基于双硫死亡信号探讨干细胞源性外泌体对急性肝衰竭的保护作用及其机制

Abstract

Objective

To explore the protective effect and molecular mechanism of human liver stem cell line HYX1-derived exosomes (HYX1-Exos) on acute liver failure (ALF) based on disulfidptosis signaling.

Methods

Healthy male BALB/c mice were intraperitoneally injected with D-galactosamine/lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) to induce ALF. Mice were divided into a normal control group, an acute liver failure group (ALF group), a disulfidptosis inhibitor tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) intervention group (TCEP+ALF group), a HYX1-Exos intervention group (HYX1-Exos+ALF group), and a SLC7A11-IN-1 intervention group (SLC7A11-IN-1+ALF group), with five mice per group. Blood and liver tissue samples were collected. The degree of liver tissue damage was assessed based on serum transaminase levels and hematoxylin-eosin staining results. Quantitative PCR was used to analyze the gene expression levels of disulfidptosis markers SLC7A11, GLUT1, and WAVE2 in liver tissues of each group. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) was used to evaluate hepatocyte viability. Statistical analysis was performed using the independent samples t-test and one-way ANOVA.

Results

TCEP treatment had significantly alleviated liver damage in ALF mice, as indicated by a marked reduction in transaminase levels [alanine aminotransferase: (312.01±19.46) U/L vs. (1 512.09±229.34) U/L, t=10.38, P<0.001; aspartate aminotransferase: (76.30±39.63) U/L vs. (324.17±78.27) U/L, t=5.75, P<0.001] and a notable improvement in liver histology. HYX1-Exos treatment had significantly reduced liver injury and disulfidptosis levels in ALF mice. Liver injury and disulfidptosis levels were significantly reduced with inhibition of SLC7A11 in ALF mice. In vitro experiments showed that HYX1-Exos protected hepatocytes from disulfidptosis induced by high SLC7A11 under glucose starvation.

Conclusion

Disulfidptosis plays an important role in the development of ALF, and HYX1-Exos likely have a hepatoprotective effect on ALF by inhibiting SLC7A11-mediated disulfidptosis.

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）病情危重，进展迅猛，病死率极高^［1-2］。除肝移植外，目前尚缺乏其他有效疗法。然而，供肝的短缺以及需终生应用免疫抑制剂等极大限制了肝移植的临床应用^［3-5］。因此，开发新的有效治疗手段势在必行。近年来，干细胞及其来源的外泌体已被用于多种人类疾病的治疗^［6-9］，为肝衰竭患者带来了新的希望。我们前期构建并鉴定了一株人成体肝干细胞系HYX1［中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）存种保藏编号为14997；专利号为201710995496.4］，并且证明了该细胞对刀豆蛋白诱导ALF的保护作用^［10］。然而，干细胞移植面临着肝脏归巢较少、存活率低及肝干细胞来源有限等困境^［11-13］。因此，无细胞治疗，特别是利用外泌体作为治疗手段，成为新的研究方向^［14-16］。双硫死亡（disulfidptosis）是一种新发现的程序性细胞死亡方式^［17］。研究表明，在葡萄糖缺乏的条件下，蛋白溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 mem‑ber 11，SLC7A11）的高表达会加速烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的消耗，导致细胞内胱氨酸异常积聚^［18］。这一过程促使肌动蛋白丝之间形成异常的二硫键交联，从而引起细胞骨架结构解体，最终导致细胞死亡^［19-21］。本研究以双硫死亡为切入点，探讨了HYX1细胞系分泌的外泌体（HYX1-derived exosomes，HYX1-Exos）对ALF的保护作用及其分子机制。

材料与方法

一、. 动物和试剂

6～8周龄健康雄性BALB/c小鼠，购自北京斯贝福实验动物养殖中心，普通饲养，自由饮水，维持正常昼夜节律。D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自美国Sigma公司；RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，鸟成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆转录系统和SYBR Green定量PCR检测试剂购自日本TaKaRa公司。细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8购自东仁化学科技（上海）有限公司。半胱氨酸（cysteine，Cys）及NADPH检测试剂盒购自碧云天（上海）生物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学（实验伦理批件编号：AEEI-2025-004；实验动物合格证明：No.110324251105749356）。

二、. 动物模型

（1）小鼠ALF模型的建立：给BALB/c小鼠腹腔注射D-GalN（500 mg/kg）/LPS（10 μg/kg）；（2）Exos回输：将分离的HYX1-Exos经尾静脉注射回输给正常小鼠，再给予D-GalN/LPS诱导急性肝衰竭，每只小鼠回输HYX1-Exos剂量为2.0×10⁹个粒子，2 h后腹腔注射给予D-GalN/LPS诱导ALF；（3）双硫死亡抑制剂三（2-羧乙基）膦［Tris（2-chloroethyl）phosphate，TCEP］干预：正常小鼠分别于D-GalN/LPS诱导前后2 h经灌胃给予TCEP，剂量为每次10 mg/kg；（4）SLC7A11抑制剂（SLC7A11-IN-1）干预：正常小鼠经腹腔注射给予SLC7A11-IN-1，剂量为10 mg/kg，2 h后腹腔注射给予D-GalN/LPS诱导ALF。

三、. 实验分组

（1）HYX1-Exos干预实验：分为正常对照组（Control组）、ALF组、HYX1-Exos干预组（Exos+ALF组），每组5只小鼠；（2）双硫死亡抑制剂TCEP干预实验：分为正常对照组（Control组）、ALF组、TCEP干预组（TCEP+ALF组），每组5只小鼠；（3）SLC7A11抑制剂SLC7A11-IN-1干预实验：分为正常对照组（Control组）、ALF组、SLC7A11-IN-1干预组（SLC7A11-IN-1+ALF组），每组5只小鼠。所有实验均在末次D-GalN/LPS诱导7 h后收集动物的血液和肝组织标本。收集的部分肝脏通过甲醛溶液固定后用于后续苏木精-伊红（HE）染色，其余肝脏分装后冻存，用于后续PCR等检测与分析。

四、. 肝损伤评估

1. 病理检查：肝组织经常规甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片，HE染色，在光学显微镜下观察肝组织细胞损伤情况。

2. 血清转氨酶检测：分别采用南京建成生物工程研究所的丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）试剂盒检测小鼠血清中ALT和AST。

3. Cys和NADPH检测：分别采用碧云天（上海）生物技术有限公司蛋白质半Cys胱氨酸检测试剂盒（DTNB法）及增强型NADP⁺/NADPH检测试剂盒（WST-8法）检测小鼠肝组织中Cys和NADPH水平。

五、. HYX1-Exos的分离

采用超速离心法（参照文献^［22］方法并略有修改）从HYX1细胞（第10代）培养上清液中分离Exos。收集HYX1细胞培养上清液，300×g离心10 min，随后2 000×g离心10 min以去除细胞碎屑。收集上清液，4 ℃、10 000×g离心30 min，随后100 000×g离心90 min；收集沉淀，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次，最后所得沉淀重悬于无菌PBS中（即为Exos）。

六、. 荧光定量聚合酶链反应检测

采用TRIzol试剂提取肝组织总RNA，利用分光光度计测定其浓度并定量。利用AMV逆转录系统将总RNA逆转录为cDNA，随后进行SYBR Green实时荧光定量PCR检测。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。所应用的引物序列见表1。

表1.

实时荧光定量PCR引物序列

基因	正向引物	反向引物
Gapdh	5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’	5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’
Slc7a11	5’-ATGCTCTTCTCCGGAGACCT-3’	5’-ACGATGCATATCTGGGCGTT-3’
Glut1	5’-GTGCTCCTCGTGCTCTTCTTCATC-3’	5’-CTCCTCGGGTGTCTTGTCACTTTG-3’
Wave2	5’-ACCACCACCACCACCTTCTGAG-3’	5’-CTTCTCTTGCTCCCGTTGCTCTTC-3’

注：Gadph为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因；Slc7a11为蛋白溶质载体家族7成员11基因；Glut1为葡萄糖转运蛋白1基因；Wave2为Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族成员2基因

七、. 细胞活性检测

采用CCK-8试剂盒检测肝细胞活性，按照试剂盒说明书进行操作。

八、. 统计学方法

应用R语言（version 4.2.3）进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准误（SEM）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、. 双硫死亡在ALF发病中的作用

血清转氨酶检测结果显示，ALF诱导可触发ALT、AST水平的急剧升高，然而TCEP干预组小鼠的ALT和AST水平则较ALF组显著降低［ALT：Control（14.25±2.98） U/L，ALF （1 512.09±229.34） U/L，TCEP+ALF（312.01±19.46） U/L，t=10.38，P<0.001；AST：Control（8.37±2.65） U/L，ALF（324.17±78.27） U/L，TCEP+ALF（76.30±39.63） U/L，t=5.75，P<0.001；图1A］。病理检查结果也显示，ALF组小鼠的肝组织中可见肝小叶结构紊乱，肝细胞明显肿胀、变性、坏死，汇管区大量炎细胞浸润，而在TCEP干预组，肝细胞变性、坏死程度明显减轻，浸润的炎细胞明显减少（图1B）。Cys检测结果显示，ALF诱导可导致小鼠肝组织中Cys含量显著下降，而经TCEP抑制剂干预后，Cys水平恢复至正常；NADPH检测结果同样表明，ALF小鼠肝组织中的NADPH水平低于正常组和TCEP干预组，特别是，ALF组小鼠肝组织中NADP⁺/NADPH比值显著升高，且其数值>1（图1C）。我们随后通过检测相关基因表达对3组小鼠的双硫死亡程度进行了评估。定量PCR结果显示，ALF诱导可导致SLC7A11、葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter type 1，GLUT1）和Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族成员2（Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2，WAVE2）mRNA水平的显著升高，而TCEP的应用则使这些基因的表达明显降低（图1D）。这些结果表明，双硫死亡在ALF中发挥重要作用。

图1. 抑制双硫死亡可使D-GalN/LPS诱导的ALF明显减轻 1A为各组小鼠血清转氨酶检测结果；1B为各组小鼠肝组织的代表性 HE染色；1C为各组小鼠肝组织Cys及NADPH浓度；1D为各组小鼠肝组织中双硫死亡关键基因的表达.

注：Control为正常对照组；ALF为急性肝衰竭（ALF）组；TCEP+ALF为三（2-羧乙基）膦（TCEP）干预组；ALT为丙氨酸转氨酶；AST为天冬氨酸转氨酶；Cys为半胱氨酸；NADP（H）为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；SLC7A11为蛋白溶质载体家族7成员11；GLUT1为葡萄糖转运蛋白1；WAVE2为Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族成员2；图中小数为各组间比较的P值

二、. HYX1-Exos通过抑制双硫死亡保护小鼠抵抗ALF

病理检查结果显示，ALF组小鼠肝小叶结构紊乱，并可见广泛的肝细胞变性、坏死和汇管区大量炎细胞浸润；而HYX1-Exos干预组小鼠的肝损害显著改善，肝细胞变性、坏死和炎细胞浸润程度均显著减轻（图2A）。因此，回输HYX1-Exos可明显减轻D-GalN/LPS诱导的ALF。

图2. HYX1-Exos能够保护小鼠抵抗ALF 2A为各组小鼠的代表性HE染色图像；2B为各组小鼠肝组织中双硫死亡关键基因的转录水平.

注：ALF为急性肝衰竭（ALF）组；Exos+ALF为HYX1细胞系分泌的外泌体（HYX1-Exos）干预组；SLC7A11为蛋白溶质载体家族7成员11；GLUT1为葡萄糖转运蛋白1；WAVE2为Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族成员2；图中小数为组间比较的P值

定量PCR结果显示，诱导ALF可促使SLC7A11、GLUT1和WAVE2的基因表达显著升高，而在HYX1-Exos干预组，这3个基因的表达明显降低（图2B）。这些结果表明，HYX1-Exos通过抑制双硫死亡而在ALF中发挥肝保护作用。

三、. HYX1-Exos通过抑制SLC7A11介导的双硫死亡在ALF中发挥肝保护作用

为进一步探究HYX1-Exos介导肝保护背后的具体分子机制，我们给予小鼠SLC7A11抑制剂预处理，再诱导ALF，观察小鼠的肝损伤程度。病理检查结果显示，SLC7A11-IN-1干预组小鼠肝组织的肝小叶结构较完整，肝细胞死亡和炎细胞浸润程度均较ALF组显著减轻（图3A）。定量PCR结果显示，给予SLC7A11抑制剂处理后，SLC7A11、GLUT1和WAVE2的基因表达水平较ALF组显著降低或呈降低趋势（图3C）。这些结果表明，SLC7A11在介导双硫死亡中起着重要作用。

图3. HYX1-Exos能够抑制急性肝衰竭小鼠的双硫死亡水平 3A为各组小鼠的代表性苏木精-伊红染色图像；3B为CK-8细胞活力实验；3C为各组小鼠肝组织中双硫死亡关键基因的转录水平.

注：Control为正常对照组；ALF为急性肝衰竭组；SLC7A11-IN-1+ALF为SLC7A11-IN-1干预组；AML12为正常AML12细胞；无糖+SLC7A11rp为无糖+SLC7A11重组蛋白处理组；无糖+SLC7A11rp+Exos为无糖+SLC7A11重组蛋白+HYX1-Exos处理组；SLC7A11为蛋白溶质载体家族7成员11；GLUT1为葡萄糖转运蛋白1；WAVE2为Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员2；图中小数为各组间比较的P值

为证明HYX1-Exos对SLC7A11介导双硫死亡的抑制作用，我们进行了体外实验研究。CCK-8结果显示，在无糖条件下给予SLC7A11重组蛋白（2 μg/mL）处理，可使肝细胞的活性显著降低，而给予HYX1-Exos治疗，则会使肝细胞的活性显著升高（图3B）。这些结果表明，HYX1-Exos可保护肝细胞抵抗SLC7A11介导的双硫死亡。

讨论

双硫死亡是2023年报道的一种新型细胞死亡方式^［19］。这种细胞死亡不能通过抑制凋亡、铁死亡、自噬、坏死性凋亡等信号通路而挽救，但可被二硫化物抑制剂几乎完全抑制，研究者将这种由二硫化物积累导致的全新细胞死亡方式命名为双硫死亡。该死亡方式发生在葡萄糖饥饿的状态下，此时负责胱氨酸/谷氨酸逆向转运的SLC7A11高表达，加速了细胞质中NADPH消耗^［23］，导致溶解度极低的胱氨酸不能被还原为无毒的、可以利用的半胱氨酸，致使胱氨酸累积，毒性二硫化物积聚^{［19，24］}，后者可致肌动蛋白细胞骨架的蛋白分子间异常产生大量二硫键，这种二硫键交联造成了肌动蛋白细胞骨架的紊乱，致使构成细胞骨架的肌动蛋白丝聚集，细胞骨架收缩、坍塌，最终造成细胞双硫死亡^{［19，25］}。

自双硫死亡发现以来，关于其与不同人类疾病关联的文章不断涌现，然而大多数为综述和生信分析^［26-29］。目前已发表的研究性论文主要报道了双硫死亡在多种肿瘤（包括肝癌）中的作用^［30-34］。在肝病方面，目前尚鲜见研究探讨了双硫死亡在非肿瘤肝脏疾病，包括肝衰竭中的作用及其分子机制。本课题组近年来主要研究不同细胞死亡模式（包括凋亡、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡）在肝衰竭中的作用及其分子机制^［35-36］。本研究中，我们首先想要明确双硫死亡这一新型细胞死亡模式是否在ALF中发挥重要作用。为此，我们给予小鼠双硫死亡抑制剂TCEP预处理，随后诱导ALF。根据转氨酶和病理检查结果，TCEP干预组小鼠的肝损伤较ALF组明显减轻。Cys及NADPH检测结果也表明，TCEP干预能够有效逆转ALF组小鼠肝组织中Cys和NADPH含量的下降。定量PCR结果也显示，TCEP干预组小鼠肝组织双硫死亡信号分子SLC7A11、GLUT1和WAVE2的表达较ALF组显著降低，而GLUT1/SLC7A11比值则明显升高。这些结果表明，抑制双硫死亡可明显减轻D-GalN/LPS诱导的ALF。也就是说，双硫死亡在ALF的发生中发挥重要作用。

以干细胞及其来源外泌体为基础的治疗策略应用日益广泛且前景光明^［7］。如前言所述，我们构建了人肝干细胞系HYX1，并且证明了该细胞对ALF的保护作用。为明确HYX1源性外泌体是否对ALF具有保护作用，我们给正常小鼠以HYX1-Exos预处理，随后诱导ALF。病理检查结果显示，经HYX1-Exos治疗的小鼠肝组织损伤较ALF组明显减轻，表明HYX1-Exos对ALF小鼠具有保护作用。接下来我们探讨了HYX1-Exos对ALF的肝保护机制，并聚焦于双硫死亡。定量PCR结果显示，HYX1-Exos干预组小鼠肝组织中双硫死亡信号分子的表达水平显著低于ALF组。该结果表明，HYX1-Exos通过抑制双硫死亡而在ALF中发挥肝保护作用。

本研究还对HYX1-Exos抑制双硫死亡的分子机制进行了深入探讨。根据病理检查结果，给予SLC7A11抑制剂处理可使ALF小鼠的肝损伤明显减轻。定量PCR结果也显示，抑制SLC7A11可使双硫死亡信号分子的表达明显降低。这些结果提示，SLC7A11在介导ALF小鼠的双硫死亡中发挥重要作用。值得注意的是，我们的体外实验结果表明，HYX1-Exos处理的肝细胞对无糖、高SLC7A11（给予SLC7A11重组蛋白）诱导的双硫死亡的抵抗性显著增强。因此，HYX1-Exos很可能通过抑制SLC7A11介导的双硫死亡在ALF中发挥肝保护作用。虽然已有一些研究证实了SLC7A11在双硫死亡中的关键作用^{［24， 32］}，目前尚需研究基于SLC7A11介导的双硫死亡证明干细胞外泌体的保护机制。

本研究存在一些不足之处。研究仅初步探讨了SLC7A11介导的双硫死亡在ALF中的作用，后续研究中我们将通过SLC7A11过表达和敲低的体内外实验进一步证实其作用。另外，关于HYX1-Exos中究竟是哪种成分介导了其对ALF的肝保护作用，尚需进一步研究予以证明。

综上所述，双硫死亡在ALF的发生中起着重要作用，而HYX1-Exos很可能通过抑制SLC7A11介导的双硫死亡保护小鼠抵抗ALF。本研究为ALF的发病机制和治疗研究提供了新的见解。

·读者·作者·编者·

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作者贡献声明

杨旗, 唐慧昕, 刘晓璇, 等. 基于双硫死亡信号探讨干细胞源性外泌体对急性肝衰竭的保护作用及其机制[J]. 中华肝脏病杂志, 2026, 34(4):348-355. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20250610-00227.

Funding Statement

首都卫生发展科研专项（2024-1-2181）；肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室开放课题（BJYAHKF2023004）；首都医科大学附属北京佑安医院中青年人才孵育项目（BJYAYY-YN2024-10）；首都医科大学附属北京佑安医院人才库培养计划项目（YARCKC2024001）

Capital's Funds for the Health Improvement and Research (2024-1-2181); Open Project of Beijing Municipal Key Laboratory of Liver Failure and Artificial Liver Treatment Research (BJYAHKF2023004); Scientific Research Project of Beijing YouAn Hospital, CCMU, 2024 (BJYAYY-YN2024-10); Beijing YouAn Hospital Construction of Talent Pool Program (YARCKC2024001).