排除标准：①手术前进行放疗、化疗等辅助治疗者；②合并其他部位恶性肿瘤及严重系统性疾病者；③肿瘤复发再次行手术治疗者；④临床病理和随访数据资料不完整者。本研究符合赫尔辛基宣言要求，并获得我院医学伦理委员会的批准(No：2021-KY-13)，患者均签署知情同意书。
1.2. 方法
1.2.1. 资料收集
收集入组HPSCC患者的一般临床信息、病理资料及随访数据。一般临床资料：年龄、手术时间、肿瘤原发部位及肿瘤分期(TNM分期和临床分期)；病理资料：病理分级、肿瘤浸润深度、血管侵犯、神经侵犯、血管内癌栓、淋巴结包膜侵犯及淋巴结密度(lymph node density，LND)；随访资料：术后复发情况、术后生存时间、死亡时间及死亡原因。
依据美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第7版TNM分期标准进行HPSCC患者的TNM分期[15]，根据中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)2024年头颈部肿瘤诊疗指南分期标准进行临床分期，T1-2N0期定义为早期(Ⅰ期和Ⅱ期)，T1-2N+及T3-4任意N期定义为晚期(Ⅲ期和Ⅳ)。总生存期(overall survival，OS)为手术日期到死亡日期或最后1次随访日期的间隔时间。
1.2.2. 免疫组织化学染色
采用免疫组织化学SP法对136例HPSCC肿瘤组织术后病理蜡块及23例癌旁正常切缘组织蜡块进行微血管(CD31，1∶150，abways，CY1132)和微淋巴管(LYVE-1，1∶20 000，Abcam，ab219556)的染色，免疫组织化学染色阳性的切片作为阳性对照，BSA代替一抗作为阴性对照。染色步骤按试剂盒说明书进行。
1.2.3. MVD和MLVD分析
染色后的切片均通过河北医科大学公共平台的Pannoramic SCAN Ⅱ病理切片扫描仪扫描，通过SlideViewer软件查看并分析染色结果。
MVD：低倍(10×)观察CD31染色的切片，确定肿瘤间质染色血管数量最多的区域(热点)，用直径500 μm的圆圈标出3个热点，高倍镜下人工计数每个圆圈内CD31染色阳性微血管的数量。微血管：任何免疫阳性的内皮细胞或明显区别于邻近肿瘤细胞和其他间质成分的细胞团，无论其有无管腔，均被认定为1条可计数的微血管，含有基层和腔内形态成分的血管不计入微血管[16-18]。每张切片3个微血管“热点”区中CD31染色阳性微血管数量的平均值即为MVD。
MLVD：参照Schoppmann的计数标准[19]及上述MVD的方法对LYVE-1染色阳性的淋巴管进行计数。微淋巴管：任何染色阳性的内皮细胞或明显区别于邻近肿瘤细胞和其他间质成分的细胞团，无论其有无管腔，均被认定为1条可计数的微淋巴管，腔内不含红细胞，无肌性管壁，若见肌层和腔内形态成分则不计入微淋巴管。其中，管腔明显、管壁完整者，无论其有无明显的内皮细胞均可计数为1个微淋巴管，管壁不完整但有内皮细胞或成簇的多个迂回管腔的也可计数为1个微淋巴管。每张切片3个微淋巴管“热点”区中LYVE-1染色阳性微淋巴管数量的平均值即为MLVD。
1.2.4. 最佳截断值使用X-tile
3.6.1软件，基于整体生存确定MVD、MLVD、LND的最佳截断值，根据最佳截断值将患者分为低MVD组(MVD≤21)和高MVD组(MVD>21)、低MLVD组(MLVD≤31)和高MLVD组(MLVD>31)、低LND组(LND≤0.05)和高LND组(LND>0.05)。
1.3. 统计学方法
使用SPSS 27.0和R 4.4.1软件对所有数据进行处理及统计学分析。应用非参数秩和检验分析HPSCC肿瘤组织和正常切缘组织中MVD、MLVD表达的差异。通过X-tile软件确定最佳截断值，并将MVD、MLVD、LND等连续性变量转换为分类变量。采用χ2检验或Fisher精确检验分析MVD、MLVD与临床病理特征的关系。使用单因素及多因素Cox回归分析确定独立的预后影响因素，纳入P < 0.05的变量通过R软件构建Nomogram预测模型。应用C指数(C-index)、受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线下面积(areas under curve，AUC)和校准曲线评估模型的预测准确性。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 病例特点
符合纳入排除标准的HPSCC患者共136例，所有患者1、3、5年OS分别为93.4%、61.8%和45.6%，中位生存时间为40个月。HPSCC肿瘤间质组织中MVD和MLVD平均值分别为23.69和20.64，显著高于癌旁正常切缘组织(P < 0.001)，见图 1和表 1。将患者按3∶1随机分成训练组(102例)和验证组(34例)。
图 1.
HPSCC肿瘤组织和癌旁组织中MVD、MLVD的分布情况及对预后的影响
A：HPSCC肿瘤组织和癌旁组织中MVD、MLVD的分布情况；B：预后情况。
表 1.
HPSCC肿瘤组织与癌旁正常组织中MVD、MLVD的计数 X±S
| 组织类型 | 例数 | CD31 MVD | LYVE-1 MLVD |
| 肿瘤组织 | 136 | 23.69±9.40 | 20.64±14.72 |
| 癌旁组织 | 23 | 10.33±6.50 | 5.51±3.68 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 |
2.2. MVD、MLVD与患者临床病理特征的关系
肿瘤直径、T分期、浸润深度和淋巴结包膜侵犯情况在低MVD组和高MVD组间差异有统计学意义，而肿瘤的原发部位、N分期和病理分级在低MVD组和高MVD组间差异无统计学意义，见表 2。
表 2.
MVD、MLVD与HPSCC患者临床病理特征的关系 例
| 基本特征 | 低MVD组(MVD≤21) | 高MVD组(MVD>21) | χ 2 | P | 低MLVD组(MVD≤31) | 高MLVD组(MVD>31) | χ 2 | P |
| 肿瘤直径/cm | 4.407 | 0.036 | 0.499 | 0.480 | ||||
| ≤3.0 | 36 | 33 | 55 | 14 | ||||
| >3.0 | 23 | 44 | 50 | 17 | ||||
| 原发部位 | 0.204 | 0.903 | 8.649 | 0.013 | ||||
| 梨状窝 | 46 | 58 | 83 | 21 | ||||
| 咽后壁 | 9 | 14 | 13 | 10 | ||||
| 环后区 | 4 | 5 | 9 | 0 | ||||
| T分期 | 7.277 | 0.007 | 1.936 | 0.164 | ||||
| T1~2 | 22 | 13 | 30 | 5 | ||||
| T3~4 | 37 | 64 | 75 | 26 | ||||
| N分期 | 0.832 | 0.660 | 1.595 | 0.451 | ||||
| N0 | 20 | 21 | 30 | 11 | ||||
| N1 | 37 | 54 | 71 | 20 | ||||
| N2~3 | 2 | 2 | 4 | 0 | ||||
| 浸润深度 | 24.350 | < 0.001 | 5.237 | 0.022 | ||||
| 黏膜/黏膜下 | 42 | 22 | 55 | 9 | ||||
| 肌层/邻近结构 | 17 | 55 | 50 | 22 | ||||
| 病理分级 | 0.017 | 0.992 | 2.247 | 0.325 | ||||
| 低分化 | 4 | 5 | 7 | 2 | ||||
| 中分化 | 40 | 53 | 69 | 24 | ||||
| 高分化 | 15 | 19 | 29 | 5 | ||||
| 淋巴结包膜侵犯 | 4.217 | 0.040 | 0.863 | 0.353 | ||||
| 否 | 35 | 32 | 54 | 13 | ||||
| 是 | 24 | 45 | 51 | 18 |
肿瘤的原发部位和肿瘤浸润深度在低MLVD组和高MLVD组间差异有统计学意义，而肿瘤直径、T分期、病理分级和淋巴结包膜侵犯情况比较差异无统计学意义。
2.3. 训练组影响OS的独立预后影响因素
单因素Cox分析显示，肿瘤复发情况、T分期、N分期、浸润深度、脉管内癌栓情况、神经侵犯情况、血管侵犯情况、LND、淋巴结包膜侵犯情况、MVD和MLVD均影响HPSCC患者OS(P < 0.05)。多因素生存分析表明肿瘤复发情况、N分期、神经侵犯情况、淋巴结包膜侵犯情况、MVD和MLVD是影响HPSCC患者OS的独立危险因素(P < 0.05)，见表 3。
表 3.
HPSCC预后影响因素的单因素和多因素Cox回归分析
| 变量 | 单因素Cox回归 | 多因素Cox回归 | |||
| HR(95%CI) | P | HR(95%CI) | P | ||
| 肿瘤直径/cm | |||||
| ≤3.0 | 1(Ref) | ||||
| >3.0 | 1.385(0.825~2.324) | 0.218 | |||
| T分期 | |||||
| T1~2 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| T3~4 | 2.005(1.040~3.865) | 0.038 | 1.552(0.709~3.398) | 0.272 | |
| N分期 | |||||
| N0 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| N1 | 2.864(1.475~5.561) | 0.002 | 2.881(1.279~6.491) | 0.011 | |
| N2~3 | 2.503(0.554~11.314) | 0.233 | 2.695(0.408~17.808) | 0.304 | |
| 临床分期 | |||||
| Ⅰ~Ⅱ期 | 1(Ref) | ||||
| Ⅲ~Ⅳ期 | 2.216(0.802~6.121) | 0.125 | |||
| 病理分级 | |||||
| 低分化 | 1(Ref) | ||||
| 中分化 | 2.379(0.574~9.859) | 0.232 | |||
| 高分化 | 2.965(0.678~12.960) | 0.149 | |||
| 浸润深度 | |||||
| 黏膜/黏膜下 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| 肌层/邻近结构 | 2.119(1.234~3.637) | 0.006 | 0.995(0.502~1.971) | 0.989 | |
| 脉管内癌栓 | |||||
| 否 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| 是 | 1.999(1.179~3.392) | 0.010 | 1.005(0.553~1.826) | 0.987 | |
| 神经侵犯 | |||||
| 否 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| 是 | 3.198(1.691~6.050) | < 0.001 | 2.402(1.150~5.015) | 0.020 | |
| 血管侵犯 | |||||
| 否 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| 是 | 2.878(1.697~4.822) | < 0.001 | 1.608(0.847~3.051) | 0.146 | |
| 淋巴结包膜侵犯 | |||||
| 否 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| 是 | 2.836(1.645~4.889) | < 0.001 | 1.937(1.015~3.697) | 0.045 | |
| LND | |||||
| ≤0.05 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| >0.05 | 2.412(1.435~4.054) | < 0.001 | 0.809(0.410~1.596) | 0.514 | |
| MVD | |||||
| ≤21 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| >21 | 3.284(1.798~5.996) | < 0.001 | 2.301(1.172~4.520) | 0.016 | |
| MLVD | |||||
| ≤31 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| >31 | 2.516(1.451~4.362) | 0.001 | 1.923(1.016~3.641) | 0.045 | |
| 复发 | |||||
| 否 | 1(Ref) | 1(Ref) | |||
| 是 | 4.006(2.364~6.789) | < 0.001 | 4.453(2.377~8.342) | < 0.001 | |
| 术后放疗 | |||||
| 否 | 1(Ref) | ||||
| 是 | 1.077(0.632~1.837) | 0.785 | |||
2.4. 列线图模型的构建
根据得到的多因素Cox回归分析结果，纳入5个独立危险因素变量构建了Nomogram预测模型(图 2)。各变量对应的分数相加后得到总分可用于预测1、3、5年OS，总分越高对应的预后越差。
图 2.
预测HPSCC患者1、3、5年OS列线图模型
2.5. 列线图模型的评价与验证
训练组OS的C指数为0.741(95%CI 0.680~0.802)，优于TNM分期(C-index=0.659，95%CI 0.599~0.720)，验证组OS的C指数为0.743(95%CI 0.633~0.853)，也优于TNM分期(C-index=0.633，95%CI 0.534~0.732)。ROC曲线结果显示训练组1年、3年和5年OS的AUC分别为0.598，0.817和0.803，相应的AJCC分期的AUC分别为0.559、0.532和0.553；验证组1、3和5年OS的AUC分别为0.712，0.855和0.798，对应的AJCC分期的AUC分别为0.561，0.528和0.482。校准曲线表明该模型预测的1、3和5年生存率与实际生存率具有较高的一致性。
3. 讨论
HPSCC是一种少见的头颈部恶性肿瘤，预后差，新手术方式及综合治疗模式的出现使得HPSCC的局部控制率得到了显著提高，但患者的总体生存率并未明显改善，复发与转移是影响预后的主要原因[20-21]。多项研究证明，血管生成和淋巴管生成与恶性肿瘤的复发转移密切相关，MVD和MLVD能够反映肿瘤组织内血管生成和淋巴管生成的程度[7-8, 22-24]。
本研究进一步明确了HPSCC肿瘤组织中具有较高的MVD和MLVD，且高表达的MVD和MLVD显著降低患者OS。本研究还发现MVD、MLVD与患者的多项临床病理特征有关，如肿瘤直径、T分期、肿瘤浸润深度、淋巴结包膜侵犯情况等，这些临床病理特征与肿瘤的生长、侵袭和转移关系密切，因而能够明显影响患者预后。此外，肿瘤组织病理结果提示伴有脉管内癌栓、神经侵犯、血管侵犯、淋巴结包膜侵犯等情况，较深的浸润深度，较高的LND、MVD和MLVD以及肿瘤复发均显著降低HPSCC患者OS。
精准、可靠的预后预测因子或生物标志物可优化肿瘤治疗策略并提高患者生存率。但传统的TNM分期系统并不能很好地预测患者的生存情况，也不能精准有效地指导治疗决策，因此近来有许多学者构建了预测HPSCC预后或转移的Nomogram模型。由于HPSCC仅占头颈肿瘤的2%~5%[21]，因此单中心临床资料的病例数较少。美国国家癌症研究所创办的SEER数据库收录了约30%的美国恶性肿瘤诊断、治疗和生存数据，研究者常据此构建列线图(Nomogram)预测模型。受限于病例变量，这些模型仅能纳入年龄、种族、肿瘤大小、TNM分期及手术、放疗、化疗等常规临床病理特征等[10-14]，无法针对特异性的病理特征进行分析并构建模型。本研究采用回顾性分析，重点总结HPSCC患者详细的病理特征资料，如肿瘤的浸润深度、血管侵犯、神经侵犯、脉管内癌栓、淋巴结包膜侵犯、LND、MVD和MLVD等。通过综合分析确定独立预后因素，构建并验证基于病理特征的Nomogram肿瘤预测模型，以期能够为临床医生的治疗决策提供参考和帮助，临床医生可通过该模型准确识别高危患者，评估患者的生存期，便于指导术后治疗。
本研究发现N分期、血管侵犯、淋巴结包膜侵犯、MVD、MLVD和复发是影响下咽癌患者预后的独立危险因素，均显著增加患者的不良结局风险。N1期患者死亡风险是N0期患者的2.881倍，N2-N3期患者死亡风险是N0期患者的2.695倍。发生神经侵犯、淋巴结包膜侵犯的患者死亡风险显著增加，是未发生神经侵犯、淋巴结包膜侵犯患者的2.402和1.937倍。高MVD和高MLVD患者的死亡风险是低MVD和低MLVD的2.301和1.923倍。对于发生复发的患者，其死亡风险是无复发患者的4.453倍，可见复发对患者的预后产生非常重要的影响。但由于本预测模型建立的初衷是术后短期内通过病理特征对患者的预后进行预测以便指导随访及治疗干预，一旦等待患者出现复发再应用模型预测，可能会延误病情，错失干预时机，因此构建列线图模型时未将复发纳入。从列线图中可以发现，N分期是影响下咽癌患者预后的重要因素。构建模型后，通过C指数，AUC及校准曲线对训练组和验证组进行了内部验证和外部验证，结果发现该模型具有良好的预测性能，尤其是5年OS的预测值与实际值基本一致。但该模型在训练组和验证组1年OS的AUC分别为0.598和0.712，2组AUC差异考虑与OS偏高有关，OS分别为95.1%(97/102)和97.1%(33/34)，验证组中仅有1例1年内死亡，容易造成偏倚。3、5年OS的AUC发现该模型明显优于TNM分期系统，具有较高的预测价值，校准曲线发现该模型具有良好的远期生存预测准确性。
但是我们的研究存在一定的局限性。首先，临床资料为单中心资料，病例数较少，尤其是验证组数据偏少，需纳入多中心病例资料后进一步外部验证；本次建模病例均为手术患者，且术前未行治疗，还需在非手术患者及术前行靶向或其他治疗者中进行分析，以确定模型的适用性。
综上所述，本研究通过回顾性分析单中心病例的病理特征，统计学分析各种因素对HPSCC患者预后的影响，构建的预测模型能够评估下咽癌患者的远期预后情况，具有较高的临床应用价值。
致谢
感谢河北医科大学陈金婷老师提供的技术支持。
Funding Statement
河北省自然科学基金资助(No：H2021505019，H2024505017)；河北省医学科学研究课题计划资助(No：20240376)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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