干扰素α诱导人肝癌细胞发生双硫死亡

Abstract

Objective

To investigate the potential molecular regulatory mechanism of interferon-α (IFN-α)-induced disulfidptosis occurrence in human liver cancer cells.

Methods

Glucose starvation and IFN-α treatment models were constructed using human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 and Huh7, respectively. Western blotting (WB), NADPH content measurement, and immunofluorescence staining were employed to evaluate disulfidptosis-related phenotypes, such as intracellular disulfide bond accumulation, NADPH depletion, and filamentous actin (F-actin) skeleton collapse. The reversibility of the phenotypes was validated by combining the disulfidptosis inhibitor D-penicillamine (D-Pen). The expression of solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11) was downregulated using siRNA interference to evaluate the dependence of IFN-α-induced disulfidptosis on the SLC7A11 pathway. Furthermore, the GEO transcriptome dataset was employed to conduct differential gene analysis for screening candidate molecules involved in the regulation of IFN-α-induced disulfidptosis. Quantitative data are presented as mean ± standard deviation (SD). Comparisons between two groups were performed using the independent-samples t test, while comparisons among multiple groups were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Dunnett's t test for pairwise comparisons.

Results

Compared with the control group, glucose starvation and IFN-α treatment both induced disulfidptosis-related phenotypes in HepG2 and Huh7 cells, characterized by increased intracellular disulfide bond levels, decreased NADPH content, and F-actin cytoskeleton collapse. Following IFN-α treatment, the accumulation of high-molecular-weight protein aggregates increased in a time- and dose-dependent manner. Compared with IFN-α treatment alone, combined D-Pen intervention partially alleviated intracellular disulfide accumulation, NADPH depletion, and F-actin cytoskeletal collapse. Under conditions of SLC7A11 knockdown, IFN-α-induced high-molecular-weight protein aggregation was further aggravated, suggesting that regulatory mechanisms independent of SLC7A11 may also be involved in this process. Transcriptomic differential expression analysis revealed that β2-microglobulin (B2M), ubiquitin-specific peptidase 18 (USP18) and proteasome activator subunit 1 (PSME1) were upregulated following IFN-α stimulation, among which PSME1 also showed increased protein expression after IFN-α treatment.

Conclusion

IFN-α can induce disulfidptosis-related phenotypic changes in HepG2 and Huh7 human hepatocellular carcinoma cells. The upregulation of B2M, USP18, and PSME1 suggests that these molecules may be involved in this process; however, the specific underlying mechanisms require further investigation.

双硫死亡是一种新发现的程序性细胞死亡方式，其特征为二硫键应激诱导的细胞骨架塌陷，区别于经典的凋亡、铁死亡等形式^［1-2］。该过程通常在葡萄糖缺乏和胱氨酸积累的条件下被激活，导致细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）耗竭、细胞骨架蛋白异常交联，最终引起丝状肌动蛋白（filamentous actin，F-actin）解聚与细胞死亡。双硫死亡揭示了肿瘤代谢中的一个新的脆弱点，尤其适用于那些高度摄取胱氨酸、氧化还原稳态易受扰动的癌细胞^［3-4］。

干扰素α（interferon-α，IFN-α）是一种具有广泛生物活性的细胞因子，在临床上被用于治疗多种病毒感染及部分肿瘤^［5-7］。IFN-α不仅具备免疫调节与促凋亡作用，还能通过重塑肿瘤细胞葡萄糖代谢间接增强抗肿瘤免疫。IFN-α可通过抑制FBJ鼠科骨肉瘤病毒癌基因同源物B介导的缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF1）α信号通路，显著降低肝癌细胞的葡萄糖摄取能力，从而在肿瘤微环境中建立“高糖”状态，缓解T细胞与肿瘤细胞之间的代谢竞争，增强CD8⁺T细胞的激活及其对程序性死亡受体-1免疫治疗的应答^［8］。IFN-α在调控肿瘤代谢方面具有非经典功能，为其在非凋亡性细胞死亡中的潜在作用提供了新视角。特别是在肿瘤细胞葡萄糖可利用性受限时，NADPH易耗竭，二硫键应激加剧，可能触发双硫死亡过程，从而揭示了IFN-α诱导肿瘤细胞死亡的另一可能机制^［2］。本研究旨在探究IFN-α在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中诱导双硫死亡的作用，并进一步阐明该过程是否依赖于溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）通路。我们在HepG2与Huh7细胞株中分别构建了葡萄糖饥饿模型与IFN-α处理模型，评估其对细胞内二硫键积累、骨架结构变化和NADPH代谢的影响。同时，结合公开转录组数据库信息，筛选与IFN-α应答和双硫死亡相关的潜在调控因子。

材料与方法

1.细胞株与试剂：本研究所用人肝癌细胞株Huh7和HepG2购自上海吉凯基因科技有限公司。细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），在37 ℃、5%CO₂条件下培养。HepG2细胞按5×10⁵个/孔、Huh7细胞按2×10⁵个/孔接种于6孔板。

葡萄糖缺乏的DMEM购自Life Technologies公司。重组人IFN-α-2b注射液（3×10⁶ IU，0.3 mL）购自北京凯因科技股份有限公司。青霉胺（工作浓度为2 mmol/L）、BAY-876（工作浓度为5 μmol/L）、Z-VAD-FMK（Z-VAD，一种泛半胱天冬酶抑制剂，工作液浓度为20 μmol/L）及程序性坏死抑制剂坏死抑素-1［Necrostatin-1（Nec-1）］（工作液浓度为10 μmol/L）均购自美国MedChemexpress生物科技公司。

2.细胞凋亡检测：Annexin V-FITC/PI双染法检测，试剂盒购自BD Biosciences公司，并按说明书操作。HepG2和Huh7细胞分别以2×10⁶个/孔和1×10⁶个/孔接种于12孔板，经药物处理后消化收集，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，取约1×10⁵个细胞重悬于100 μL缓冲液中，置于流式管中检测。使用流式细胞仪采集数据，并以CytExpert 2.5软件进行分析。每次实验均设置空白对照及单阳性对照，均在严格一致的实验条件下进行，至少完成3次独立的生物学重复实验。

3.细胞活性检测：HepG2和Huh7分别以1.2×10⁴个/孔、8×10³个/孔接种于96孔板中，处理24 h后，更换为含10%细胞计数试剂盒-8（CCK-8）的新鲜培养基（每孔100 μL）。在细胞培养箱中孵育1 h后，使用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，计算细胞活性。每次实验均设置空白对照。实验至少完成3次独立的生物学重复实验。

4.实时荧光反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析：从细胞中使用RNAiso试剂（日本TaKaRa公司）提取总RNA。cDNA的合成采用PrimeScript RT试剂盒并结合基因组DNA去除试剂（日本TaKaRa公司）完成。转录水平的定量使用SYBR Green PCR试剂盒（德国QIAGEN公司）及特异性引物进行。β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）、蛋白酶体激活因子亚基1（proteasome activator subunit 1，PSME1）和泛素特异性肽酶18（ubiquitin-specific peptidase 18，USP18）的mRNA相对表达水平以β-肌动蛋白（β-actin）作为参照进行归一化（引物序列见表1），数据采用2^-ΔΔCt 方法进行分析。

表1.

本研究所用引物序列

基因名称	序列（5’→3’）	长度（bp）
β-actin	F： CATCCTCACCCTGAAGTACCCC	225
	R： AGCCTGGATGCAACGTACATG
B2M	F： GGCACCTGCTGAGATACTGA	136
	R： GCTAGAGGAAGCCAGTAGGTAA
PSME1	F： ATGCTTATGTGAGGAGGCTG	144
	R： GCAGGAAGGTCTCTGCTGTA
USP18	F： GAAGTGAAGTCGTGCTGTCCG	131
	R： TGCGAGGACTCAGCCAGGAT

注：β-actin为β-肌动蛋白；B2M为β2-微球蛋白；PSME1为蛋白酶体激活因子亚基1；USP18为泛素特异性肽酶18；F为正向引物；R为反向引物

5.蛋白质印迹（western blot，WB）检测：细胞裂解液为含1%苯甲基磺酰氟（北京索莱宝科技有限公司）和含1% Cocktail蛋白酶抑制剂（美国MedChemexpress生物科技公司）的NP40裂解液（美国MedChemexpress生物科技公司）。蛋白样品与Native PAGE缓冲液（日本TaKaRa公司）混合，分为还原与非还原组，前者加入2% β-巯基乙醇后进行凝胶蛋白电泳，电泳转膜后，以5%脱脂奶粉封闭，依次加入第一抗体和第二抗体孵育，增强化学发光法显色，图像由e-BLOT™ Touch Imager成像系统采集。

所用抗体包括：β-actin抗体（1∶2 000，武汉赛维尔生物科技有限公司），β-微管蛋白（β-tubulin）抗体（1∶2 000，北京爱必信生物技术有限公司），Drebrin抗体（1∶5 000，武汉三鹰生物技术有限公司），Myosin Ⅱa（1∶500，美国CST公司），xCT抗体（1∶2 000，美国Abcam公司），B2M抗体［1∶1 000，生工生物工程（上海）股份有限公司］，PSME1抗体［1∶1 000，生工生物工程（上海）股份有限公司］，USP18抗体（1∶1 000，武汉三鹰生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（二抗，1∶20 000，美国Jackson ImmunoResearch公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗，1∶20 000，美国Jackson ImmunoResearch公司）。

6.NADPH测定：采用比色法（试剂使用武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP⁺）与NADPH水平，并计算其比值。HepG2细胞常规培养24 h后，用1 000 IU/mL IFN-α和/或2 mmol青霉胺刺激48 h，另设葡萄糖饥饿条件（葡萄糖缺乏DMEM）实验组。使用酶标仪于450 nm处检测吸光度，通过酶促反应间接测定NADP⁺与NADPH含量及其比值。所有实验均在严格一致的实验条件下进行，包括相同的细胞接种密度及处理时间；每次实验均设置空白对照，以保证实验结果的准确性与可靠性。实验至少完成3次相互独立的生物学重复实验。

7.荧光染色实验：细胞处理后，以3.7%多聚甲醛室温固定10 min，经0.5% Triton X-100渗透5 min，PBS冲洗2次。随后加入100 nmol Actin-stain 555 Phalloidin（美国Cytoskeleton公司）染色30 min，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗淬灭封片液封片（北京索莱宝科技有限公司）。图像采集使用Nikon荧光显微镜。

8.siRNA及转染：SLC7A11 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，转染试剂为HiPerFect（德国QIAGEN公司）。siRNA序列如下：siSLC7A11：5′-UGGAGUUAUGCAGCUAAUU-3′；5′-GAGGUCAUUACACAUAUAU-3′。

9.差异表达分析与候选基因筛选：下载公共基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中IFN-α处理组与对照组的表达数据（GSE100928），使用R语言中limma包进行差异表达分析，筛选标准设定为|log₂FC|>1，P<0.05。将获得的差异表达基因与已报道的双硫死亡相关基因集进行交集筛选，提取候选调控基因^［2］。随后，利用clusterProfiler包进行GO分子功能富集分析，并使用GOplot包中的chord函数绘制弦图。

10.统计学方法：数据分析及作图使用GraphPad Prism 10.3.1软件完成。计量资料以±s表示；两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.人肝癌细胞HepG2和Huh7发生双硫死亡：为验证人肝癌细胞中是否存在双硫死亡现象，我们构建了HepG2和Huh7细胞的葡萄糖饥饿模型（图1）。在非还原条件下，WB结果显示，经葡萄糖饥饿处理可诱导2种细胞中出现迁移缓慢的高分子量蛋白条带，提示F-actin骨架发生二硫键积累（图1A）；该现象可被含巯基的双硫死亡抑制剂青霉胺有效逆转（图1B）。进一步检测结果提示，葡萄糖饥饿条件下细胞内NADPH水平显著降低，而青霉胺干预可明显缓解该耗竭（图1C）。免疫荧光染色结果表明，葡萄糖饥饿处理可诱导F-actin结构塌陷（图1E）。此外，葡萄糖转运受体1抑制剂BAY-876可模拟葡萄糖饥饿效应，同样诱导蛋白二硫键积累（图1D）。以上结果提示，葡萄糖饥饿可诱导HepG2和Huh7细胞出现典型的双硫死亡相关表型，包括二硫键应激、NADPH耗竭及细胞骨架塌陷。

图1. 糖饥饿诱导HepG2与Huh7细胞发生典型双硫死亡 1A为蛋白质印迹（WB）检测葡萄糖饥饿处理后非还原条件下高分子量蛋白条带的形成；1B为葡萄糖饥饿处理后青霉胺干预逆转蛋白聚集现象；1C为葡萄糖饥饿处理后细胞内NADPH水平变化；1D为葡萄糖转运受体1抑制剂BAY-876模拟葡萄糖饥饿效应的WB检测，BAY-876可诱导蛋白聚集；1E为F-actin免疫荧光观察细胞骨架结构变化.

注：Non-reducing为非还原条件；Reducing为还原条件；Glucose/Glu为葡萄糖；Drebrin为脑发育调节蛋白；β-actin为β-肌动蛋白；D-Pen为青霉胺；NADP⁺为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADPH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；Con为对照组；G-为葡萄糖饥饿处理；F-actin为肌动蛋白；Merge为合并图像；DAPI为4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（核染料）；MYH9为肌球蛋白重链9；青霉胺工作浓度为2 mmol/L；^aP<0.05，^bP<0.01

2.IFN-α在HepG2和Huh7细胞中可引起二硫键积累：为探究IFN-α是否可诱导二硫键应激导致的细胞死亡，首先通过流式细胞术观察其对细胞凋亡的影响。结果显示，IFN-α处理可显著提高HepG2和Huh7细胞的凋亡比例（图2A）。WB结果提示，在非还原条件下，IFN-α可诱导高分子量蛋白聚集，且IFN-α处理诱导的高分子量蛋白聚集随处理剂量增加（图2B）和时间延长（图2C）而增强。该结果提示，IFN-α处理可促进二硫键积累，可能参与细胞死亡的发生机制。

图2. IFN-α诱导HepG2与Huh7细胞凋亡及二硫键积累 2A为流式细胞术检测IFN-α处理48 h后细胞凋亡情况；2B为蛋白质印迹（WB）检测不同浓度IFN-α诱导48 h后的高分子量蛋白聚集；2C为WB检测1 000 IU/mL IFN-α在不同处理时间下的高分子量蛋白聚集变化.

注：Con为对照组；FITC Annexin V为荧光素异硫氰酸酯标记的Annexin V；Cell death为细胞死亡率；IFN-α为干扰素α；Non-reducing为非还原条件；Reducing为还原条件；Drebrin为脑发育调节蛋白；β-actin为β肌动蛋白；^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.001

3.IFN-α诱导HepG2和Huh7细胞发生双硫死亡：为验证IFN-α是否可诱导典型的双硫死亡，进一步采用青霉胺进行验证。在非还原性条件下，WB结果显示，IFN-α处理组中出现显著的高分子量蛋白聚集条带，而联合青霉胺处理可明显减弱该聚集（图3A）。同时，IFN-α处理导致NADPH水平下降，青霉胺可部分恢复（图3B）。F-actin免疫荧光结果亦显示，IFN-α诱导F-actin骨架塌陷，而青霉胺可逆转该现象（图3C）。上述结果表明，IFN-α处理可诱导二硫键积累、NADPH下降及细胞骨架塌陷等双硫死亡相关表型，青霉胺可部分逆转上述改变。

图3. IFNα诱导人肝癌细胞出现典型的双硫死亡相关表型 3A为蛋白质印迹检测IFN-α处理下高分子量蛋白条带形成，D-Pen干预后减弱；3B为在IFN-α处理后NADPH水平下降，D-Pen可部分恢复；3C为F-actin免疫荧光显示IFN-α诱导骨架塌陷，D-Pen可缓解.

注：Non-reducing为非还原条件；Reducing为还原条件；D-Pen为青霉胺；IFN-α为干扰素-α；Drebrin为脑发育调节蛋白；β-actin为β-肌动蛋白；NADP⁺为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADPH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；Con为对照组；F-actin为丝状肌动蛋白；Merge为合并图像；DAPI为4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；IFN-α工作浓度为1 000 IU/mL，D-Pen工作浓度为2 mmol/L，处理时间为48 h；^aP<0.05

为进一步验证双硫死亡的特异性，我们检测了细胞凋亡和坏死性凋亡抑制剂的干预效果。CCK8实验结果显示，IFN-α可显著降低HepG2和Huh7细胞活力，而青霉胺能够部分干预恢复；Z-VAD与Nec-1分别与IFN-α联合处理也在一定程度上改善细胞活力（图4A）。在IFN-α+青霉胺的基础上进一步联合Z-VAD或Nec-1，细胞活力较单独IFN-α+青霉胺组进一步提升（图4B）。同时，在非还原性WB检测中，青霉胺能明显减弱IFN-α诱导的高分子量蛋白聚集，而Z-VAD与Nec-1干预并未产生显著影响（图4C）。这些结果提示，凋亡和坏死性凋亡可能参与IFN-α诱导的细胞毒性反应，但不能完全解释二硫键异常积累等表型，提示除经典死亡方式外，可能还存在双硫死亡相关过程。

图4. IFN-α诱导的HepG2与Huh7细胞双硫死亡可被青霉胺缓解而不受Z-VAD或Nec-1影响 4A为CCK8检测显示IFN-α处理降低HepG2与Huh7细胞活力，D-Pen、Z-VAD和Nec-1均可恢复部分细胞活力；4B为在IFN-α+D-Pen基础上进一步联合Z-VAD或Nec-1可改善细胞活力；4C为蛋白免疫印迹提示IFN-α处理后高分子量蛋白条带形成，D-Pen干预后减弱，Z-VAD或Nec-1无明显影响.

注：Cell viability为细胞活力；Con为对照组；IFN-α为干扰素α；D-Pen为青霉胺；Z-VAD为广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK；Nec-1为程序性坏死抑制剂Necrostatin-1；Non-reducing为非还原条件；Reducing为还原条件；Drebrin为脑发育调节蛋白；β-actin为β肌动蛋白；IFN-α工作浓度为1 000 IU/mL，D-Pen工作浓度为2 mmol/L，Z-VAD工作浓度为20 μmol/L，Nec-1工作浓度为10 μmol/L，处理时间均为24 h;^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.001，^dP<0.000 1

4.IFN-α诱导的双硫死亡相关表型并不完全依赖于SLC7A11通路：在明确IFN-α可诱导典型的双硫死亡后，我们进一步探讨其是否依赖于SLC7A11通路。WB结果显示，IFN-α可呈剂量和时间依赖性地上调SLC7A11表达（图5A～B）。为评估其功能，分别将HepG2与Huh7细胞转染空载载体或SLC7A11 siRNA（图5C）。在非还原条件下，IFN-α处理后HepG2细胞出现明显的高分子量蛋白聚集条带，而在SLC7A11基因敲减（siSLC7A11-1）后，该条带未减弱，反而增强；Huh7敲减细胞亦观察到类似现象（siSLC7A11-2）（图5D～E）。该结果表明，尽管IFN-α可上调SLC7A11表达，但其诱导的双硫死亡相关表型并不完全依赖该通路，提示存在其他替代机制或通路在发挥作用。

图5. IFN-α诱导的双硫死亡相关表型并不完全依赖于SLC7A11通路 5A为HepG2和Huh7细胞上调SLC7A11表达存在IFN-α处理的浓度依赖性；5B为HepG2和Huh7细胞上调SLC7A11表达存在IFN-α处理的时间依赖性；5C为siRNA敲低SLC7A11基因的干预验证；5D为敲低SLC7A11基因后，IFN-α诱导的蛋白条带未减弱，反而增强；5E为各处理组中siSLC7A11对SLC7A11表达敲低效果的验证.

注：Con为对照组；IFN-α为干扰素α；SLC7A11为溶质载体家族7成员11；β-tubulin为β-微管蛋白；β-actin为β肌动蛋白；si#1为靶向SLC7A11的小干扰RNA-1；si#2为靶向SLC7A11的小干扰RNA-2；siSLC7A11为小干扰RNA靶向SLC7A11；Non-reducing为非还原条件；Reducing为还原条件；Drebrin为脑发育调节蛋白；β-actin为β-肌动蛋白

5.B2M、USP18和PSME1在双硫死亡中的潜在调控作用：为筛选IFN-α诱导双硫死亡过程中的关键调控因子，我们利用GSE100928数据集对IFN-α处理组与对照组的转录组数据进行了差异分析，获得了一系列差异表达基因（图6A）。将这些差异表达基因与文献［2］的双硫死亡相关基因集进行交集分析（P<0.05），共识别出3个显著上调的候选基因：B2M、USP18和PSME1（图6B）。进一步分析GO分子功能富集弦图，上述基因主要参与蛋白酶活性调节、去泛素化过程及主要组织相容性复合体结合等功能通路（图6C）。结果提示，B2M、USP18与PSME1可能是与IFN-α诱导双硫死亡相关的候选调控因子，其具体调控作用尚需进一步功能实验验证。

图6. 筛选与干扰素α（IFN-α）诱导双硫死亡相关的关键基因 6A为IFN-α处理组与对照组的差异表达基因；6B为差异基因与已报道的双硫死亡基因集的交集；6C为候选基因与其富集的分子功能之间的关联.

注：Up为上调基因；Down为下调基因；Not为无显著差异基因；B2M为β2-微球蛋白；USP18为泛素特异性肽酶18；PSME1为蛋白酶体激活因子亚基1

RT-PCR验证了转录组分析结果，在IFN-α处理后的HepG2与Huh7细胞中，B2M、USP18和PSME1均存在显著上调，而青霉胺干预可部分逆转其升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）（图7A）。其中，PSME1在蛋白表达水平亦表现出上调变化（图7B）。上述结果提示，B2M、USP18和PSME1可能与IFN-α诱导的双硫死亡相关，其中PSME1在蛋白和转录水平均呈上调趋势。

图7. IFN-α诱导双硫死亡相关协同因子的转录及蛋白水平验证 7A为RT-PCR检测IFN-α处理后HepG2与Huh7细胞中B2M、USP18、PSME1 mRNA表达变化，D-Pen干预后可部分逆转其升高趋势；7B为PSME1在蛋白水平上与转录水平表达一致.

注：Relative expression为相对表达量；B2M为β2-微球蛋白；USP18为泛素特异性肽酶18；PSME1为蛋白酶体激活因子亚基1；β-tubulin为β-微管蛋白；Con为对照组；IFN-α为干扰素-α；D-Pen为青霉胺；^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.001

讨论

本研究结果提示，IFN-α可诱导人肝癌细胞发生双硫死亡相关表型，该过程可能并不完全依赖于SLC7A11通路，其主要特征包括细胞内二硫键积累、NADPH耗竭及F-actin骨架塌陷，这一过程可被具有双硫死亡抑制及二硫键清除作用的青霉胺一定程度上逆转，表明该过程与细胞内二硫键应激密切相关。进一步结果显示，凋亡抑制剂Z-VAD和坏死性凋亡抑制剂Nec-1虽可在一定程度上提高IFN-α处理后肝癌细胞的细胞活力，但对二硫键异常积累表型未见明显干预作用；相比之下，青霉胺干预后上述改变可得到一定缓解。上述结果提示，凋亡和坏死性凋亡相关通路可能参与IFN-α诱导的细胞毒性反应，但可能不足以完全解释二硫键异常积累等表型改变，除经典细胞死亡方式外，尚可能存在与双硫死亡相关的过程参与其中。不同于以往葡萄糖饥饿条件下依赖SLC7A11高表达的经典模型，我们的研究表明，IFN-α诱导的双硫死亡相关表型可能并不完全依赖于SLC7A11通路，且其具体调控机制尚未明确。

SLC7A11作为调控细胞氧化还原稳态的关键转运蛋白，在程序性细胞死亡中发挥双刃剑作用。其适度表达可通过促进胱氨酸摄取和谷胱甘肽合成缓解氧化应激、抑制铁死亡；而在高表达且葡萄糖供应不足或NADPH生成受限的条件下，则可因NADPH大量消耗和二硫键应激积累而促进双硫死亡的发生^［9-14］。这一机制构成了既往葡萄糖饥饿条件下经典双硫死亡模型的重要理论基础。然而，本研究结果显示，IFN-α处理后SLC7A11敲减的人肝癌细胞中二硫键积累进一步加重，提示IFN-α诱导的双硫死亡相关表型可能并不完全依赖于SLC7A11通路。结合前述结果，SLC7A11在本研究中可能更多作为对照背景，而非主要介导因子。我们推测，IFN-α诱导的细胞死亡过程可能并非主要通过单一转运蛋白途径介导，而更可能涉及多种氧化应激相关分子及代谢通路的协同调控。

细胞代谢状态可能在IFN-α诱导的细胞死亡过程中发挥重要调节作用。既往研究表明，IFN-α可下调缺氧诱导因子-1α信号并抑制葡萄糖摄取，从而改变肿瘤微环境并增强免疫效应^［8］。这种代谢受限状态可降低肿瘤细胞NADPH供能能力，增加细胞内二硫键累积的风险，从而促进细胞死亡的发生^［2-3］。有研究提示，细胞代谢状态可以影响IFN下游蛋白的表达调控，比如在半乳糖培养条件下干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）蛋白水平显著升高，尽管IFITM3的mRNA表达未发生明显变化，这提示IFN信号在蛋白翻译或稳定性层面具有一定的代谢依赖性^{［13，15］}。基于上述证据推测，我们认为细胞代谢状态可能通过多层面调节IFN-α信号强度，并进一步影响其介导的细胞死亡结局^［16-17］。

近年来，IFN-α与非凋亡性细胞死亡之间的关系逐渐受到关注。例如，线粒体DNA损伤可通过环状鸟嘌呤核苷酸与腺嘌呤核苷酸合成酶-IFN基因刺激蛋白1信号通路激活自噬，从而诱导脂质过氧化及铁死亡^［18］。此外，Janus激酶-信号转导及转录激活因子信号通路的下游IFN刺激基因（interferon-stimula‑ted genes，ISGs）的表达存在明显组织特异性和代谢依赖性，不同代谢状态可显著影响IFN-α诱导的应答强度和细胞结局^［19-22］。这些结果从不同角度为本研究提出的“IFN-α可能通过代谢-应激相关机制影响非典型细胞死亡过程”提供了间接支持。

为进一步探讨IFN-α诱导双硫死亡的潜在调控机制，我们通过转录组数据筛选，识别出三个显著上调的ISGs：B2M、USP18和PSME1。这三者在细胞应激响应和免疫调控中具有重要作用，它们可能在IFN-α诱导的双硫死亡中发挥不同层次的作用^［1，23］。B2M作为MHC-I类分子的组成成分，其表达异常与多种肿瘤的免疫逃逸和治疗耐受相关^［24-25］，但在强氧化应激环境中，其功能可能受结构不稳定影响而受限^［26］。USP18为经典的IFN信号负调控因子，不仅可抑制信号转导及转录激活蛋白1/2磷酸化，还通过去ISG15化作用影响细胞对IFN的应答^［27-28］。已有研究表明，其上调可抑制SLC7A11表达并增强铁死亡敏感性，提示其在本研究中更可能作为信号调节“阀门”，调控IFN-α信号强度和细胞死亡阈值，而非直接驱动因子^［9］。PSME1是免疫蛋白酶体调节亚基，在蛋白质稳态维持和应对氧化应激中作用突出，且其蛋白结构中富含多个半胱氨酸残基^［29-30］。PSME1与PSME2共同组装形成七聚体蛋白酶体激活剂（proteasome activator，PA28）蛋白酶体调控复合物，既往研究表明，PA28缺陷小鼠可出现肝脏脂肪变性、胰岛素信号通路活性下降及肝糖异生增强，从而诱发肝源性胰岛素抵抗表型^［31-32］。本研究发现其在IFN-α处理后显著上调，且其蛋白结构中含有半胱氨酸残基，提示其可能与氧化还原应激相关；但其是否直接参与异常二硫键网络形成，仍需进一步实验验证。综上所述，B2M、USP18和PSME1可能与IFN-α诱导的双硫死亡相关，其中PSME1在转录和蛋白水平均上调。结合其已知生物学功能，推测其可能参与IFN-α诱导的细胞应激及死亡过程，但其具体作用及分子机制仍需进一步功能实验加以验证。

本研究仍存在一定局限性。首先，实验基于细胞水平，缺乏动物模型及临床样本验证，未来需进一步拓展以评估其普适性和临床相关性。其次，B2M、USP18与PSME1的作用机制尚未通过基因操作直接证明，尤其是PSME1在二硫键应激中的具体功能有待深入研究。最后，IFN-α与代谢通路的交叉调控仅停留在推测层面，其是否通过特定代谢酶或抗氧化系统影响双硫死亡仍需验证^［33-35］。综上所述，本研究提示，IFN-α可诱导人肝癌细胞出现与双硫死亡相关的表型改变，且该过程可能并不完全依赖于SLC7A11通路，其具体分子机制仍有待进一步研究。

利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明

毕晓晔, 张杰, 徐龙海, 等. 干扰素α诱导人肝癌细胞发生双硫死亡[J]. 中华肝脏病杂志, 2026, 34(4):312-323. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20250612-00233.

Funding Statement

山东省自然科学基金（ZR2022QH104）

Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2022QH104)