Abstract
目的
探讨RAS-选择性致死小分子3（RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3）、Erastin和 叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）诱导大鼠纤维环细胞（annulus fibrosus cells，AFCs）铁死亡的效果，建立有效的AFCs铁死亡体外模型，为后续铁死亡机制研究提供实验基础和理论依据。
方法
取6周龄雌性SD大鼠尾椎，采用酶解法分离培养AFCs；通过细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法筛选RSL3、Erastin和TBHP处理AFCs的最佳浓度（用于建立大鼠AFCs铁死亡体外模型）。根据筛选得到的各诱导剂最佳浓度分别处理大鼠AFCs，并分为对照组、RSL3组、Erastin组和TBHP组。通过实时荧光定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光染色检测铁死亡相关基因 ［谷胱甘肽过氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4）、铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 （acyl coenzyme A synthase long chain member 4，ACSL4）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7，member 11，SLC7A11）和前列腺素内过氧化物合成酶2 （prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）］、细胞增殖相关基因 ［增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）］ 的表达水平；铁离子（Fe2+）含量和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量试剂盒评估铁积累和脂质过氧化程度；采用细胞荧光染色测定细胞内脂滴（lipid droplets，LDs）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平来评估细胞氧化应激水平。
结果
通过CCK-8法筛选出各诱导剂处理大鼠AFCs的最佳浓度，分为RSL3（0.1 μmol/L）组、Erastin（0.5 μmol/L）组和TBHP（50 μmol/L）组。RSL3组和TBHP组均能通过下调GPX4、FTH1、SLC7A11和PCNA mRNA表达水平，上调ACSL4和PTGS2 mRNA表达水平，降低GPX4和FTH1蛋白表达水平，升高PTGS2蛋白表达水平（P<0.05），同时升高细胞内Fe2+和MDA含量、LDs和ROS水平（P<0.05），诱导大鼠AFCs铁死亡。Erastin组可上调FTH1、SLC7A11和PTGS2 mRNA表达水平（P<0.05）；然而，其对GPX4、ACSL4和PCNA的mRNA表达水平无显著影响，对GPX4、FTH1和PTGS2的蛋白表达水平也无显著作用（P>0.05），虽然能升高细胞内MDA含量（P<0.05），但未能显著改变胞内Fe2+含量、LDs以及ROS水平（P>0.05），对大鼠AFCs铁死亡的诱导效果欠佳。
结论
RSL3 和 TBHP 可用于建立大鼠AFCs铁死亡模型，有助于后续对椎间盘退变中铁死亡的研究。
Keywords: 椎间盘退变, 纤维环, 铁死亡, RAS-选择性致死小分子3, 叔丁基过氧化氢, Erastin, 造模
Abstract
Objective
To explore the effects of RAS-selective lethal small molecule 3 (RSL3), Erastin, and tert-butyl hydroperoxide (TBHP) on ferroptosis of rat annulus fibrosus cells (AFCs), and to establish an effective in vitro model of ferroptosis of rat AFCs, providing an experimental basis and theoretical support for the subsequent research on the mechanism of ferroptosis.
Methods
AFCs were isolated and cultured from the caudal vertebrae of 6-week-old female Sprague-Dawley rats by enzymatic hydrolysis. The optimal treatment concentrations of RSL3, Erastin, and TBHP (used for establishing an in vitro model of ferroptosis in rat AFCs) were screened by the cell counting kit 8 (CCK-8) method. According to the optimal concentrations of each inducer obtained through screening, rat AFCs were divided into control group, RSL3 group, Erastin group, and TBHP group. The expression levels of ferroptosis-related genes [glutathione peroxidase 4 (GPX4), ferritin heavy chain 1 (FTH1), acyl coenzyme A synthase long chain member 4 (ACSL4), solute carrier family 7, member 11 (SLC7A11), and prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2)], and cell proliferation-related genes [proliferating cell nuclear antigen (PCNA)] were detected by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR), Western blot, and cell immunofluorescence staining; iron (Fe2+) content and malondialdehyde (MDA) content kits were used to evaluate iron accumulation and lipid peroxidation. The levels of intracellular lipid droplets (LDs) and reactive oxygen species (ROS) were determined by cell fluorescence staining to evaluate the level of cellular oxidative stress.
Results
The optimal concentrations for treating rat AFCs were screened by CCK-8 method and rat AFCs were divided into control group, RSL3 (0.1 μmol/L) group, Erastin (0.5 μmol/L) group, and TBHP (50 μmol/L) group. Both RSL3 group and TBHP group downregulated the mRNA expression levels of GPX4, FTH1, SLC7A11, and PCNA, upregulated the mRNA expression levels of ACSL4 and PTGS2, decreased the protein expression levels of GPX4 and FTH1, and increased the protein expression level of PTGS2 (P<0.05); simultaneously, increased the intracellular Fe2+ and MDA contents, LDs and ROS levels (P<0.05), significantly induced the occurrence of ferroptosis. While the Erastin group upregulated the mRNA expression levels of FTH1, SLC7A11, and PTGS2 (P<0.05); however, it had no significant effect on the mRNA expression levels of GPX4, ACSL4, and PCNA, nor on the protein expression levels of GPX4, FTH1, and PTGS2 (P>0.05), although it increased the intracellular MDA content (P<0.05), but did not significantly change the intracellular Fe2+ content, LDs and ROS levels (P>0.05), failed to induce ferroptosis significantly.
Conclusion
RSL3 and TBHP are suitable for the establishment of ferroptosis models in rat AFCs, which is helpful for the subsequent study of ferroptosis in intervertebral disc degeneration.
Keywords: Intervertebral disc degeneration, annulus fibrosus, ferroptosis, RAS-selective lethal small molecule 3, tert-butyl hydroperoxide, Erastin, modeling
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）是一种常见的肌肉骨骼疾病[1]，亦是引起腰痛的主要病因。椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板3个主要结构构成，任一结构发生破坏或稳态失衡均可能诱发或加剧IVDD的病理进程。此外，免疫系统亦可通过诱导炎症反应及纤维化促进IVDD的发生与发展[2-6]。目前，关于IVDD机制的研究多集中于髓核，而针对纤维环的研究相对有限。纤维环是包裹中央胶状髓核的纤维软骨结构，其结构完整性与力学性能对于维持椎间盘在多轴向负荷下的稳定性与功能至关重要[7]。作为纤维环的主要功能单元，纤维环细胞（annulus fibrosus cells，AFCs）的活性和功能状态直接影响纤维环的健康与退变。已有研究报道，AFCs受炎症、凋亡、衰老、焦亡及异常机械负荷等因素的影响[8]，最终可能促进IVDD的发生。
近年来，一种新型调节性细胞死亡方式——铁死亡逐渐引起关注。与凋亡、焦亡等经典调节性细胞死亡模式不同，铁死亡是一种铁依赖性、以脂质过氧化累积为特征的细胞死亡方式，可引发下游细胞氧化损伤[9]。尽管铁死亡在IVDD领域的研究尚处于起步阶段，但已有证据表明其与IVDD相关，并参与髓核、纤维环及软骨终板的退变过程[10-11]。
在椎间盘细胞的体外研究中，谷胱甘肽过氧化物酶 4抑制剂大鼠肉瘤基因RAS-选择性致死小分子3（RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3）[12-13]、胱氨酸/谷氨酸反向转运系统（cystine/glutamate antiporter system，系统Xc-）抑制剂Erastin[14]和氧化应激诱导剂叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）[15]已被证实可诱导髓核细胞发生铁死亡；类似地，Erastin[16]和TBHP[17]也被报道可诱导软骨终板细胞发生铁死亡。然而，目前尚不清楚上述诱导剂对AFCs铁死亡的诱导效果，亦未明确何种药物更具优势。
本课题组前期研究已发现IVDD中存在铁死亡水平的升高[18]。为建立可靠的IVDD体外细胞模型，并为后续深入探讨AFCs中铁死亡机制奠定基础，本研究拟系统比较RSL3、Erastin和TBHP对大鼠AFCs铁死亡的诱导效果，通过检测铁死亡相关基因表达、Fe2+水平、脂质过氧化及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成等一系列关键指标，以验证3种诱导剂对大鼠AFCs铁死亡的诱导作用，从而为后续IVDD中AFCs铁死亡的相关研究提供实验依据与理论基础。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
6周龄雌性SD大鼠12只，体质量（250±30）g，由华南理工大学动物实验中心提供。
链霉素/青霉素、PBS、高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、FBS（GIBCO公司，美国）；Ⅱ型胶原酶（Invitrogen公司，美国）； RSL3 （南京Adooq公司）；Erastin（上海AbMole公司）；TBHP（上海Macklin公司）；细胞计数试剂盒8 （cell counting kit 8，CCK-8）、BODIPY 493/503脂滴（lipid droplets，LDs）荧光检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）；NcmZol Reagent （苏州NCM公司）；彩色反转录试剂盒（含gDNA去除剂）、2×Color SYBR Green qPCR Master Mix（ROX2 plus）（EZBioscience公司，美国）；ROS检测试剂盒、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色剂、Tween-20、Triton X-100、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定试剂盒、细胞铁含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）缓冲液（上海Epizyme公司）；4%多聚甲醛（北京Leagene公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 和二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（合肥Biosharp公司）；谷胱甘肽过氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4）抗体、铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）抗体和前列腺素内过氧化物合成酶2 （prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）抗体（Abcam公司，英国）；山羊抗兔IgG （H+L）荧光488偶联二抗（江苏 Affinity Biosciences公司）；GAPDH抗体（北京Bioss公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）；超灵敏ECL试剂（深圳MIKX公司）。
Applied Biosystems QuantStudio 1实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）仪、超灵敏分光光度计、Legend Micro 21R冷冻高速离心机、直热式CO2细胞培养箱（ThermoFisher Scientific公司，美国）；PCR仪、垂直电泳及转印系统（Bio-Rad公司，美国）；荧光显微镜、光学倒置显微镜（Leica公司，德国）；多功能酶标仪（TECAN公司，瑞士）；常温低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；Image J软件（National Institutes of Health，美国）；GraphPad Prism 9.5 软件（GraphPad Software公司，美国）。
1.2. RSL3、Erastin和TBHP处理大鼠AFCs最佳浓度筛选
1.2.1. 细胞提取和培养
取6周龄健康SD大鼠的尾椎，分离AFCs[19]。简要操作如下：从大鼠尾部分离纤维环组织，置于含5%链霉素/青霉素的生理盐水中保存。用含5%链霉素/青霉素的PBS溶液反复洗涤纤维环组织，剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm大小，室温下以半径14 cm、1 000 r/min离心5 min后，以完全培养基（含15%FBS及1%链霉素/青霉素的DMEM培养基）重悬，加入0.2%Ⅱ型胶原酶（DMEM配置），于37℃消化约16 h。以完全培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中孵育。待细胞融合度达80%～85%时，以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化传代。取第2～5代细胞用于后续实验。
1.2.2. 细胞活力测定
采用CCK-8法评估RSL3、Erastin和TBHP处理后的AFCs活性。将大鼠AFCs均匀接种于96孔细胞培养板中，用完全培养基孵育24 h。随后，分别用完全培养基配制不同浓度的RSL3（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 μmol/L）、Erastin（0、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μmol/L）、TBHP（0、5、10、15、25、50、75、100、200、400 μmol/L）处理大鼠AFCs 24 h，每组设6个复孔。处理结束后，PBS洗涤，每孔加入100 μL 用DMEM培养基配制的CCK-8溶液（10%，v/v）， 37℃孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度（A）值。按以下公式计算细胞活力：（A实验组−A空白组）/（A对照组−A空白组）；其中未接种细胞的为空白组，接种细胞但未用经诱导剂处理的为对照组，接种细胞且经不同浓度诱导剂处理的为实验组。根据筛选出的各诱导剂处理最佳浓度将后续实验分为4 组，分别为对照组、RSL3组、Erastin组和TBHP组。
1.3. 观测指标
1.3.1. 细胞形态观察
将大鼠AFCs均匀接种于6孔细胞培养板中，用完全培养基孵育24 h后分为4组。对照组不做任何处理，RSL3组、Erastin组和TBHP组分别加入最佳浓度各诱导剂进行细胞处理，24 h后于倒置显微镜下观察各组细胞形态，随机选取3个视野采集图像。
1.3.2. qRT-PCR检测
将大鼠AFCs均匀接种于6孔细胞培养板中，分组处理24 h后，PBS洗涤，加入NcmZol Reagent提取细胞总RNA，用Nanodrop测定RNA浓度。采用彩色反转录试剂盒（含gDNA去除剂），以20 μL体积将总RNA 1 μg逆转录为cDNA。采用2×Color SYBR Green qPCR Master Mix（ROX2 plus）在Applied Biosystems QuantStudio 1实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR。目的基因包括铁死亡相关基因GPX4、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 （acyl coenzyme A synthase long chain member 4，ACSL4）、FTH1、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7, member 11，SLC7A11）、PTGS2以及细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）。所有引物序列见表1。以GAPDH为内参基因，采用2−ΔΔCt法对目的基因的相对表达量进行分析。每组设3个复孔。
表 1.
Primer sequences of qRT-PCR
qRT-PCR基因引物序列
| 基因 Gene |
引物序列（5′→3′） Primer sequence (5′→3′) |
| GAPDH | 正向：GACAATTTTGGCATCGTGGA 反向：ATGCAGGGATGATGTTCTGG |
| GPX4 | 正向：CCCATTCCCGAGCCTTTCAAC 反向：CGCGGGATGCACACAAGC |
| ACSL4 | 正向：GACTGGCAGGAAGGTGGTTA 反向：CCCATGTAGATATTCTGGCCT |
| FTH1 | 正向：GAGCCCTTTGCAACTTCGTC 反向：CCGGTCAAAATAACAAGACATGG |
| SLC7A11 | 正向：TCGTCCTTTCAAGGTGCCTC 反向：TGATAAGGAAGCCAACCCCG |
| PTGS2 | 正向：CCCATGTCAAAACCGTGGTG 反向：CTTGTCAGAAACTCAGGCGT |
| PCNA | 正向：CGTGAACCTACAGAGCATGGA 反向：CATTGCAGTTAAGAGCCTTCC |
1.3.3. ROS水平测定
将大鼠AFCs接种于放置有细胞爬片的24孔细胞培养板中，以完全培养基处理作为阴性对照。采用ROS检测试剂盒测定细胞内ROS水平。分组处理细胞24 h后，以4%多聚甲醛固定细胞，DAPI对细胞核进行复染。荧光显微镜下观察2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光信号，每孔随机选取至少3个视野采集荧光图像。使用Image J软件对各组图像的荧光强度进行量化，数据以平均荧光强度表示，计算公式为该区域荧光强度总和/该区域面积。
1.3.4. MDA含量测定
将大鼠AFCs均匀接种于6孔细胞培养板中，分组处理24 h后，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解细胞，采用MDA含量测定试剂盒检测细胞内MDA含量，并使用BCA法进行总蛋白定量。将各组MDA浓度相对于对照组进行归一化。每组设3个复孔。
1.3.5. Fe2+含量测定
将大鼠AFCs均匀接种于6孔细胞培养板中，分组处理24 h后，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解细胞，采用细胞铁含量检测试剂盒检测Fe2+含量，并使用BCA法进行总蛋白定量。将各组的Fe2+含量相对于对照组进行归一化。每组设3个复孔。
1.3.6. LDs荧光染色观察
采用BODIPY 493/503 LDs荧光检测试剂盒检测大鼠AFCs内脂质过氧化水平。各组细胞经DAPI复染后，于荧光显微镜下观察BODIPY荧光信号。每孔随机选取至少3个视野采集荧光图像，使用ImageJ软件对图像荧光强度进行量化，结果以平均荧光强度表示。
1.3.7. 细胞免疫荧光染色观察
将接种于细胞爬片的大鼠AFCs置于24孔细胞培养板中，分组处理24 h。PBS洗涤后，以4%多聚甲醛固定，用通透液（含3%Triton-X 100的PBS）将细胞透化10 min，再用含5%牛血清白蛋白的PBS封闭1 h。加入以封闭液稀释的一抗GPX4（1∶200）、FTH1（1∶200），于湿盒中4℃孵育过夜。次日，PBST（含1%Tween-20的PBS）洗涤3次，加入以PBST稀释的山羊抗兔IgG （H+L）荧光488偶联二抗（1∶200），室温避光孵育1 h。DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察，每孔随机选取至少3个视野进行图像采集。Image J 软件对图像荧光强度进行量化，计算 GPX4和FTH1相对荧光强度。
1.3.8. Western blot检测
将大鼠AFCs均匀接种于6孔细胞培养板中，分组处理24 h后，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解细胞提取总蛋白，进行Western blot检测。转膜后，将膜与一抗GPX4（1∶2 000）、FTH1（1∶2 000）、PTGS2（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）于4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），室温孵育2 h。洗膜3次后，加入超灵敏ECL试剂，使用化学发光成像系统采集图像。采用 Image J 软件对条带灰度值进行定量分析，以目的蛋白/GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。
1.4. 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.5统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk 正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，各实验组与对照组两两比较采用Dunnett-t检验；检验水准取双侧α=0.05。
2. 结果
2.1. RSL3、Erastin和TBHP处理大鼠AFCs最佳浓度筛选
CCK-8检测示，0、0.05 μmol/L RSL3，0、0.25 μmol/L Erastin和0～25 μmol/L TBHP对大鼠AFCs活性无明显影响；而0.10～0.25 μmol/L RSL3、0.50～10.00 μmol/L Erastin和50～400 μmol/L TBHP显著降低大鼠AFCs活性，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），且该影响呈剂量依赖性。见图1。为避免高剂量药物对细胞的毒性作用，后续实验采用0.1 μmol/L RSL3、0.5 μmol/L Erastin和50 μmol/L TBHP处理细胞。
图 1.
Effects of RSL3, Erastin, and TBHP treatments on the viability of rat AFCs detected by CCK-8 method
CCK-8法检测RSL3、Erastin和TBHP处理对大鼠AFCs活力的影响
*P<0.05 a. RSL3；b. Erastin；c. TBHP
*P<0.05 a. RSL3; b. Erastin; c. TBHP
2.2. 细胞形态观察
与对照组相比，RSL3组、Erastin组和TBHP组大鼠AFCs的细胞边缘发生萎缩，细胞膜完整性丧失，部分细胞失去贴壁能力，悬浮于培养基中，提示细胞活性受到不同程度抑制。见图2。
图 2.
Observation of cell morphology in each group (Inverted microscope×200)
各组细胞形态观察（倒置显微镜×200）
a. 对照组；b. RSL3组；c. Erastin组；d. TBHP组
a. Control group; b. RSL3 group; c. Erastin group; d. TBHP group
2.3. qRT-PCR检测
与对照组相比，RSL3组和TBHP组GPX4、FTH1、SLC7A11、PCNA mRNA相对表达量均显著下调，ACSL4、PTGS2 mRNA相对表达量上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；而Erastin组GPX4 、ACSL4、PCNA mRNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而FTH1、SLC7A11和PTGS2 mRNA相对表达水平升高（P<0.05）。见图3。
图 3.
Relative mRNA expression levels of various target genes in each group of cells detected by qRT-PCR
qRT-PCR检测各组细胞目的基因相对表达量
*P<0.05 a. GPX4；b. ACSL4；c. FTH1；d. SLC7A11；e. PTGS2；f. PCNA
*P<0.05 a. GPX4; b. ACSL4; c. FTH1; d. SLC7A11; e. PTGS2; f. PCNA
2.4. ROS水平测定
对照组、RSL3组、Erastin组及TBHP组细胞中DCFH-DA平均荧光强度分别为23.81±0.46、64.50±2.49、25.45±0.95、60.15±16.63。与对照组比较，RSL3组和TBHP组细胞中DCFH-DA平均荧光强度均增加，差异有统计学意义（P<0.05）；Erastin组DCFH-DA平均荧光强度未见明显增加（P>0.05）。见图4。
图 4.
Analysis of DCFH-DA fluorescence staining of each group of cells (Inverted fluorescence microscope×200)
各组细胞DCFH-DA荧光染色分析（倒置荧光显微镜×200）
从上至下依次为DAPI、DCFH-DA及二者重叠 a. 对照组；b. RSL3组；c. Erastin组；d. TBHP组
From top to bottom for DAPI, DCFH-DA staining, and merge, respectively a. Control group; b. RSL3 group; c. Erastin group; d. TBHP group
2.5. MDA含量测定
对照组、RSL3组、Erastin组及TBHP组细胞中MDA含量分别为0.108 1±0.012 7、0.336 2±0.051 7、0.238 8±0.047 0、0.166 5±0.026 6 nmol/mg蛋白。与对照组比较，RSL3组、Erastin组和TBHP组细胞中MDA含量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.6. Fe2+含量测定
对照组、RSL3组、Erastin组及TBHP组细胞中Fe2+含量分别为（15 667.83±1 003.68）、（28 023.49±1 795.19）、（17 842.08±1 142.96）、（35 198.53±2 254.812）ng/mg蛋白。与对照组比较，RSL3组和TBHP组细胞中Fe2+含量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）；Erastin组Fe2+含量未见明显增加（P>0.05）。
2.7. LDs荧光染色观察
对照组、RSL3组、Erastin组及TBHP组细胞中BODIPY 493/503染色平均荧光强度分别为14.91±2.22、47.79±3.38、19.63±1.65、55.06±7.49。与对照组比较，RSL3组和TBHP组细胞中BODIPY 493/503染色平均荧光强度均增加，差异有统计学意义（P<0.05），说明细胞内LDs生成增多，脂质过氧化水平升高；Erastin组BODIPY 493/503染色平均荧光强度未见明显增加（P>0.05）。见图5。
图 5.
Analysis of BODIPY 493/503 staining of each group of cells (Inverted fluorescence microscope×200)
各组细胞BODIPY 493/503染色分析（倒置荧光显微镜×200）
从上至下依次为DAPI、BODIPY 493/503及二者重叠 a. 对照组；b. RSL3组；c. Erastin组；d. TBHP组
From top to bottom for DAPI, BODIPY 493/503 staining, and merge, respectively a. Control group; b. RSL3 group; c. Erastin group; d. TBHP group
2.8. 细胞免疫荧光染色观察
对照组、RSL3组、Erastin组及TBHP组GPX4相对荧光强度分别为118.34±3.78、79.20±3.12、128.33±10.61、67.74±5.07，FTH1相对荧光强度分别为83.65±2.95、33.93±1.54、89.57±4.94、46.03±4.62。与对照组比较，RSL3组和TBHP组GPX4和FTH1相对荧光强度均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；Erastin组GPX4和FTH1相对荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）。见图6、7。
图 6.
Observations of GPX4 immunofluorescence staining in each group (Inverted fluorescence microscope×200)
各组GPX4免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
从上至下依次为DAPI、GPX4及二者重叠 a. 对照组；b. RSL3组；c. Erastin组；d. TBHP组
From top to bottom for DAPI, GPX4 staining, and merge, respectively a. Control group; b. RSL3 group; c. Erastin group; d. TBHP group
图 7.
Observations of FTH1 immunofluorescence staining in each group (Inverted fluorescence microscope×200)
各组FTH1免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
从上至下依次为DAPI、FTH1及二者重叠 a. 对照组；b. RSL3组；c. Erastin组；d. TBHP组
From top to bottom for DAPI, FTH1 staining, and merge, respectively a. Control group; b. RSL3 group; c. Erastin group; d. TBHP group
2.9. Western blot检测
与对照组比较，RSL3组和TBHP组GPX4和FTH1蛋白相对表达量均减少，PTGS2蛋白相对表达量增加，差异有统计学意义（P<0.05）；Erastin组各蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。见图8、9。
图 8.
Gel electrophoresis images of protein expression in each group detected by Western blot
Western blot检测各组目的蛋白表达凝胶电泳图
Mr：相对分子质量 1：对照组 2：RSL3组 3：Erastin组 4：TBHP组
Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: RSL3 group 3: Erastin group 4: TBHP group
图 9.
Relative protein expression levels in each group detected by Western blot
Western blot检测各组目的蛋白相对表达量
*P<0.05 a. GPX4；b. FTH1；c. PTGS2
*P<0.05 a. GPX4; b. FTH1; c. PTGS2
3. 讨论
本研究系统比较了RSL3、Erastin和TBHP 3种铁死亡诱导剂在大鼠AFCs中的效应，结果表明，TBHP和RSL3诱导大鼠AFCs铁死亡的效果较为稳定，而Erastin在诱导大鼠AFCs铁死亡方面不如TBHP和RSL3有效，提示大鼠AFCs对 Erastin可能具有较高耐受性。该发现为体外大鼠AFCs铁死亡模型的构建提供了实验依据，也揭示了不同铁死亡通路在大鼠AFCs中可能存在的调控差异。
与近期关于RSL3、Erastin和TBHP在髓核细胞中铁死亡诱导效果研究不同的是，本研究发现Erastin在大鼠AFCs中诱导效果不佳，这一差异提示不同椎间盘区域来源的细胞对同一铁死亡诱导剂所产生的应答可能不同。目前，对于AFCs的铁死亡特异性耐受机制尚不清晰，推测可能与AFCs和髓核细胞在微环境适应、代谢特征及抗氧化系统构成等方面存在差异有关。作为纤维软骨细胞，AFCs细胞外基质富含Ⅰ型胶原，处于以高张力负荷为主的力学环境中；而髓核细胞则富含Ⅱ型胶原，处于低氧、高渗透压的微环境中，二者在抗氧化系统以及铁代谢稳态调控上可能有所不同。因此，在IVDD的研究中不能简单地将髓核细胞的药物应答结果推及到AFCs，需要针对不同的细胞类型分别建立可靠的铁死亡模型。
在本研究中，RSL3和TBHP处理可显著下调GPX4、FTH1及SLC7A11的mRNA和蛋白水平，上调促铁死亡基因ACSL4和PTGS2的表达，并伴随Fe2+、MDA增多、ROS升高及LDs积聚，均与铁死亡的典型分子与生化特征相吻合。值得注意的是，PCNA的下调提示铁死亡过程可能伴随大鼠AFCs增殖能力的抑制，这与退变椎间盘内细胞数量减少的病理表现一致。
RSL3和TBHP的高效性说明了GPX4失活和氧化应激激活在大鼠AFCs 铁死亡中的重要作用。作为GPX4的直接共价抑制剂，RSL3可快速导致GPX4酶活性丧失及脂质过氧化累积，从而迅速触发强烈的铁死亡效应[20]。TBHP作为一种亲脂性有机过氧化氢，能穿透细胞膜直接引发氧化损伤，既可消耗细胞内谷胱甘肽等抗氧化物质，以间接削弱GPX4的保护功能，又可作为脂质过氧化的引发剂，促进过氧自由基介导的级联反应[21]。二者作用路径虽不同，但最终均可高效诱导大鼠AFCs铁死亡，提示在IVDD病理微环境中，直接抑制GPX4与强氧化应激攻击均能有效触发AFCs铁死亡。
Erastin作为铁死亡的第一代诱导性药物，其靶向系统Xc-（核心亚基SLC7A11），通过阻断胱氨酸摄取并消耗细胞内谷胱甘肽，间接削弱GPX4活性[9]，但其诱导效率高度依赖于细胞类型。本研究中，Erastin处理后PTGS2、FTH1与SLC7A11的mRNA水平显著升高，而蛋白水平未发生相应改变，ROS与MDA水平仅轻度升高，细胞死亡程度也相对较低。上述现象提示该AFCs模型对Erastin诱导的铁死亡具有较高的内在耐受性，所观察到的变化可能为轻度应激下的早期代偿反应。其可能机制包括：第一，大鼠AFCs可能存在较低的系统Xc-活性或存在代偿途径。有研究表明，部分细胞可通过硫转移途径和过氧化物酶体等代偿途径维持半胱氨酸和谷胱甘肽的稳态，从而减弱对系统Xc-抑制的敏感性[22]。第二，GPX4蛋白本身的高稳定性可能得到其他还原系统的支持。GPX4的丰度和活性是铁死亡的终极“闸门”，如果GPX4蛋白在大鼠AFCs中的半衰期较长，或者铁死亡抑制蛋白1-辅酶Q10（FSP1-CoQ10）等抗铁死亡的平行通路同时作用[23]，仅靠抑制上游系统Xc-可能不足以在实验期内有效“关闭”GPX4功能。本研究中在Erastin组中观察到的GPX4蛋白水平变化不显著支持这一假设。第三，Erastin仅引发轻度氧化应激，细胞通过激活核因子 E2 相关因子 2/激活转录因子 4（NRF2/ATF4）等通路启动转录水平代偿，上调 FTH1、SLC7A11 mRNA 表达试图抵抗氧化损伤，但转录激活未能有效转化为蛋白水平提升，细胞仍维持存活状态[24]。第四，Erastin自身溶解度与化学稳定性有限，也可能影响其作用效果。有研究报道，利用如脂质体等纳米级药物载体[25]，可在一定程度上提高Erastin的递送效率。
IVDD的病理微环境复杂，涉及氧化应激、炎症因子浸润、机械应力负荷异常等多种因素。不同的病理因素可能通过不同分子途径诱导AFCs铁死亡。Erastin通过抑制系统Xc-阻断胱氨酸摄取，模拟炎症微环境下谷胱甘肽耗竭的病理状态[26]；RSL3通过直接抑制GPX4活性，模拟氧化应激导致GPX4失活的终末损伤阶段；TBHP作为一种外源性氧化剂，模拟IVDD中氧化应激直接攻击的病理过程。本研究表明RSL3 和 TBHP 更适用于构建 IVDD 体外铁死亡模型，该结论不仅为IVDD研究提供药物选择依据，对骨关节炎[27]、神经退行性疾病[28]等氧化应激相关退行性疾病的体外模型建立亦具有参考价值，同时为后续靶向AFCs铁死亡的抗 IVDD 药物筛选提供了稳定的实验体系。
本研究也存在一定局限性。其一，尚未完全阐明大鼠AFCs对Erastin不敏感的确切分子机制；其二，未使用经典铁死亡抑制剂（如Ferrostatin-1和Liproxstatin-1）或铁螯合剂（如Deferoxamine）进行阻断挽救实验，无法完全提示RSL3、TBHP 诱导的细胞死亡仅通过铁死亡途径实现，也不能排除凋亡、坏死等其他细胞死亡方式的参与。未来研究可通过特异性抑制剂阻断及联合其他细胞死亡通路抑制剂等方法，深入解析TBHP与RSL3诱导大鼠AFCs铁死亡的分子通路，并明确Erastin耐受的具体机制，为IVDD中AFCs铁死亡的靶向干预提供更充分的实验证据。
Funding Statement
国家自然科学基金资助项目（82272552）；广东省自然科学基金资助项目（2023A1515010403）
National Natural Science Foundation of China (82272552); Guangdong Natural Science Foundation (2023A1515010403)
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