In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities and total polyphenol and flavonoid contents of Anadenanthera colubrina from northern Peru

Edert Abel Samame-Caramutti; Luis Salcedo-Valdez; Silvia Suárez-Cunza

doi:10.17843/rpmesp.2026.431.15207

. 2026 Mar 27;43(1):51–60. doi: 10.17843/rpmesp.2026.431.15207

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In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities and total polyphenol and flavonoid contents of Anadenanthera colubrina from northern Peru

Edert Abel Samame-Caramutti ¹, Luis Salcedo-Valdez ¹, Silvia Suárez-Cunza ¹

PMCID: PMC13245994 PMID: 42424283

ABSTRACT

Objectives.

To evaluate the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activity of the hydroethanolic extract of the bark of Anadenanthera colubrina from northern Peru, as well as its total polyphenol (TPC) and flavonoid (TFC) contents.

Materials and methods.

Antioxidant activity was evaluated using chemical assays for 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH^●) radical scavenging and ferric reducing antioxidant power (FRAP), as well as by measuring lipid peroxidation (formation of thiobarbituric acid reactive substances, TBARS) and H2O2-induced hemolysis. Anti-inflammatory activity was determined through heat-induced ovalbumin denaturation and hypotonicity-induced hemolysis assays.

Results.

The extract showed high antioxidant activity in both the DPPH^● radical scavenging assay (747.6 mg Trolox equivalents/gram of dry extract) and the FRAP assay (435.9 mg FeSO₄ equivalents/gram of dry extract). The extract (50 to 1000 µg/mL) inhibited lipid peroxidation, H2O2-induced hemolysis, and ovalbumin denaturation. No activity was observed in the hypotonicity-induced hemolysis assay. TPC and TFC were 642.7 mg gallic acid equivalents/gram and 416.2 mg catechin equivalents/gram of dry extract, respectively.

Conclusions.

These activities were reported for the first time for A. colubrina from northern Peru, suggesting that the hydroethanolic extract of A. colubrina bark possesses significant preliminary in vitro antioxidant and anti-inflammatory properties and that the high polyphenol and flavonoid contents may be responsible, at least partially, for these activities.

Keywords: Anti-Inflammatory Agents, Antioxidants, Flavonoids, In Vitro Techniques, Polyphenols

INTRODUCTION

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan is a South American Fabaceae widely used in folk medicine due to its known anti-inflammatory properties ¹, which is why it is considered a potential source of compounds with biological activity. One of the most used parts is the bark, mainly in the form of syrup, decoction, infusion, and maceration. These preparations are used to treat a variety of conditions, ranging from common problems such as allergies and inflammation to serious diseases such as anemia, respiratory diseases (for example, bronchitis and tuberculosis), and cancer; they also serve as healing agents ². In this sense, several studies have reported the antioxidant properties of the bark ³^,⁴, which may explain its anti-inflammatory activity in vivo ⁵ and in vitro ⁶. A. colubrina grows in the tropical rainforests and seasonally dry forests of Peru between 600 and 2000 m above sea level ⁷. Although this species has been widely used in South American folk medicine ⁸, it has not received due importance in northern Peru, where it is primarily used for wood production ⁷. Considering that there is scarce scientific information supporting its traditional use ⁹ and that the native variety from Peru has not been previously studied, the objective of this study was to determine the in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities of the bark of A. colubrina from northern Peru, as well as its total polyphenol and flavonoid content

KEY MESSAGES

Motivation for the study. Despite its widespread use in South American folk medicine, Anadenanthera colubrina from northern Peru is primarily used as timber, largely ignoring its medicinal potential.

Main findings. The hydroethanolic extract of A. colubrina bark presented substantial preliminary in vitro antioxidant and anti-inflammatory activities, attributable, at least partially, to its high polyphenol and flavonoid contents.

Public health implications. These findings demonstrate that A. colubrina from northern Peru has significant potential for preventing and treating inflammatory conditions and will benefit local inhabitants, who are often unaware of the medicinal properties of our natural resources, thereby reinforcing its value both in Peru and abroad.

MATERIALS AND METHODS

Reagents and standards

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH^●), Folin-Ciocalteu phenol reagent (2N), gallic acid, (+)-catechin, (+)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox), 2-thiobarbituric acid, and sodium monobasic phosphate (> 99%) were obtained from Sigma-Aldrich (MO, USA). Sodium carbonate, sodium chloride (> 99.5%), D(+)-glucose, Perhydrol® 30% H2O2, and anhydrous disodium phosphate (99%) were purchased from Merck (Germany). Citric acid-1-hydrate was obtained from Riedel-de Haën (Germany). Diclofenac sodium was a generous donation from a national pharmaceutical laboratory. All other chemicals used were of analytical grade. All absorbance values were determined using a Thermo Fisher Scientific Genesys 50S UV-Vis spectrophotometer (Waltham, MA, USA) in 1 cm quartz cuvettes.

Plant material and extraction

The bark of Anadenanthera colubrina (3 kg) was collected locally in the primary forest of Las Juntas (Department of Cajamarca, Peru) (5°20’30” S, 78°46’00” W; average altitude 625 m) (10), with the authorization of the local inhabitants. The plant was authenticated by Prof. Eric Rodríguez-Rodríguez, and two reference specimens were deposited in the Herbarium Truxillense of the Universidad Nacional de Trujillo (Trujillo, Peru) (specimen code numbers: 57669-HUT and 57670-HUT) (supplementary material: figure 1).

The hydroethanolic extract was obtained using methods reported in the literature for other Fabaceae ¹¹^,¹², with modifications; briefly, the bark was dried for 14 days at room temperature and ground. A sample of powdered bark (1.4 kg) was extracted through successive exhaustive extraction with 96% ethanol (1:2 w/v) for 48 hours at room temperature under stirring. The crude extracts were combined, filtered, and concentrated to dryness, yielding a reddish-brown dry product (A. colubrina bark hydroethanolic extract, EEAC). The extraction yield was 20.7%. The EEAC was stored at 4°C.

The EEAC was completely dissolved in a mixture of 96% ethanol: bidistilled water (1:29), and this solution was used for all assays.

Physicochemical analysis

The soluble solids content of the EEAC (2 mg/mL) was determined gravimetrically using an Ohaus® PioneerTM analytical balance (120 g, d = 1 mg; Parsippany, NJ, USA), and by measuring the refractive index (solvent: 96% ethanol: bidistilled water, 1:29) using an ATAGO® PAL-α handheld refractometer (Tokyo, Japan). The pH was obtained using pH indicator strips (Merck, Germany).

Qualitative phytochemical analysis and total polyphenol (TPC) and flavonoid (TFC) content:

Qualitative phytochemical analysis was performed according to Lock de Ugaz ¹³. TPC was determined by the Folin-Ciocalteu method ¹⁴. The EEAC (40-120 µg/mL, 0.1 mL) was incubated with 10% Folin reagent (0.5 mL) and 7.5% w/v Na2CO3 (0.4 mL) at room temperature for 30 minutes. Absorbance changes were read at 765 nm. Results were expressed in mg of gallic acid equivalents (GAE)/g of dry EEAC, and were calculated from a calibration curve using gallic acid as a standard (0-100 μg/mL) and the formula:

TPC: mg GAE / g EEAC = (A_s * DF) / (m * c)

where As is the absorbance with the sample (EEAC), m is the slope of the gallic acid standard curve equation, c is the concentration of the sample (EEAC), and DF is the dilution factor.

TFC was estimated as described by Zhishen et al. ¹⁵. The EEAC (50-250 µg/mL, 0.5 mL) was incubated, successively, with 5% NaNO2 (w/v; 0.15 mL) for 5 minutes, 2.5% AlCl3 (w/v; 0.25 mL) for 6 minutes, and 1M NaOH (0.25 mL) for 10 minutes. Changes in absorbance were read at 510 nm. Results were expressed as mg of catechin equivalents (CE)/g of dry EEAC, and were calculated from a calibration curve using catechin as a standard (0-72 µg/mL) and the formula:

TFC: mg CE / g EEAC = (A_s * DF) / (m * c)

where m is the slope of the catechin standard curve equation, and As, c, and DF are as indicated before.

Antioxidant activity (Chemical and biological assays):

DPPH^● free radical scavenging assay

The DPPH^● free radical scavenging activity was evaluated according to Brand-Williams et al. ¹⁶. Briefly, a DPPH^● solution (20 mg/dL) prepared in ethanol was stirred for 40 minutes; this stock solution was kept in the dark at 4°C. The initial absorbance of the working solution was adjusted to 0.9 + 0.02 at 517 nm (DPPH^● concentration: 78.5 μM) with the same solvent, and was used to prepare the control (absorbance: 0.6 + 0.02). The EEAC (5-20 µg/mL, 0.4 mL) was incubated with the DPPH^● working solution (0.8 mL) for 30 minutes in the dark. Changes in absorbance were read at 517 nm. The radical scavenging percentage was calculated as:

% radical scavenging = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

where Ac and As are the absorbances without (negative control) and with the sample, respectively.

The inhibitory concentration values of EEAC required to scavenge 50% of the initial free radical (IC50) were calculated by linear regression. The Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC- DPPH^●) was expressed as mg TE/g of dry EEAC, and was calculated from a calibration curve using Trolox as a standard (0-15 µg/mL) and the formula:

TEAC- DPPH^●: mg TE / g EEAC = IC50 Trolox / IC50 EEAC

Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay

The assay was performed according to Benzie and Strain ¹⁷. The EEAC (40-160 μg/mL, 50 μL) was added to 950 μL of the FRAP working solution (10mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) in 40mM HCl, 20mM FeCl3 in bidistilled water, and 0.3M acetate buffer, pH 3.6, in a ratio of 1:1:98). The reaction mixtures were incubated for 10 min. Changes in absorbance were read at 593 nm. Results were expressed as mg FeSO4 equivalents/g of dry EEAC, and were calculated from a calibration curve using FeSO4 as a standard (0-91 µg/mL) and the formula:

FRAP: mg Eq FeSO_4 / g EEAC = (A_s * DF) / (m * c)

where As is the absorbance with the sample (EEAC), m is the slope of the FeSO4 standard curve equation, c is the concentration of the sample (EEAC), and DF is the dilution factor.

Lipid peroxidation inhibition assay using thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)

Oxidative stress, expressed as TBARS, was measured by the method of Buege and Aust ¹⁸, with modifications. Frozen liver tissue from a Holtzman rat (previously perfused with ice-cold 0.154M KCl) was homogenized in cold phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). Lipid peroxidation was initiated by adding 4 mM ascorbic acid (0.045 mL) and 2 mM FeSO4 (0.015 mL) successively to the 5% liver homogenate (w/v, 0.9 mL). Subsequently, different concentrations of EEAC (100-1000 μg/mL, 0.06 mL) or PBS (pH 7.4, 0.06 mL and 0.12 mL for the induced stress and control groups, respectively) were included in the reaction mixtures; then, these were incubated for 30 minutes at room temperature. Afterward, each reaction mixture (0.3 mL) was mixed with 20% trichloroacetic acid (0.6 mL), heated in boiling water for 15 minutes, cooled with tap water, mixed with 0.67% thiobarbituric acid (TBA in 0.25 N HCl, 0.9 mL) and heated again in boiling water for 30 minutes. After cooling with cold tap water, each tube was centrifuged (5488xg for 10 minutes), the supernatant was collected, and the absorbance was determined at 535 nm.

Antioxidant activity was expressed as a percentage of lipid peroxidation inhibition and as TBARS concentration. The percentage of lipid peroxidation inhibition was calculated as follows:

% lipid peroxidation inhibition = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

where Ac is the absorbance of the induced stress group (0% lipid peroxidation inhibition, negative control) and As is the absorbance with the sample (EEAC).

The TBARS concentration was expressed as nmol of TBARS/mg of liver tissue and was calculated as follows:

TBARS: (nmol TBARS/mg liver tissue) = (A_s * V_t) /

(ε * l * Vs * CH)

where As is the absorbance of each reaction mixture, Vt is the final volume of the reaction mixture, ε is the molar absorption coefficient of the MDA-TBA2 complex at 535 nm (1.56 x 105 M-1 cm-1), l is the optical path of the cuvette (1 cm), Vs is the sample volume in the reaction mixture, and CH is the rat liver homogenate concentration.

H₂O₂-induced oxidative hemolysis assay

The assay was performed following the method of Xu et al. ¹⁹, with modifications. Fresh human venous blood (3 mL) was employed from a healthy donor and diluted with sterilized Alsever's solution (2% dextrose, 0.8% sodium citrate, 0.05% citric acid, and 0.42% NaCl in bidistilled water). The solution was centrifuged (625xg for 3 minutes) and washed three times with the same volume of vehicle (cold 1X PBS, pH 7.4) to separate human red blood cells (RBCs) from the white blood cell layer, plasma, and free hemoglobin (Hb) released from injured RBCs. A 5% RBC suspension (in ice-cold Alsever’s solution, 0.1 mL) was mixed with EEAC (50-150 μg/mL, 0.45 mL) or vehicle (0.45 mL and 0.9 mL for the induced stress and control groups, respectively). The reaction mixtures were preincubated at 37 °C for 15 minutes. Then, 166mM H2O2 (in vehicle, 0.45 mL) was added, the reaction mixture was incubated at 37°C for 4 hours and centrifuged at 625xg for 10 minutes. The Hb content in the supernatant was estimated at 405 nm. After each assay, the RBC solution was stored at 4°C for a maximum of 72 h to ensure viability and the level of cellular antioxidants. The percentage of hemolysis prevention was calculated as follows:

% hemolysis prevention = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

where Ac is the absorbance of the induced stress group (0% hemolysis prevention, negative control) and As is the absorbance with the sample (EEAC).

Anti-inflammatory activity

Inhibition of ovalbumin denaturation

The assay was carried out as described by Mizushima and Kobayashi ²⁰ and Chandra ^{et al}. ²¹, with modifications. The reaction mixture (1.3 mL) consisted of fresh ovalbumin: PBS (pH 6.4) (1:1, 0.1 mL), PBS (pH 6.4, 0.7 mL), and different concentrations of the EEAC (125-750 μg/mL, 0.5 mL). Bidistilled water and diclofenac sodium (0.5-3 mg/mL) were used for the induced stress group and as a standard, respectively. The reaction mixtures were incubated at 37 + 1°C for 20 minutes and subsequently heated at 65 + 2°C for 5 minutes to induce denaturation. After cooling, absorbance changes were read at 660 nm. The percentage of protein denaturation inhibition was calculated as:

% protein denaturation inhibition = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

where Ac is the absorbance of the induced stress group (0% protein denaturation inhibition, negative control) and As is the absorbance with the sample.

Human red blood cell (RBC) membrane stabilization

The assay was performed according to the procedures described by Lavanya et al.²² and Torres Carro et al. ²³, with modifications. Fresh human venous blood (3 mL) from a healthy donor was used and diluted with an equal volume of sterilized Alsever's solution. The solution was centrifuged (5,488xg for 10 minutes) and the cell pack was washed five times with an equal volume of isotonic saline solution (0.85% NaCl, pH 7.2) to prepare a 10% (v/v) RBC suspension with isotonic saline solution. The suspension was stored at 4°C. The reaction mixture (1.5 mL) consisted of the 10% RBC suspension (0.2 mL), 0.14M sodium phosphate buffer (pH 7.4, 0.333 mL), and different concentrations of the EEAC (250-750 μg/mL, 0.267 mL). Bidistilled water (0.7 mL) was used to induce hypotonic hemolysis. Vehicle (96% ethanol: bidistilled water, 1:29) and diclofenac sodium (1-3 mg/mL) were used for the induced stress group and as a standard, respectively. The reaction mixtures were incubated at 37 + 1°C for 30 minutes and then centrifuged at 650xg for 3 minutes. The Hb content in the supernatant was measured at 550 nm. After each test, the RBC solution was stored at 4°C for a maximum of 72 h to ensure cell viability. The percentage of hemolysis prevention was calculated as follows:

% hemolysis prevention = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

where Ac is the absorbance of the induced stress group (0% hemolysis prevention, negative control) and As is the absorbance with the sample.

Statistical analysis

The assays were performed in three independent experiments, each conducted in duplicate or triplicate. All analyses were performed using Minitab Statistical Software and GraphPad Prism (version 8.0.1). Normality and homogeneity of data variances were evaluated using Shapiro-Wilk and Levene tests, respectively (p>0.05 in both). Since the data were normally distributed, a one-way ANOVA followed by Tukey's post-hoc test was used. Results are expressed as mean + standard deviation, and statistical significance was defined as p<0.05.

Ethical aspects

The study was carried out in accordance with the Declaration of Helsinki ²⁴ and established ethical standards. A human blood sample was obtained from a healthy volunteer at the Institute of Biochemistry and Nutrition Research (IIBN), UNMSM, after receiving written informed consent. Regarding the animal component, we used liver tissue from a rat without prior treatment as a secondary use of samples from a parallel IIBN project, following the 3Rs principles (Replacement, Reduction, and Refinement) to avoid the sacrifice of additional animals. This project was approved by the Ethics Committee of the Faculty of Medicine of the UNMSM (Ethics Approval No. 0185-2024), in accordance with the Ethical Evaluation Act of Research Studies.

RESULTS

Physicochemical analysis

The soluble solids content was 1.606 + 0.3 mg/mL and 1.711 + 0.2 mg/mL, according to the refractive index and gravimetric analysis, respectively. The pH was 5.5-6.0 (slightly acidic).

Qualitative phytochemical analysis, TPC and TFC

As presented in supplementary material: table1, the EEAC has a high content of phenolic compounds (tannins and flavonoids), low content of glycosides, anthraquinones, and anthrones, and undetectable or null presence of alkaloids, triterpenes, steroids, and saponins.

The determination of total polyphenols and flavonoids confirmed their abundance, with 642.7 + 17 mg (3.78 + 0.1 mmol) GAE/g and 416.2 + 20 mg (1.6 + 0.08 mmol) CE/g dry extract, respectively; that is, TPC represents approximately 65% in GAE of the extract, which mainly includes flavonoids (around 41% in CE of the extract). The flavonoid/polyphenol ratio was 0.65.

Antioxidant activity (Chemical and biological assays)

DPPH^● free radical scavenging assay

The EEAC showed an IC50 value (4.37 µg/mL) close to the Trolox standard (3.26 µg/mL, Figure 1 and supplementary material: table 2). The aforementioned value represents a TEAC- DPPH^● of 747.55 mg (2.99 mmol) Trolox equivalents/g dry EEAC (supplementary material: table 2).

FRAP assay

The EEAC exhibited an antioxidant capacity of 435.88 mg (2.87 mmol) FeSO4 equivalents/g dry EEAC (Figure 2 and supplementary material: table 2).

Lipid peroxidation inhibition assay using TBARS

All tested concentrations (100, 500, and 1000 μg/mL) were effective in reducing lipid peroxidation in a dose-dependent manner, by 22, 59, and 68%, respectively, with respect to the induced stress (IS) group (Figure 3a). No differences were found between treatment with EEAC at 1000 μg/mL and the Control group (72%).

When expressed as nmol/mg of liver tissue, TBARS production was higher in the IS group than in the EEAC treatments at 500 and 1000 μg/mL, indicating a dependency on the extract concentration. No differences were found between the IS group and EEAC at 100 μg/mL, nor between the Control and EEAC treatments at 500 and 1000 μg/mL (Figure 3b).

H₂O₂-induced oxidative hemolysis assay

The EEAC, administered at 50, 100, and 150 μg/mL, decreased hemolysis caused by H2O2 when compared with the IS group (Figure 4). Hemolysis prevention was dose-dependent only for the 50 and 100 μg/mL treatments (49 and 75% inhibition, respectively) since the 150 μg/mL treatment caused an inhibition (65%) similar to that observed for the 100 μg/mL group. Interestingly, the percentage of inhibition for the three concentrations of EEAC was much higher than that reported for the Control group (18%).

Anti-inflammatory activity

Inhibition of ovalbumin denaturation

A dose-dependent inhibition of ovalbumin denaturation was observed with EEAC at 125, 250, and 500 μg/mL, at 34, 42, and 47%, respectively, with respect to the IS group (Figure 5). Curiously, the extract at 750 μg/mL reduced denaturation by only 40%, lower than the inhibition observed at 500 μg/mL. In any case, the EEAC at all analyzed concentrations showed higher inhibition than the non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) diclofenac sodium at 0.5 and 1 mg/mL (19 and 22%, respectively), but lower than said reference at 3 mg/mL (58%). The EEAC at 250 and 500 μg/mL showed better inhibition of protein denaturation than diclofenac sodium at 2 mg/mL.

RBC membrane stabilization

EEAC at 250, 500, and 750 μg/mL did not have a significant effect on hypotonicity-induced hemolysis. In this aspect, the extract at 250 and 500 μg/mL produced slightly higher hemolysis than the IS group (6 and 5%, respectively). Likewise, the concentration of 750 μg/mL inhibited hemolysis by only 6%. Despite this, none of the concentrations showed a significant difference compared to the IS group. On the other hand, diclofenac sodium inhibited hemolysis between 29% and 42% at the concentrations used (1, 2, and 3 mg/mL).

DISCUSSION

The results concerning the phytochemical content of the EEAC are consistent with previous reports on the bark of A. colubrina, i.e., the hydroalcoholic extract is rich in phenolic compounds ⁴^,²⁵, which include both tannins and flavonoids ⁶. However, some previous studies are inconsistent with the results of this phytochemical analysis. Silva et al. ²⁶ reported the presence of alkaloids and saponins, as well as the absence of flavonoids, anthraquinones, and glycosides in the hydroalcoholic bark extract. On the other hand, Sá et al. ²⁷ revealed that the hydroalcoholic bark extract contains phenolic compounds, tannins, and sugars, but flavonoids, steroids, or terpenoids were not detected. Additionally, Pessoa et al. ²⁸ reported the presence of reducing sugars, saponins, triterpenes, and steroids. These differences would indicate that edaphic and environmental conditions, as well as differences in extraction procedures, affect the biosynthesis or the presence of secondary metabolites despite being the same species.

Interestingly, the hydroethanolic bark extract of the Brazilian variety reported by Mota et al. ⁴⁾ showed higher TPC and TFC values than those of the native A. colubrina variety from northern Peru investigated in this study (682 mg GAE/g extract and 445 mg CE/g extract for the Brazilian variety vs. 643 mg GAE/g extract and 416 mg CE/g extract for the Peruvian variety, respectively). Despite this, the Peruvian variety has higher antioxidant properties than the aforementioned Brazilian variety.

The EEAC showed good behavior in two antioxidant assays with different mechanisms of action, single electron transfer for the FRAP assay and hydrogen atom transfer or single electron transfer for the DPPH^● radical scavenging assay ²⁹. Moreover, as reported by Desmarchelier et al. ³⁰, the EEAC decreased the formation of malondialdehyde and other TBARS as by-products of lipid peroxidation in rat liver homogenates and, furthermore, reduced the oxidative damage caused by H₂O₂ in an RBC model, showing the ability of the EEAC to decrease oxidative stress in vitro.

These results suggest that the Peruvian variety of A. colubrina possesses the antioxidant activity previously reported for the bark. This antioxidant activity is likely due to the phytochemical content of the EEAC, mainly phenolic compounds (tannins and flavonoids) ⁴. Nonetheless, there are some contradictory results regarding polyphenol production by A. colubrina under different environmental conditions ³¹, which in turn could explain some discrepancies between the present study and previous reports ⁴^,²⁶^,³².

It is noteworthy that the Peruvian variety exhibited a higher TEAC- DPPH^● value and a lower IC₅₀ than the Brazilian variety reported by the aforementioned study by Mota et al. ⁴ (269 mg Trolox equivalents/g extract and 13 μg/mL for the Brazilian variety vs. 748 mg Trolox equivalents/g extract and 4 μg/mL for the Peruvian variety, respectively). Consequently, the antioxidant properties (TEAC- DPPH^● and IC₅₀) of the Brazilian variety would be considered only moderately intense ⁴, and lower than those of the Peruvian variety reported here.

These findings indicate that, as previously mentioned, in addition to differences in extraction techniques, edaphic and environmental conditions influence the presence of secondary metabolites and, consequently, the biological activity of the extracts. This is particularly evident when comparing these results with the studies by Mota et al. (2017) ⁴ and Silva et al. (2020) ²⁶ mentioned above, since all these studies used hydroethanolic extracts. Worth noting is the report by Silva et al. (2020) ²⁶, which revealed the presence of compounds absent in the EEAC, as well as the absence of flavonoids, which were abundant here. Furthermore, their extract exhibited an IC50 of 20 μg/mL in the DPPH assay, much higher than the 4.37 μg/mL reported in the present work.

The different extraction methods also contribute to variations in phytochemical content and antioxidant activity. In this context, several studies have reported the activity of hydromethanolic extracts of A. colubrina bark; for example, Sá et al. (2016) reported reduced extraction of flavonoids ²⁷, which were abundant in the present study. Additionally, Pessoa et al. (2012) detected molecules such as saponins, triterpenes, and steroids ²⁸ that were absent in this investigation. This type of extract also showed higher antioxidant activity in the TBARS assay (IC₅₀ of 62 μg/mL) ³⁰ compared to the present study (IC₅₀> 100 μg/mL), but lower activity in the DPPH assay (IC50 of 73 μg/mL) ³².

The use of aqueous extracts of A. colubrina bark also yielded interesting results. Specifically, Damascena et al. (2014) ³ revealed an IC₅₀ of 8.63 μg/mL in the DPPH assay, indicating lower antioxidant activity compared to this work. Conversely, aqueous extracts showed variable antioxidant activities in the TBARS assay, which were similar ³ or higher ³⁰ than those observed with the EEAC.

The ovalbumin denaturation assay was used to evaluate the anti-inflammatory activity of A. colubrina. This method is based on the stabilizing action of NSAIDs on heat-induced protein coagulation ²⁰. Since the denaturation of tissue proteins is capable of initiating immune responses and causing inflammatory disorders, it has been suggested that compounds that prevent protein denaturation could have anti-inflammatory potential ³³. In this aspect, the EEAC prevented heat-induced ovalbumin denaturation to a greater extent than the NSAID diclofenac sodium, which has a known protective activity against protein denaturation.

To corroborate this anti-inflammatory effect, the RBC membrane stabilization assay was performed. This assay is based on the similarity between erythrocyte and lysosomal membranes. Lysosomal membrane stabilization is desirable, since lysosomes can release their hydrolytic enzymes into affected tissues during the inflammatory response. The effect of any extract on erythrocyte stabilization could be extrapolated to lysosomal membrane stabilization and, therefore, the anti-inflammatory activity of an extract can be evaluated by preventing hemolysis ³⁴.

No activity was observed at the same concentrations used in the denaturation assay; on the contrary, the EEAC increased hypotonicity-induced hemolysis, although these results were not entirely unexpected. The EEAC is rich in tannins (supplementary material: table 1), which could have hemolytic activity on RBCs ³⁵. In this sense, Rocha et al. ²⁵ reported that the hydroalcoholic extract of A. colubrina bark was slightly toxic to RBCs, even at low concentrations (0.25 to 32 mg/mL). From this perspective, the high tannin content of the EEAC could explain the hemolysis observed in the present study. As described by Deng et al. (2019) ³⁵, high concentrations of some tannins could cause changes in erythrocyte morphology and hemolysis, possibly due to the phenolic hydroxyl groups of tannins, which adsorb onto the cell membrane, causing deformations that lead to its rupture. It is well known that tannins bind to and alter cell membrane proteins and lipids, thereby modifying their permeability and causing cell damage and lysis, which also affects blood coagulation.

Although these results would indicate that the EEAC is a potential source of anti-inflammatory compounds, especially those related to protein denaturation, it must be considered that the assays were performed in vitro, and do not necessarily show what would occur in vivo, as the bioavailability of active compounds, such as tannins, must be considered. However, it is promising that A. colubrina has demonstrated better inhibitory activity than an NSAID like diclofenac sodium, which can inhibit protein denaturation in a dose-dependent manner.

In conclusion, the biological properties of Anadenanthera colubrina from northern Peru were reported for the first time. In this sense, the hydroethanolic bark extract (EEAC) possesses strong preliminary in vitro antioxidant activity, as well as a high content of total polyphenols and flavonoids. Furthermore, the EEAC prevented heat-induced ovalbumin denaturation to a greater extent than the NSAID diclofenac sodium. These results suggest that A. colubrina from northern Peru is a good source of compounds with biological activity, benefiting the inhabitants of those areas, who might be unaware of the medicinal properties of their own resources. Furthermore, a practical methodology for evaluating the antioxidant and anti-inflammatory activities of Peruvian medicinal plants is provided.

As an additional recommendation for the use of A. colubrina, it is suggested that excess saponins and tannins be removed using standardized extraction methods to optimize its biological properties, since these compounds, although present in the bark, can exert toxic effects at high concentrations. Further research is needed to determine the safety and specific mechanisms of action of A. colubrina, and to purify and identify the potential molecules responsible for the observed pharmacological activity.

Acknowledgments

The authors thank Dr. Mercedes Soberón-Lozano (UNMSM) and Dr. Consuelo Rojas-Idrogo (Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo) for their constructive comments. We also thank the residents of the locality of Las Juntas (Cajamarca) for allowing the collection of A. colubrina bark samples for this study.

Biographies

Biologist, Bachelor in Biology

Pharmaceutical chemist, Doctor in Pharmacy and Biochemistry

Funding Statement

Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) con el fondo PCONFIGI-INV 2023 A23010421

Funding.: This work was partially funded by the Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) with fund PCONFIGI-INV 2023 A23010421.

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This study is part of the thesis: Samame-Caramutti EA. Evaluación del efecto antiinflamatorio y antioxidante de los metabolitos secundarios del extracto etanólico de la corteza de Anadenanthera colubrina “vilca” en modelos in vitro [Master's Thesis]. Lima: Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos; 2025. The preprint of this study is available on BioRxiv at https://doi.org/10.1101/2025.01.24.633472. The data supporting the findings of this study are available in the Science Data Bank at https://doi.org/10.57760/sciencedb.23619.

^{Cite as.}

Samame-Caramutti EA, Salcedo-Valdez L, Suárez-Cunza S. Actividades antioxidante y antiinflamatoria in vitro y contenidos de polifenoles y flavonoides totales de Anadenanthera colubrina del norte peruano. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2026;43(1):51-60. doi: 10.17843/rpmesp.2026.431.15207.

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Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2026 Mar 27;43(1):51–60. [Article in Spanish]

Actividades antioxidante y antiinflamatoria in vitro y contenidos de polifenoles y flavonoides totales de Anadenanthera colubrina del norte peruano

Edert Abel Samame-Caramutti ¹, Luis Salcedo-Valdez ¹, Silvia Suárez-Cunza ¹

RESUMEN

Objetivos.

Evaluar la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro del extracto hidroetanólico de la corteza de Anadenanthera colubrina del norte peruano, así como sus contenidos de polifenoles (CPT) y flavonoides (CFT) totales.

Materiales y métodos.

La actividad antioxidante fue evaluada usando los ensayos químicos de captación de radicales 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH^●) y de poder antioxidante reductor férrico (FRAP), así como midiendo la peroxidación lipídica (formación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, TBARS) y hemólisis inducida por H₂O₂. La actividad antiinflamatoria fue determinada mediante los ensayos de desnaturalización de ovoalbúmina inducida por calor y hemólisis inducida por hipotonicidad.

Resultados.

El extracto mostró una alta actividad antioxidante tanto en el ensayo de captación de radicales DPPH^● (747,6 mg equivalentes Trolox/gramo de extracto seco) como en el ensayo de FRAP (435,9 mg equivalentes FeSO₄/gramo de extracto seco). El extracto (50 a 1000 μg/mL) inhibió la peroxidación lipídica, la hemólisis inducida por H₂O₂, y la desnaturalización de ovoalbúmina. No se observó actividad en el ensayo de hemólisis inducido por hipotonicidad. El CPT y el CFT fueron de 642,7 mg equivalentes de ácido gálico/gramo y 416,2 mg equivalentes de catequina/gramo de extracto seco, respectivamente.

Conclusiones.

Estas actividades fueron reportadas por primera vez para A. colubrina del norte peruano, y sugiere que el extracto hidroetanólico de la corteza de A. colubrina posee propiedades antioxidante y antiinflamatoria preliminares significativas in vitro y que los altos contenidos de polifenoles y flavonoides pueden ser responsables, al menos parcialmente, de estas actividades.

Palabras clave: Antinflamatorios, Antioxidantes, Flavonoides, Ensayos in vitro, Polifenoles

INTRODUCCIÓN

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan es una Fabaceae sudamericana ampliamente usada en la medicina popular debido a sus conocidas propiedades antiinflamatorias ¹ por lo que se le considera una fuente potencial de compuestos con actividad biológica.

Una de las partes más utilizadas es la corteza, principalmente en forma de jarabe, decocción, infusión y maceración. Estas preparaciones se utilizan para tratar una variedad de afecciones, que van desde problemas comunes como alergias e inflamación hasta enfermedades graves como anemia, enfermedades respiratorias (por ejemplo, bronquitis y tuberculosis) y cáncer; también sirven como cicatrizantes ². En este sentido, varios estudios han reportado las propiedades antioxidantes de la corteza ³^,⁴, las que pueden explicar su actividad antiinflamatoria in vivo⁵ e in vitro⁶.

A. colubrina crece en los bosques tropicales lluviosos y estacionalmente secos del Perú entre los 600 y 2000 m sobre el nivel del mar ⁷. Aunque esta especie ha sido ampliamente utilizada en la medicina popular sudamericana ⁸, no ha recibido la debida importancia en el norte del Perú, donde se emplea principalmente para la producción de madera ⁷. Considerando que existe escasa información científica que avale su uso tradicional ⁹ y que la variedad nativa del Perú no ha sido estudiada previamente, el objetivo de este estudio fue determinar las actividades antioxidante y antiinflamatoria in vitro de la corteza de A. colubrina del norte peruano, así como su contenido total de polifenoles y flavonoides.

MENSAJE CLAVE

Motivación para realizar el estudio. A pesar de su amplio uso en la medicina popular sudamericana, Anadenanthera colubrina del norte peruano es empleada principalmente como maderable, ignorando ampliamente su potencial medicinal.

Principales hallazgos. El extracto hidroetanólico de la corteza de A. colubrina presentó actividades antioxidante y antiinflamatoria preliminares sustanciales in vitro, atribuibles, al menos parcialmente, a sus altos contenidos de polifenoles y flavonoides.

Implicancias para la salud pública. Estos hallazgos demuestran que A. colubrina del norte peruano tiene potencial significativo para prevenir y tratar condiciones inflamatorias, y beneficiarán a los habitantes locales, quienes a menudo desconocen las propiedades medicinales de nuestros recursos naturales, reforzando así su valor tanto en el Perú como en el extranjero.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos y estándares

2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH^●), reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu (2N), ácido gálico, (+)-catequina, ácido (+)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox), ácido 2-tiobarbitúrico y fosfato de sodio monobásico (> 99%) se obtuvieron en Sigma-Aldrich (MO, EEUU). Carbonato de sodio, cloruro de sodio (> 99,5%), D(+)-glucosa, Perhydrol® 30% H₂O₂ y fosfato disódico anhidro (99%) se compraron en Merck (Alemania). Ácido cítrico-1-hidrato se obtuvo de Riedel-de Haën (Alemania). Diclofenaco sódico fue una generosa donación de un laboratorio farmacéutico nacional. Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado analítico.

Todos los valores de absorbancia fueron determinados usando un espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific Genesys 50S UV-Vis (Waltham, MA, EEUU) en cubetas de cuarzo de 1 cm.

Material vegetal y extracción

La corteza de Anadenanthera colubrina (3 kg) fue recolectada localmente en el bosque primario de Las Juntas (departamento de Cajamarca, Perú) (5°20’30” S, 78°46’00” O; altitud media 625 m) ¹⁰, con la autorización de los habitantes locales. La planta fue autenticada por el Prof. Eric Rodríguez-Rodríguez, y dos especímenes de referencia fueron depositados en el Herbarium Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo (Trujillo, Perú) (número de código de los especímenes: 57669-HUT y 57670-HUT) (material suplementario: figura 1).

El extracto hidroetanólico se obtuvo mediante métodos reportados en la literatura para otras Fabaceae ¹¹^,¹², con modificaciones; brevemente, la corteza se secó durante 14 días a temperatura ambiente y se molió. Una muestra de corteza en polvo (1,4 kg) se extrajo mediante extracción exhaustiva sucesiva con etanol al 96% (1:2 p/v) durante 48 horas a temperatura ambiente en agitación. Los extractos crudos se combinaron, filtraron y concentraron hasta la sequedad, obteniéndose un producto seco de color marrón rojizo (extracto hidroetanólico de la corteza de A. colubrina, EEAC). El rendimiento de la extracción fue de 20,7%. El EEAC se almacenó a 4°C.

El EEAC se disolvió por completo en una mezcla de etanol al 96%: agua bidestilada (1:29), y esta solución se utilizó para todos los ensayos.

Análisis fisicoquímico

El contenido de sólidos solubles del EEAC (2 mg/mL) se determinó gravimétricamente usando una balanza analítica Ohaus® Pioneer^TM (120 g, d = 1 mg; Parsipanny, NJ, EEUU), y midiendo el índice de refracción (disolvente: etanol al 96%: agua bidestilada, 1:29) utilizando un refractómetro de mano ATAGO® PAL-α (Tokio, Japón). El pH se obtuvo utilizando tiras indicadoras de pH (Merck, Alemania).

Análisis fitoquímico cualitativo y contenido de polifenoles (CPT) y flavonoides (CFT) totales:

El análisis fitoquímico cualitativo se realizó según Lock de Ugaz ¹³. El CPT se determinó mediante el método de Folin-Ciocalteu ¹⁴. El EEAC (40-120 µg/mL, 0,1 mL) se incubó con el reactivo de Folin al 10% (0,5 mL) y Na₂CO₃ al 7,5% p/v (0,4 mL) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los cambios de absorbancia se leyeron a 765 nm. Los resultados se expresaron en mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/g de EEAC seco, y se calcularon a partir de una curva de calibración que utilizó ácido gálico como estándar (0-100 μg/mL) y la fórmula:

CPT: mg EAG / g EEAC = (A_s * FD) / (m * c)

donde A _s es la absorbancia con la muestra (EEAC), m es la pendiente de la ecuación de la curva estándar de ácido gálico, c es la concentración de la muestra (EEAC), y FD es el factor de dilución.

El CFT se estimó como fue descrito por Zhishen et al. ¹⁵. El EEAC (50-250 µg/mL, 0,5 mL) fue incubado, sucesivamente, con NaNO₂ al 5% (p/v; 0,15 mL) por 5 minutos, AlCl₃ al 2,5% (p/v; 0,25 mL) durante 6 minutos y NaOH 1 M (0,25 mL) por 10 minutos. Los cambios en la absorbancia se leyeron a 510 nm. Los resultados fueron expresados como mg de equivalentes de catequina (EC)/g de EEAC seco, y se calculó a partir de una curva de calibración utilizando catequina como estándar (0-72 µg/mL) y la fórmula:

CFT: mg CE / g EEAC = (A_s * FD) / (m * c)

donde m es la pendiente de la ecuación de curva estándar de catequina, y A _s , c, y FD son como se indicó antes.

Actividad antioxidante (Ensayos químicos y biológicos):

Ensayo de captación de radicales libres DPPH^●

La actividad captadora de radicales libres DPPH^● fue evaluada de acuerdo con Brand-Williams et al. ¹⁶. Brevemente, una solución de DPPH^● (20 mg/dL) preparada en etanol fue agitada durante 40 minutos; esta solución stock fue mantenida en la oscuridad a 4°C. La absorbancia inicial de la solución de trabajo se ajustó a 0,9 + 0,02 a 517 nm (concentración de DPPH^●: 78,5 μM) con el mismo disolvente, y fue empleada para preparar el control (absorbancia: 0,6 + 0,02). El EEAC (5-20 µg/mL, 0,4 mL) se incubó con la solución de trabajo de DPPH^● (0,8 mL) por 30 minutos en la oscuridad. Los cambios en la absorbancia se leyeron a 517 nm. El porcentaje de captación de radicales se calculó como:

% captación de radicales = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

donde A _c y A _s son las absorbancias sin (control negativo) y con la muestra, respectivamente.

Los valores de concentración inhibitoria de EEAC necesarios para captar el 50% del radical libre inicial (IC₅₀) se calcularon por regresión lineal. La capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox (CAET-DPPH^●) se expresó como mg ET/g de EEAC seco, y se calculó a partir de una curva de calibración utilizando Trolox como estándar (0-15 µg/mL) y la fórmula:

CAET-DPPH^●: mg ET / g EEAC = IC_50 Trolox / IC_50 EEAC

Ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP)

El ensayo se realizó de acuerdo con Benzie y Strain ¹⁷. El EEAC (40-160 μg/mL, 50 μL) fue añadido a 950 μL de la solución de trabajo de FRAP (10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) en HCl 40mM, FeCl₃ 20 mM en agua bidestilada, y tampón acetato 0,3 M, pH 3,6, en una proporción de 1:1:98). Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 min. Los cambios en la absorbancia se leyeron a 593 nm. Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de FeSO₄/g de EEAC seco, y se calcularon a partir de una curva de calibración utilizando FeSO₄ como estándar (0-91 µg/mL) y la fórmula:

FRAP: mg Eq FeSO_4 / g EEAC = (A_s * FD) / (m * c)

donde A _s es la absorbancia con la muestra (EEAC), m es la pendiente de la ecuación de la curva estándar de FeSO₄, c es la concentración de la muestra (EEAC), y FD es el factor de dilución.

Ensayo de inhibición de la peroxidación lipídica usando sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)

El estrés oxidativo, expresado como TBARS, se midió por el método de Buege y Aust ¹⁸, con modificaciones. El tejido hepático congelado de una rata Holtzman (previamente perfundido con KCl 0,154 M helado) fue homogeneizado en solución salina tamponada con fosfato fría (PBS, pH 7,4). La peroxidación lipídica se inició añadiendo al homogenizado de hígado al 5% (p/v, 0,9 mL), sucesivamente, ácido ascórbico 4 mM (0,045 mL) y FeSO₄ 2 mM (0,015 mL). Posteriormente, se incluyeron diferentes concentraciones de EEAC (100-1000 μg/mL, 0,06 mL) o PBS (pH 7,4, 0,06 mL y 0,12 mL para los grupos de estrés inducido y control, respectivamente) en las mezclas de reacción; luego, estas fueron incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente. Después, cada mezcla de reacción (0,3 mL) se mezcló con ácido tricloroacético al 20% (0,6 mL), se calentó en agua hirviendo durante 15 minutos, se enfrió con agua corriente, se mezcló con ácido tiobarbitúrico al 0,67% (TBA en HCl 0,25 N, 0,9 mL) y se calentó de nuevo en agua hirviendo durante 30 minutos. Tras enfriar con agua corriente fría, cada tubo se centrifugó (5488 x g durante 10 minutos), se recogió el sobrenadante y se determinó la absorbancia a 535 nm.

La actividad antioxidante se expresó como porcentaje de inhibición de la peroxidación lipídica y como concentración de TBARS. El porcentaje de inhibición de la peroxidación lipídica se calculó de la siguiente manera:

% inhibición de peroxidación lipídica = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

donde A _c es la absorbancia del grupo de estrés inducido (0% de inhibición de peroxidación lipídica, control negativo) y A _s es la absorbancia con la muestra (EEAC).

La concentración de TBARS se expresó como nmol de TBARS/mg de tejido hepático y se calculó de la siguiente manera:

TBARS: (nmol TBARS/mg tejido hepático) = (A_s * V_t ) /

(ε * l * V_s * C_H)

donde A _s es la absorbancia de cada mezcla de reacción, Vt es el volumen final de la mezcla de reacción, ε es el coeficiente de absorción molar del complejo MDA-TBA₂ a 535 nm (1,56 x 10⁵ M^-1 cm^-1), l es el paso óptico de la cubeta (1 cm), V_s es el volumen de muestra en la mezcla de reacción, CH es la concentración de homogenizado de hígado de rata.

Ensayo de hemólisis oxidativa inducida por H₂O₂

El ensayo se realizó siguiendo el método de Xu et al. ¹⁹, con modificaciones. Se empleó sangre venosa humana fresca (3 mL) de un donante sano, y se diluyó con solución esterilizada de Alsever (dextrosa al 2%, citrato de sodio al 0,8%, ácido cítrico al 0,05% y NaCl al 0,42% en agua bidestilada). La solución fue centrifugada (625 x g por 3 minutos) y lavada tres veces con el mismo volumen de vehículo (PBS frío 1X, pH 7,4) para separar los glóbulos rojos humanos (GR) de la capa de glóbulos blancos, el plasma y la hemoglobina libre (Hb) liberada de los GR lesionados. Una suspensión de GR al 5% (en solución de Alsever’s helada, 0,1 mL) fue mezclada con EEAC (50-150 μg/mL, 0,45 mL) o vehículo (0,45 mL y 0,9 mL para los grupos de estrés inducido y de control, respectivamente). Las mezclas de reacción se preincubaron a 37 °C durante 15 minutos. Luego, se añadió H₂O₂ 166 mM (en vehículo, 0,45 mL), la mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 4 horas y se centrifugó a 625 x g durante 10 minutos. El contenido de Hb en el sobrenadante se estimó en 405 nm. Después de cada ensayo, la solución de GR se almacenó a 4°C durante un máximo de 72 h para garantizar la viabilidad y el nivel de antioxidantes celulares. El porcentaje de prevención de hemólisis se calculó de la siguiente manera:

% prevención de hemólisis = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

donde A _c es la absorbancia del grupo de estrés inducido (0% de prevención de hemólisis, control negativo) y A _s es la absorbancia con la muestra (EEAC).

Actividad antiinflamatoria

Inhibición de la desnaturalización de ovoalbúmina

El ensayo se llevó a cabo según lo descrito por Mizushima y Kobayashi ²⁰ y Chandra et al. ²¹, con modificaciones. La mezcla de reacción (1,3 mL) consistió en ovoalbúmina fresca: PBS (pH 6,4) (1:1, 0,1 mL), PBS (pH 6,4, 0,7 mL) y diferentes concentraciones del EEAC (125-750 μg/mL, 0,5 mL). Se usaron agua bidestilada y diclofenaco sódico (0,5-3 mg/mL) para el grupo de estrés inducido y como estándar, respectivamente. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 + 1°C durante 20 minutos y posteriormente fueron calentadas a 65 + 2°C por 5 minutos para inducir la desnaturalización. Después de enfriar, los cambios en la absorbancia se leyeron a 660 nm. El porcentaje de inhibición de la desnaturalización de proteínas se calculó como:

% inhibición de desnaturalización de proteínas = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

donde A _c es la absorbancia del grupo de estrés inducido (0% de inhibición de desnaturalización de proteínas, control negativo) y A _s es la absorbancia con la muestra.

Estabilización de membrana de glóbulos rojos humanos (GR)

El ensayo se realizó de acuerdo con los procedimientos descritos por Lavanya et al. ²² y Torres Carro et al. ²³, con modificaciones. Se empleó sangre venosa humana fresca (3 mL) de un donante sano, y se diluyó con un volumen igual de solución esterilizada de Alsever. La solución fue centrifugada (5,488xg por 10 minutos) y el paquete celular fue lavado cinco veces con un volumen igual de solución salina isotónica (NaCl al 0,85%, pH 7,2) para preparar una suspensión de GR con solución salina isotónica al 10% (v/v). La suspensión fue almacenada a 4°C. La mezcla de reacción (1,5 mL) consistió de la suspensión de GR al 10% (0,2 mL), tampón fosfato sódico 0,14 M (pH 7,4, 0,333 mL), y concentraciones diferentes del EEAC (250-750 μg/mL, 0,267 mL). Se empleó agua bidestilada (0,7 mL) para inducir la hemólisis hipotónica. Se usaron vehículo (etanol al 96%: agua bidestilada, 1:29) y diclofenaco sódico (1-3 mg/mL) para el grupo de estrés inducido y como estándar, respectivamente. Las mezclas de reacción fueron incubadas a 37 + 1°C por 30 minutos y luego centrifugadas a 650 x g por 3 minutos. El contenido de Hb en el sobrenadante se midió a 550 nm. Después de cada prueba, la solución GR se almacenó a 4°C durante un máximo de 72 h para garantizar la viabilidad celular. El porcentaje de prevención de hemólisis se calculó de la siguiente manera:

% prevención de hemólisis = ((A_c - A_s) * 100) / A_c

donde A _c es la absorbancia del grupo de estrés inducido (0% prevención de hemólisis, control negativo) and A _s es la absorbancia con la muestra.

Análisis estadísticos

Los ensayos se realizaron en tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado o triplicado. Todos los análisis se realizaron usando Minitab Statistical Software y GraphPad Prism (versión 8.0.1). La normalidad y homogeneidad de las varianzas de los datos se evaluó mediante las pruebas de Shapiro-Wilk y de Levene, respectivamente (p>0,05 en ambas). Dado que los datos estaban distribuidos normalmente, se utilizó un ANOVA de un factor seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Los resultados se expresan como media + desviación estándar, y la significancia estadística se definió como p<0,05.

Aspectos éticos

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki ²⁴ y las normas éticas establecidas. Se obtuvo una muestra de sangre humana de un voluntario sano en el Instituto de Investigación de Bioquímica y Nutrición (IIBN), UNMSM, después de la recepción de un consentimiento informado por escrito. Con respecto al componente animal, utilizamos tejido hepático de una rata sin tratamiento previo como uso secundario de muestras de un proyecto paralelo del IIBN, siguiendo los principios de las 3Rs (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) para evitar el sacrificio de animales adicionales. Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la UNMSM (Aprobación de ética No. 0185-2024), de acuerdo con el Acta de Evaluación Ética de Estudios de Investigación.

RESULTADOS

Análisis fisicoquímico

El contenido de sólidos solubles fue de 1,606 + 0,3 mg/mL y de 1,711 + 0,2 mg/mL, según el índice de refracción y el análisis gravimétrico, respectivamente. El pH fue de 5,5-6,0 (ligeramente ácido).

Análisis fitoquímico cualitativo, CPT y CFT

Como se presenta en el material suplementario: tabla 1, el EEAC tiene un alto contenido de compuestos fenólicos (taninos y flavonoides), bajo contenido de glucósidos, antraquinonas y antronas, y presencia indetectable o nula de alcaloides, triterpenos, esteroides y saponinas.

La determinación de polifenoles y flavonoides totales confirmó su abundancia, con 642,7 + 17 mg (3,78 + 0,1 mmol) EAG/g y 416,2 + 20 mg (1,6 + 0,08 mmol) EC/g extracto seco, respectivamente; esto es, el CPT representa aproximadamente el 65% en EAG del extracto, que incluye principalmente flavonoides (alrededor del 41% en EC del extracto). La relación flavonoides/polifenoles fue de 0,65.

Actividad antioxidante (ensayos químicos y biológicos)

Ensayo de captación de radicales libres DPPH^●

El EEAC mostró un valor de IC₅₀ (4,37 µg/mL) cercano al estándar Trolox (3,26 µg/mL, figura 1 y material suplementario: tabla 2). El valor mencionado anteriormente representa una CAET-DPPH^● de 747,55 mg (2,99 mmol) equivalentes de Trolox/g EEAC seco (material suplementario: tabla 2).

Ensayo de FRAP

El EEAC exhibió una capacidad antioxidante de 435,88 mg (2,87 mmol) equivalentes de FeSO₄/g EEAC seco (figura 2 y material suplementario: tabla 2).

Ensayo de inhibición de la peroxidación lipídica usando TBARS

Todas las concentraciones probadas (100, 500, y 1000 μg/mL) fueron eficaces para reducir la peroxidación lipídica de manera dependiente de la dosis, en un 22, 59 y 68%, respectivamente, con respecto al grupo de estrés inducido (EI) (figura 3a). No se encontraron diferencias entre el tratamiento con el EEAC a 1000 μg/mL y el grupo Control (72%).

Cuando se expresó como nmol/mg de tejido hepático, la producción de TBARS fue mayor en el grupo EI que en los tratamientos con EEAC a 500 y 1000 μg/mL, indicando una dependencia de la concentración del extracto. No se encontraron diferencias entre el grupo EI y el EEAC a 100 μg/mL, ni entre el Control y los tratamientos con EEAC a 500 y 1000 μg/mL (figura 3b).

Ensayo de hemólisis oxidativa inducida por H₂O₂

El EEAC, administrado a 50, 100, and 150 μg/mL, disminuyó la hemólisis causada por H₂O₂ cuando se comparó con el grupo EI (figura 4). La prevención de la hemólisis dependió de la dosis únicamente para los tratamientos con 50 y 100 μg/mL (inhibición del 49 y 75%, respectivamente) dado que el tratamiento con 150 μg/mL provocó una inhibición (65%) similar a la observada para el grupo de 100 μg/mL. De modo interesante, el porcentaje de inhibición para las tres concentraciones de EEAC fue mucho mayor que el reportado para el grupo Control (18%).

Actividad antiinflamatoria

Inhibición de la desnaturalización de ovoalbúmina

Se observó una inhibición dependiente de la dosis de la desnaturalización de ovoalbúmina con el EEAC a 125, 250 y 500 μg/mL, en 34, 42, y 47%, respectivamente, con respecto al grupo EI (figura 5). Curiosamente, el extracto a 750 μg/mL redujo la desnaturalización solo en un 40%, menor que la inhibición observada a 500 μg/mL. En cualquier caso, el EEAC en todas las concentraciones analizadas mostró una inhibición mayor que el fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) diclofenaco sódico a 0,5 y 1 mg/mL (19 y 22%, respectivamente), pero menor que dicha referencia a 3 mg/mL (58%). El EEAC a 250 y 500 μg/mL mostró una mejor inhibición de la desnaturalización de proteínas que el diclofenaco sódico a 2 mg/mL.

Estabilización de membrana de GR

El EEAC a 250, 500, y 750 μg/mL no tuvo un efecto significativo sobre la hemólisis inducida por hipotonicidad. En este aspecto, el extracto a 250 y 500 μg/mL produjo una hemólisis ligeramente mayor que la del grupo EI (6 y 5%, respectivamente). Asimismo, la concentración de 750 μg/mL inhibió la hemólisis solo en un 6%. A pesar de ello, ninguna de las concentraciones mostró una diferencia significativa con respecto al grupo EI. Por otro lado, el diclofenaco sódico inhibió la hemólisis entre un 29% y un 42% a las concentraciones utilizadas (1, 2, y 3 mg/mL).

DISCUSIÓN

Los resultados acerca del contenido fitoquímico del EEAC son consistentes con informes previos sobre la corteza de A. colubrina, es decir, el extracto hidroalcohólico es rico en compuestos fenólicos ⁴^,²⁵, que incluyen tanto taninos como flavonoides ⁶. Sin embargo, algunos estudios previos son inconsistentes con los resultados de este análisis fitoquímico. Silva et al. ²⁶ reportaron la presencia de alcaloides y saponinas, así como la ausencia de flavonoides, antraquinonas y glucósidos en el extracto hidroalcohólico de la corteza. Por otro lado, Sá et al. ²⁷ revelaron que el extracto hidroalcohólico de la corteza contiene compuestos fenólicos, taninos y azúcares, pero no se detectaron flavonoides, esteroides ni terpenoides. Adicionalmente, Pessoa et al. ²⁸ reportaron la presencia de azúcares reductores, saponinas, triterpenos y esteroides. Estas diferencias indicarían que las condiciones edáficas y ambientales, así como las diferencias en los procedimientos de extracción, afectan la biosíntesis o la presencia de metabolitos secundarios a pesar de tratarse de la misma especie.

Curiosamente, el extracto hidroetanólico de la corteza de la variedad brasileña reportada por Mota et al. ⁴ mostró valores de CPT y CFT más altos que aquellos de la variedad de A. colubrina nativa del norte peruano investigada en este estudio (682 mg EAG/g extracto y 445 mg EC/g extracto para la variedad brasileña vs. 643 mg EAG/g extracto y 416 mg EC/g extracto para la variedad peruana, respectivamente). A pesar de ello, la variedad peruana tiene mayores propiedades antioxidantes que la variedad brasileña antes mencionada.

El EEAC mostró un buen comportamiento en dos ensayos antioxidantes con diferentes mecanismos de acción, la transferencia de un solo electrón para el ensayo FRAP y la transferencia de un átomo de hidrógeno o de un solo electrón para el ensayo de captación de radicales DPPH^{● (}²⁹. Es más, como reportaron Desmarchelier et al. ³⁰, el EEAC disminuyó la formación de malondialdehído y otros TBARS como subproductos de la peroxidación lipídica en homogeneizados de hígado de rata y, además, redujo el daño oxidativo causado por H₂O₂ en un modelo de GR, mostrando la capacidad del EEAC de disminuir el estrés oxidativo in vitro.

Estos resultados sugieren que la variedad peruana de A. colubrina posee la actividad antioxidante previamente reportada para la corteza. Esta actividad antioxidante probablemente se deba al contenido fitoquímico del EEAC, principalmente compuestos fenólicos (taninos y flavonoides) ⁴. No obstante, existen algunos resultados contradictorios respecto a la producción de polifenoles por A. colubrina en diferentes condiciones ambientales ³¹, lo que a su vez podría explicar algunas discrepancias entre el presente estudio y reportes previos ⁴^,²⁶^,³².

Es de destacar que la variedad peruana exhibió un valor de CAET-DPPH^● más alto y un IC₅₀ más bajo que la variedad brasileña reportada por el estudio antes mencionado de Mota et al. ⁴ (269 mg equivalentes de Trolox/g extracto y 13 μg/mL para la variedad brasileña vs. 748 mg equivalentes de Trolox/g extracto y 4 μg/mL para la variedad peruana, respectivamente). En consecuencia, las propiedades antioxidantes (CAET-DPPH^● y IC₅₀) de la variedad brasileña se considerarían sólo moderadamente intensas ⁴, e inferiores a las de la variedad peruana reportada aquí.

Estos hallazgos indican que, como se mencionó previamente, además de las diferencias en las técnicas de extracción, las condiciones edáficas y ambientales influyen en la presencia de metabolitos secundarios y, en consecuencia, en la actividad biológica de los extractos. Esto es particularmente evidente al comparar estos resultados con los estudios de Mota et al. (2017) ⁴ y Silva et al. (2020) ²⁶ mencionados anteriormente, ya que todos estos estudios utilizaron extractos hidroetanólicos. Cabe destacar el informe de Silva et al. (2020) ²⁶, el cual reveló la presencia de compuestos ausentes en el EEAC, así como la ausencia de flavonoides, que fueron abundantes aquí. Además, su extracto exhibió un IC₅₀ de 20 μg/mL en el ensayo de DPPH, mucho más alto que los 4,37 μg/mL reportados en el presente trabajo.

Los diferentes métodos de extracción también contribuyen a las variaciones en el contenido fitoquímico y la actividad antioxidante. En este contexto, varios estudios han reportado la actividad de los extractos hidrometanólicos de la corteza de A. colubrina; por ejemplo, Sá et al. (2016) reportaron una extracción reducida de flavonoides ²⁷, los cuales fueron abundantes en el presente estudio. Adicionalmente, Pessoa et al. (2012) detectaron moléculas como saponinas, triterpenos y esteroides ²⁸ que estuvieron ausentes en esta investigación. Este tipo de extracto también mostró una mayor actividad antioxidante en el ensayo de TBARS (IC₅₀ de 62 μg/mL) ³⁰ comparado con el presente estudio (IC₅₀ > 100 μg/mL), pero menor actividad en el ensayo de DPPH (IC₅₀ de 73 μg/mL) ³².

El uso de extractos acuosos de la corteza de A. colubrina también arrojó resultados interesantes. En concreto, Damascena et al. (2014) ³ revelaron un IC₅₀ de 8,63 μg/mL en el ensayo de DPPH, indicando una menor actividad antioxidante en comparación con este trabajo. Por el contrario, los extractos acuosos mostraron actividades antioxidantes variables en el ensayo de TBARS, las cuales fueron similares ³ o mayores ³⁰ que las observadas con el EEAC.

Se empleó el ensayo de desnaturalización de ovoalbúmina para evaluar la actividad antiinflamatoria de A. colubrina. Este método se basa en la acción estabilizadora de los AINE sobre la coagulación de proteínas inducida por calor ²⁰. Dado que la desnaturalización de las proteínas tisulares es capaz de iniciar respuestas inmunes y causar trastornos inflamatorios, se ha sugerido que los compuestos que previenen la desnaturalización de las proteínas podrían tener potencial antiinflamatorio ³³. En este aspecto, el EEAC previno la desnaturalización de la ovoalbúmina inducida por calor en mayor grado que el AINE diclofenaco sódico, que tiene una actividad protectora conocida contra la desnaturalización proteica.

Para corroborar este efecto antiinflamatorio, se realizó el ensayo de estabilización de la membrana de GR. Este ensayo se basa en la similitud entre las membranas de los eritrocitos y los lisosomas. La estabilización de la membrana lisosomal es deseable, ya que los lisosomas pueden liberar sus enzimas hidrolíticas en los tejidos afectados durante la respuesta inflamatoria. El efecto de cualquier extracto sobre la estabilización de los eritrocitos podría extrapolarse a la estabilización de la membrana lisosomal y, por lo tanto, la actividad antiinflamatoria de un extracto puede evaluarse mediante la prevención de la hemólisis ³⁴.

No se observó actividad a las mismas concentraciones empleadas en el ensayo de desnaturalización; por el contrario, el EEAC aumentó la hemólisis inducida por hipotonicidad, aunque estos resultados no fueron del todo inesperados. El EEAC es rico en taninos (material suplementario: tabla 1), que podrían tener actividad hemolítica sobre los GR ³⁵. En este sentido, Rocha et al. ²⁵ reportaron que el extracto hidroalcohólico de la corteza de A. colubrina fue ligeramente tóxico para los GR, incluso a bajas concentraciones (0,25 a 32 mg/mL). Desde esta perspectiva, el alto contenido de taninos del EEAC podría explicar la hemólisis observada en el presente estudio. Tal como describieron Deng et al. (2019) ³⁵, las altas concentraciones de algunos taninos podrían provocar cambios en la morfología de los eritrocitos y hemólisis, posiblemente debido a los grupos hidroxilo fenólicos de los taninos, que se adsorben en la membrana celular, causando deformaciones que conducen a su ruptura. Es bien sabido que los taninos se unen a las proteínas y los lípidos de la membrana celular y los alteran, modificando así su permeabilidad y provocando daño celular y lisis, lo que también afecta la coagulación sanguínea.

Aunque estos resultados indicarían que el EEAC es una fuente potencial de compuestos antiinflamatorios, especialmente aquellos relacionados con la desnaturalización de proteínas, se debe considerar que los ensayos se realizaron in vitro, y no necesariamente muestran lo que ocurriría in vivo, ya que debe considerarse la biodisponibilidad de compuestos activos, como los taninos. Sin embargo, es prometedor que A. colubrina haya demostrado una mejor actividad inhibidora que un AINE como el diclofenaco sódico, que puede inhibir la desnaturalización de proteínas de una manera dependiente de la dosis.

En conclusión, se reportaron por primera vez las propiedades biológicas de Anadenanthera colubrina del norte del Perú. En este sentido, el extracto hidroetanólico de la corteza (EEAC) posee una fuerte actividad antioxidante preliminar in vitro, así como un alto contenido de polifenoles y flavonoides totales. Además, el EEAC evitó la desnaturalización de la ovoalbúmina inducida por calor en mayor medida que el AINE diclofenaco sódico. Estos resultados sugieren que A. colubrina del norte del Perú es una buena fuente de compuestos con actividad biológica, lo que beneficia a los habitantes de esas zonas, quienes podrían desconocer las propiedades medicinales de sus propios recursos. Además, se proporciona una metodología práctica para evaluar las actividades antioxidantes y antiinflamatorias de las plantas medicinales peruanas.

Como recomendación adicional para el uso de A. colubrina, se sugiere que el exceso de saponinas y taninos se eliminen mediante métodos de extracción estandarizados para optimizar sus propiedades biológicas, ya que estos compuestos, aunque están presentes en la corteza, pueden ejercer efectos tóxicos en altas concentraciones. Se necesitan más investigaciones para determinar la seguridad y los mecanismos de acción específicos de A. colubrina, y para purificar e identificar las posibles moléculas responsables de la actividad farmacológica observada.

Acknowledgments

Biographies

Biólogo, Bachiller en Biología

Química farmacéutica, Doctora en Farmacia y Bioquímica

Funding.: This work was partially funded by the Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) with fund PCONFIGI-INV 2023 A23010421.

Material suplementario.

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¹¹

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Supplementary Materials

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PERMALINK

In vitro antioxidant and anti-inflammatory activities and total polyphenol and flavonoid contents of Anadenanthera colubrina from northern Peru

Edert Abel Samame-Caramutti

Luis Salcedo-Valdez

Silvia Suárez-Cunza

Roles

ABSTRACT

Objectives.

Materials and methods.

Results.

Conclusions.

INTRODUCTION

KEY MESSAGES

MATERIALS AND METHODS

Reagents and standards

Plant material and extraction

Physicochemical analysis

Qualitative phytochemical analysis and total polyphenol (TPC) and flavonoid (TFC) content:

Antioxidant activity (Chemical and biological assays):

Anti-inflammatory activity

RESULTS

Physicochemical analysis

Qualitative phytochemical analysis, TPC and TFC

Antioxidant activity (Chemical and biological assays)

Figure 1. Free radical scavenging effects of DPPH ● (78.5 μM) of the hydroethanolic extract of Anadenanthera colubrina bark (EEAC) and Trolox. Results are presented as mean + standard deviation (n = 3), representative of two replicates.

Figure 2. Reactivity of the hydroethanolic extract of Anadenanthera colubrina bark (EEAC) and ferrous sulphate in the ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. Results are presented as mean + standard deviation (n = 3), representative of two replicates.

Anti-inflammatory activity

DISCUSSION

Acknowledgments

Biographies

Funding Statement

References

Actividades antioxidante y antiinflamatoria in vitro y contenidos de polifenoles y flavonoides totales de Anadenanthera colubrina del norte peruano

Edert Abel Samame-Caramutti

Luis Salcedo-Valdez

Silvia Suárez-Cunza

Roles

RESUMEN

Objetivos.

Materiales y métodos.

Resultados.

Conclusiones.

INTRODUCCIÓN

MENSAJE CLAVE

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos y estándares

Material vegetal y extracción

Análisis fisicoquímico

Análisis fitoquímico cualitativo y contenido de polifenoles (CPT) y flavonoides (CFT) totales:

Actividad antioxidante (Ensayos químicos y biológicos):

Actividad antiinflamatoria

RESULTADOS

Análisis fisicoquímico

Análisis fitoquímico cualitativo, CPT y CFT

Actividad antioxidante (ensayos químicos y biológicos)

Figura 1. Efectos de captación de los radicales libres DPPH● (78,5 μM) del extracto hidroetanólico de la corteza de Anadenanthera colubrina (EEAC) y Trolox. Los resultados son presentados como media + desviación estándar (n = 3), representativos de dos réplicas.

Figura 2. Reactividad del extracto hidroetanólico de la corteza de Anadenanthera colubrina (EEAC) y sulfato ferroso en el ensayo de poder antioxidante redactor férrico (FRAP). Los resultados son presentados como media + desviación estándar (n = 3), representativos de dos réplicas.

Actividad antiinflamatoria

DISCUSIÓN

Acknowledgments

Biographies

Associated Data

Supplementary Materials

ACTIONS

PERMALINK

RESOURCES

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Figure 1. Free radical scavenging effects of DPPH ^● (78.5 μM) of the hydroethanolic extract of Anadenanthera colubrina bark (EEAC) and Trolox. Results are presented as mean + standard deviation (n = 3), representative of two replicates.

Figura 1. Efectos de captación de los radicales libres DPPH^● (78,5 μM) del extracto hidroetanólico de la corteza de Anadenanthera colubrina (EEAC) y Trolox. Los resultados son presentados como media + desviación estándar (n = 3), representativos de dos réplicas.