乙型肝炎病毒DNA整合的发生机制及其临床意义

Abstract

Double-stranded linear DNA (dslDNA), considered to serve as a major precursor to integrated HBV DNA (iDNA), is generally located in the livers of patients with chronic HBV infection. Prior research has primarily focused on the role and mechanisms of HBV integration in the progression of hepatocellular carcinoma (HCC), demonstrating that iDNA can lead to genomic instability in the host and induce aberrant expression of host tumor-related genes around the integration sites, while viral proteins expressed by iDNA exhibit tumor-promoting effects. In recent years, the impact of iDNA-derived hepatitis B surface antigen on antiviral therapy in patients with chronic hepatitis B has received increasing attention with a deeper understanding of integrated HBV DNA. Consequently, the field has become a research hotspot and challenge in determining how to eliminate or silence iDNA to improve functional cure in patients with chronic hepatitis B. This paper aims to provide new sights to the clinical significance of iDNA and a theoretical basis for optimizing antiviral therapy strategies by summarizing the occurrence mechanisms of iDNA and its impact on the onset and progression of hepatocellular carcinoma and antiviral therapy for patients with chronic hepatitis B.

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的主要病因。2016年5月，世界卫生大会通过了“2030年消除病毒性肝炎公共卫生危害”的全球战略，明确提出需将HBV新发感染减少90%、相关死亡减少65%的核心目标^［1］。因此，有效防控HBV感染依然是全球公共卫生领域面临的一项重大挑战。

慢性HBV感染者肝细胞核内普遍存在插入宿主基因组的整合HBV DNA（integrated HBV DNA，iDNA）。既往研究多集中于iDNA促进HCC的作用及其机制。近年来，随着对HBV整合认识的逐渐深入，研究者日益关注iDNA来源的乙型肝炎表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）对慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者抗病毒治疗的影响。值得注意的是，iDNA在HBV感染早期即形成，并持续存在于慢性感染全程，已成为CHB患者实现功能性治愈的重要障碍。本综述系统总结了iDNA的形成机制、序列特征、动力学，以及其对HCC发生发展和CHB抗病毒治疗的影响，以期为深入了解iDNA的临床意义提供新视角，并为优化CHB治疗策略提供理论依据。

一、. HBV DNA的结构及其整合的发生机制

1. HBV DNA的结构和功能：血液中有感染性的HBV病毒颗粒称作Dane颗粒，其核衣壳内含有长度为3.2 kb的HBV DNA，即松弛环状DNA（relax circular DNA，rcDNA）。rcDNA为不完全闭合的双链环状DNA，包含带有完整HBV基因组的全长负链和5’端固定而3’端长短不一的正链。Dane颗粒外包膜上的大表面蛋白（L-HBsAg）可以与肝细胞膜上的钠离子牛磺胆酸协同转运蛋白（sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP）结合，帮助病毒颗粒通过内吞方式，进入肝细胞内部并释放出核衣壳。随后，核衣壳沿微管向细胞核运输，在核孔处释放rcDNA入核。在宿主酶作用下，rcDNA的缺口被修复并形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）^［2-3］。cccDNA是病毒RNA转录的模板，其形成是HBV生命周期的关键步骤，也是病毒建立持续感染的原因。

cccDNA包含4个重叠的编码区，分别是前C区（PreC）/C、P、前S区（PreS）/S和X区。在HBV感染的肝细胞核内，cccDNA可转录出5种长度不一的mRNA：PreC/C区的转录由核心启动子（core promoter，CP）起始，可以形成2组不同长度的mRNA。其中3.5 kb的前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）可翻译核心蛋白和聚合酶（polymerase，Pol），而另一长约3.5 kb的前核心蛋白RNA（PreC mRNA）则可翻译、加工、形成分泌的乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）。PreS/S区的转录受PreS1启动子（PreS1 promoter，SP1）、PreS2/S启动子（PreS2/S promoter，SP2）的驱动，SP1驱动转录的2.4 kb PreS1 mRNA可翻译L-HBsAg，SP2驱动转录的2.1 kb PreS2/S mRNA则翻译中表面蛋白（M-HBsAg）和小表面蛋白（S-HBsAg）；由X启动子（X promoter，XP）驱动的0.7 kb X mRNA翻译产生HBx蛋白。此外，HBV增强子1（HBV enhancer 1，Enh1）和HBV增强子2（HBV enhancer 2，Enh2）分别与XP和CP重叠，控制全部4种启动子的活性^［3］。其中Enh1主要增强CP和XP的活性，而Enh2主要激活SP1、SP2和XP的转录活性（图1）^［4］。

图1. 乙型肝炎病毒基因组的结构及转录示意图.

注：PreS为前S区；TP为DNA聚合酶末端蛋白；Spacer为间隔区；RT为逆转录酶；RNaseH为核糖核酸酶H；SP为前S区启动子；HBV为乙型肝炎病毒；DR为碱基互补；EN为HBV增强子；PolyA signal为多聚腺苷酸信号；CP为核心启动子；BCP为基本核心启动子；XP为X启动子；Core为核心区；PreC为前C区

2. HBV整合的发生机制：pgRNA是HBV基因组形成的模板，这是因为pgRNA不仅可以翻译核心蛋白和Pol蛋白，也可被逆转录形成rcDNA。HBV的逆转录过程需要经历3次跳转才能形成环状的rcDNA。首先，Pol的末端蛋白（terminal protein，TP）结构域第63位酪氨酸残基识别并结合pgRNA 5’端ε区，导致Pol构象改变，并合成一个寡核苷酸引物（序列为GAA或TGAA），Pol带着引物从pgRNA的5’端跳转到3’端碱基互补区（DR1区），这是第一次跳转^［3］。随后，Pol沿着3’到5’的方向合成负链DNA并通过其RNase H活性降解模板pgRNA，最终保留下pgRNA 5’端含16～18 bp长度的RNA序列，这段RNA在自身保留的DR1序列的引导下跳转到新合成负链DNA 5’端DR2区并与之互补结合，作为引物按3’到5’方向开始合成正链DNA，这是第二次跳转^［3，5］。最后，当正链延伸到负链5’端时，则带着Pol由负链5’端向3’端进行第三次跳转，继续合成不完全的正链DNA，最终形成环状的rcDNA^［3］。

在HBV逆转录过程中，若RNA引物未能完成第二次跳转，则Pol会在原位起始DNA正链的合成，形成双链线性DNA（double-stranded linear DNA，dslDNA）（图2）^［5-6］。与rcDNA类似，新合成的dslDNA也可以通过内补充进入肝细胞核形成cccDNA或者分泌至细胞外。此外，相较于rcDNA，带有游离末端的dslDNA更易于整合至肝细胞基因组DNA的双链断裂处，dslDNA也因此被认为是iDNA的主要前体^［7］。由于dslDNA末端病毒序列和宿主DNA断裂处的宿主序列之间几乎没有序列同源性，因此，dslDNA主要通过微同源末端连接（microhomology-mediated end joining，MMEJ）或非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）的方式整合入宿主基因组，并由于该修复方式易引入突变的特点，iDNA在形成过程中末端可能会伴有小片段的插入或缺失^{［2，6，8］}。

图2. rcDNA和dslDNA形成示意图.

注：CAP为mRNA的帽子结构；DR为碱基互补；HBV为乙型肝炎病毒；pgRNA为前基因组RNA；rcDNA为松弛环状DNA；dslDNA为双链线性DNA

二、. 整合HBV DNA的序列特征及其表达调控

1. 整合HBV DNA的序列及其表达：通过分析慢性HBV感染者肝内的HBV-宿主嵌合序列发现，iDNA的断点主要分布于DR1区（第1 824～1 834 bp）周围的狭窄区域内，提示iDNA最普遍的序列特征为相对完整的dslDNA序列^{［7，9-12］}。但近期van Buuren等^［13］通过靶向三代测序技术发现，在CHB患者肝活组织检查（肝活检）组织中仅小部分iDNA序列呈现完整HBV基因组结构，多数iDNA为亚基因组片段，平均长度约为2.3 kb。此外，近三分之一样本中检测到HBV相关染色体易位，即插入的iDNA两端连接着两条不同宿主染色体序列。与整合片段相比，HBV相关染色体间易位通常包含更短的HBV序列（约1.6 kb），提示HBV DNA可能在染色体重排过程中发生了片段缩短^［13］。相较于环形的cccDNA，iDNA片段中CP因发生部分截断且位于PreC/C区下游，理论上不具备转录pgRNA的能力，不能产生子代病毒。相反，iDNA通常保留了完整的SP1和SP2以及PreS/S区，具有表达L-、M-、S-HBsAg的能力^［13-14］。此外，Enh1及大部分X区的保留也使得iDNA具有表达HBx的潜能，但由iDNA编码的HBx蛋白通常会发生至少3个氨基酸的缺失^［5］。此外，van Buuren等^［13］的研究结果还显示，CHB患者肝活检组织中的iDNA也存在少量长度超过3.2 kb的完整HBV基因组序列，且可转录出超过3.2 kb的HBV RNA。虽然该研究未检测到能够转录出pgRNA的整合类型，但上述超全长整合序列的存在表明，这种转录事件在理论上具有可能性。

研究结果显示，cccDNA与iDNA来源的转录本在3’端存在序列差异。cccDNA来源的病毒转录本绝大多数在X区下游的经典HBV多聚腺苷酸化（poly A）序列处终止转录。而iDNA来源的转录本则呈现两种类型：一种为HBV-宿主嵌合型转录本，其转录从HBV序列通读至宿主基因组，并在最近的宿主poly A位点处终止转录。另一种为非嵌合型转录本，由于经典的HBV poly A信号位于PreS/S和X区上游而无法正常发挥作用，转而使用iDNA内部位于X区的非经典poly A信号终止。因此，HBV-宿主嵌合序列与带有非经典poly A信号的病毒转录本，是当前鉴定iDNA来源转录本的关键特征（图3）^{［8，13，15-16］}。

图3. 整合HBV DNA的序列及转录特征示意图（修改自文献[16]）.

注：MMEJ为微同源末端连接；HBV为乙型肝炎病毒；dslDNA 为双链线性DNA；NHEJ为非同源末端连接；SP为前S区启动子；XP为X启动子；CP为核心启动子；BCP为基本核心启动子；DR为碱基互补；Enh为HBV增强子；Poly A为多聚腺苷酸；TP为DNA聚合酶末端蛋白；Spacer为间隔区；RT为逆转录酶；RNaseH为核糖核酸酶H；PreS为前S区；PreC为前C区

2. 整合HBV DNA的表达调控：iDNA的转录调控机制与cccDNA不同。近期研究结果显示，在HBsAg活跃表达的PLC/PRF/5和Hep3B肝癌细胞系中，iDNA中的Enh2缺乏活性但Enh1仍保留活性^［17］。由于iDNA中CP功能缺失，使得原来主要调控CP的Enh1重新定位，转而激活SP1和SP2，且由于其对SP1激活作用更强，导致更多的L-HBsAg表达，进而使iDNA来源的HBsAg分泌受阻^［4］。此外，整合位点周围宿主染色体的甲基化和乙酰化修饰水平也可以影响iDNA的转录表达，提示iDNA也受宿主的表观遗传调控^［18］。

三、. 整合HBV DNA的检测方法

目前，改良PCR技术（如Alu-PCR、反向PCR等）是检测iDNA较常用的方法。这些技术通过设计特定引物扩增HBV-宿主DNA连接序列，并结合测序分析，能够确定iDNA中的部分整合序列及其在宿主基因组中的插入位点^［5］。其主要优势在于成本低，且能够鉴定未知的整合位点。然而，这类方法操作较为复杂，检测覆盖范围存在固有的偏好性，灵敏度和特异性相对有限。

2012年，全基因组测序技术首次用于iDNA检测，成功在HCC组织及其配对癌旁组织中检测到多个整合位点^［5］。随后，捕获测序（Cap-seq）及RNA测序（RNA-seq）技术也相继应用于iDNA及其转录本的分析。以高通量为特点的二代测序技术能够对肝细胞中的iDNA或其来源的RNA进行无偏好性、大规模检测。但其主要局限在于通常只能获取HBV-宿主序列的一端信息，且读长较短（约70～90 bp），难以解析完整的HBV整合区域及病毒元件。相比之下，第三代测序（third-generation sequencing，TGS）凭借其高精度和长读长的优势，无需PCR扩增即可直接检测完整的iDNA片段，并能识别二代测序难以区分的复杂整合形式^{［12，19］}。目前，已发展起来的第三代RNA测序技术正越来越多地被应用于iDNA来源mRNA的检测^{［4，13，15］}。

四、. HBV整合动力学

iDNA的形成是HBV生命周期中的偶然事件。研究估计，在鸭肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）和土拨鼠肝炎病毒感染的动物肝脏中，整合频率约为每10³～10⁴个肝细胞发生一次。在易感的HBV感染肝癌细胞系也报告了类似的整合频率^［20］。考虑到人类肝脏大约有2.5×10¹¹个肝细胞，而人类基因组约有2万个基因，在慢性感染的肝脏中平均每个基因可能累计超过100次HBV整合事件^［20］。此外，尽管目前尚无研究直接比较不同HBV基因型的整合频率，但已有研究结果显示，C基因型HBV感染较其他基因型更容易引起肝细胞染色体断裂、内质网应激及活性氧生成，这可能间接提示C基因型感染后iDNA的发生概率更高^［21-25］。

iDNA在HBV急性感染的早期阶段即可发生^{［2，5，11，13］}，并可贯穿慢性HBV感染的不同阶段^［8，17］。研究结果显示，不同疾病进程CHB患者的肝组织中均可检测到大量iDNA，且处于免疫耐受期HBV感染者同样表现出显著的肝细胞克隆性扩增^［26-27］。此外，多项研究结果显示，HBeAg阳性患者肝组织中iDNA的水平及转录活性均显著高于HBeAg阴性患者^［28］，提示HBeAg阳性患者更易发生HBV DNA整合，这一现象或与该类患者体内病毒复制更为活跃有关^［29］。然而，基于靶向TGS技术开展的研究却显示，HBeAg阳性组与阴性组患者的肝组织iDNA负荷及转录负荷差异均无统计学意义^［13］，表明不同iDNA检测技术的选择可能对实验结论产生关键性影响。

对于HBeAg阴性患者而言，其肝组织中的cccDNA多处于静默或表达抑制状态，此时肝组织中的病毒RNA主要为iDNA来源的HBV-宿主嵌合型和非经典加尾mRNA。这也意味着，该类患者血清中的HBsAg主要来自iDNA，其水平主要反映iDNA的转录活性^［30-33］。相反，HBeAg阳性患者肝组织中的cccDNA处于活跃转录状态，其活性远高于iDNA，因此其血液HBsAg主要由cccDNA转录产生，相应水平主要体现肝内cccDNA负荷及其转录活性^{［4，30-31］}。

五、. HBV整合对肝癌的影响

1. 整合HBV DNA的致癌机制：iDNA被认为是HBV致癌的重要机制。在HBV慢性感染造成的肝细胞反复炎症损伤和再生过程中，携带了iDNA的部分肝细胞会因增殖优势而发生克隆性扩增，形成细胞集落。很显然，伴随细胞增殖过程的突变积累使得患者有更高的肝癌发生风险。此外，急性感染早期阶段即可发生HBV整合，提示关口前移、及早抗病毒治疗可以降低慢性HBV感染者的长期肝癌风险^［9，11］。

目前认为，iDNA可以通过如下机制诱导HCC的发生：首先，iDNA破坏了宿主基因组的稳定性，可引发肝细胞的染色体重排或基因断裂。其次，iDNA整合到宿主基因组后，可引起整合位点周围的癌基因异常表达或抑癌基因表达抑制，使肝细胞获得异常增殖的能力。此外，iDNA还可以持续表达HBsAg和HBx蛋白C端截短体（carboxyl terminal truncated HBx，CtHBx），后者可以抑制细胞凋亡及诱导干细胞样特性等，促进肝细胞的恶性转化。近期研究结果显示，iDNA的部分序列还可以与宿主DNA片段一起形成环状的染色体外DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA），并扩增至数百个拷贝，可能在HBV相关HCC发生中也发挥重要作用^［34］。此外，亚洲地区流行的HBV基因型主要是B型和C型，而B/C型HBV的长期慢性感染及其造成的肝细胞反复损伤及再生，可能为携带iDNA且具有生存优势的肝细胞克隆提供了更充足的扩增时间，从而更易发展为HCC^［21］。

2. HCC中的HBV整合热点：虽然HBV在人类基因组中的整合整体呈随机分布，但在HCC组织中却已发现多个明确的整合热点。例如，约25%的HCC组织中存在人端粒酶逆转录酶（telomerase reverse tranase，TERT）基因启动子区的HBV整合，约12%的HCC样本在组蛋白甲基转移酶混合谱系白血病4（mixed lineage leukemia 4，MLL4，也称为KMT2B）基因第3～6外显子区检测出整合，另有约2%的样本存在细胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）基因的整合^［35］。这些高频整合事件提示，携带此类整合的肝癌细胞可能具有更强的选择性增殖优势。转录组分析表明，iDNA能显著上调TERT和CCNE1基因表达，其机制可能源于iDNA中所携带的病毒增强子-启动子元件对宿主基因的顺式激活。而在MLL4基因中的整合，则通常导致N端截短型MLL4蛋白的产生，这类截短体可能获得新的表观遗传调控功能。进一步研究结果显示，根据HBV DNA整合位于MLL4外显子或TERT启动子区，可将HCC分为两个独立且几乎无重叠的分子亚群，不同亚群患者对现有免疫检查点抑制剂或靶向治疗时的应答及预后可能存在差异^［36］。鉴于这些HCC亚群具有独特的致癌机制（如TERT激活或截短型MLL4表达），未来有望针对其特定的iDNA整合位点或下游效应分子，开发更具针对性的精准治疗策略。

3. HBV-宿主嵌合DNA可作为HCC特征性循环肿瘤标志物：近年来，HBV-宿主嵌合DNA（virus-host chimera DNA，vh-DNA）作为潜在的HCC特征性循环肿瘤标志物，正受到学界的广泛关注^［37］。研究证实，在HBV相关HCC患者中，约90%的肿瘤细胞存在iDNA，这一占比显著高于TERT启动子或TP53基因突变等其他体细胞突变类型，使iDNA成为一种兼具特异性与普适性的分子标志物。进一步研究结果显示，vh-DNA可作为反映绝大多数HBV相关HCC患者肿瘤负荷的循环生物标志物，且在肿瘤切除后，能够有效监测残余病灶和肿瘤复发风险^［38］。尽管vh-DNA具备分子结构相对稳定、易于从脱落肿瘤细胞中分离和富集的独特优势，但其临床检测流程仍存在明显局限：需先通过高通量测序技术鉴定肿瘤组织中个体化的HBV整合位点，再针对性设计特异性引物进行定量分析，全程耗时较长且成本高昂，难以在临床中推广。同时，在肿瘤负荷较低或早期复发阶段，血液中vh-DNA丰度极低，现有检测方法的灵敏度不足以精准识别微小残留病灶，存在较高的假阴性风险。因此，未来尚需开发高灵敏度、易于临床应用的循环vh-DNA检测方法，以更准确地反映肝脏中含有iDNA的肝细胞克隆扩增状态，从而助力CHB患者中HCC高风险人群的早期筛查与分层管理^［39］。

六、. HBV整合对CHB抗病毒治疗的影响

1. 整合HBV DNA对功能性治愈的影响：目前CHB患者的理想治疗终点是功能性治愈，即在停止治疗后24周内持续的HBsAg与HBV DNA低于检测下限，无论其是否伴有抗-HBs的血清学转换^［40］。然而，无论是核苷（酸）类似物［nucleos（t）ide analogues，NAs］的长期治疗还是聚乙二醇干扰素α（pegylated interferon-alpha，PEG-IFN-α）的有限疗程治疗，均很难实现CHB患者的功能性治愈。从病毒学角度看，功能性治愈代表了cccDNA和iDNA同时清除或静默的状态。

近年的多项研究证实，即使cccDNA被彻底清除或完全沉默，来源于iDNA的HBsAg仍可维持患者血清HBsAg的持续阳性状态，由此可见，iDNA也是阻碍CHB患者实现功能性治愈的关键因素。Hu等^［41］的研究结果显示，基线肝组织未检测到iDNA的CHB患者，经NAs治疗2年后，血清HBsAg水平出现了明显下降。与之相反，基线时肝内存在iDNA的CHB患者，在长期NAs治疗后，仍保持了稳定的血清HBsAg水平。此外，Gu等^［42］近期通过对45例基线有肝活检结果的CHB患者开展高通量病毒整合检测结果显示，基线肝组织iDNA断点类型少于28个的患者，经96周PEG-IFN-α治疗后，血清HBsAg阴转率显著高于断点类型超过28个的患者；该研究同时证实，基线iDNA断点类型的数量可作为预测抗病毒治疗后HBsAg清除效率的有效指标。上述结果提示，抗病毒治疗启动时的基线iDNA水平，直接影响CHB患者治疗过程中HBsAg水平的降低幅度；基线时iDNA水平越高、断点类型越复杂，患者实现HBsAg清除及功能性治愈的难度则越大。

此外，多项研究进一步证实，在抗病毒治疗过程中，iDNA的负荷水平和HBsAg的表达状态同样影响CHB患者的功能性治愈。有研究通过评估接受NAs治疗的CHB患者肝组织内HBV阳性肝细胞的占比发现，治疗过程中总HBV阳性肝细胞负荷的下降，主要由核心蛋白阳性肝细胞的显著减少所驱动；而HBsAg阳性肝细胞的占比在观察期内变化微小，这一现象提示，NAs治疗期间iDNA可持续驱动HBsAg的表达，进而阻碍患者功能性治愈的实现^［10］。另一项基于肝穿刺组织的RNA-Seq测序研究则揭示，随着NAs的长期治疗，患者血清HBsAg的来源会发生根本性转变，由初始阶段的cccDNA来源为主，逐渐过渡为以iDNA为主要来源；一旦进入该阶段，NAs治疗便难以再带来血清HBsAg水平的下降^［43］。与此结果高度一致，Grudda等^［44］和Taddese等^［45］的研究也证实，即便在抗病毒治疗的持续干预下，iDNA仍能稳定维持HBsAg的持续产生。值得注意的是，Gu等^［42］还对接受PEG-IFN-α 48周治疗并完成肝活检的CHB患者进行了高通量病毒整合检测，结果显示，最终实现HBsAg清除的患者，其治疗第48周时检测到的iDNA断裂点类型和数量，均显著低于未实现HBsAg清除的患者。上述结果提示，在抗病毒治疗过程中，cccDNA会逐步被清除或表观静默，但iDNA的持续存在会维持血清HBsAg阳性；治疗过程中iDNA水平降幅更显著、HBsAg表达水平更低的CHB患者，实现功能性治愈的可能性越大。

然而，HBV整合对CHB患者功能性治愈后长期结局的临床影响目前仍不明确。近期，Gao等^［46］采用RNA-seq技术，在已实现功能性治愈的CHB患者肝组织中，仍检测到来自iDNA的转录本表达。与此一致，Yu等^［17］对18例慢性HBV感染者的肝活检样本开展空间转录组研究结果显示，在3例经抗病毒治疗后实现HBsAg阴转的CHB患者肝组织中，同样存在少量的HBV-宿主转录本。基于第二代测序的技术限制，上述两项研究均未能获得iDNA来源转录本的全长序列，因此尚无法明确这些转录本是否具备翻译表达HBsAg的能力。然而，该研究结果提示，即使CHB患者实现了功能性治愈，仍应进行长期随访与监测，以明确其远期临床结局与复发风险。

2. HBV整合对CHB治疗策略的影响：据估计，男性CHB患者一生中罹患HCC的风险约为30%，女性患者则约为10%。如前文所述，处于免疫耐受期的CHB患者的肝组织中即已存在高水平iDNA、肝细胞克隆扩增、HBV特异性T细胞应答异常及肝脏损伤等特征。此外，在部分CHB患者肝组织中可检测到HBV相关染色体易位，可能导致宿主基因异常表达，并在肝细胞的克隆扩增和恶性转化中发挥作用，表明肝细胞的癌变进程可能在感染早期即已启动^［26］。一项纳入8家医院484例丙氨酸转氨酶正常的免疫耐受期患者的临床研究结果显示，未接受治疗的免疫耐受期患者发生肝硬化和HCC的风险显著高于接受治疗的患者^［47］。该结果不仅凸显了早期启动抗病毒治疗的临床获益，更提示及时开展抗病毒治疗是降低HBV感染危害的关键策略。

多项研究结果显示，抗病毒治疗可以减少具有转录活性的iDNA数量，并下调其转录活性。NAs虽不直接靶向已存在的iDNA及其转录产物，但可通过抑制pgRNA的逆转录过程，减少rcDNA和dslDNA的形成，进而降低新发iDNA的生成数量^［13］。相较于NAs，干扰素作为一类免疫激活剂，不仅可直接抑制HBV复制，还能通过激活机体免疫，清除携带iDNA并发生克隆性扩增的肝细胞^［48-50］。Yu等^［17］的研究结果显示，与未经治疗的患者相比，正在接受或完成抗病毒治疗的CHB患者，其肝活检样本中携带iDNA的肝细胞占比显著降低；转录组测序结果显示，肝组织中HBV-宿主嵌合序列的检出读数明显减少。与上述结果一致，Wen等^［43］的研究显示，无论是NAs单药还是联合PEG-IFN-α进行抗病毒治疗，均显著降低了第78周和第260周的血清HBV DNA水平，同时在抗病毒治疗期间观察到iDNA转录本水平、血清HBsAg和HBsAg阳性肝细胞的比率显著下降。Gan等^［48］的研究也显示，2例经PEG-IFN-α治疗后获得功能性治愈的CHB患者中，其肝组织中iDNA显著少于未接受治疗患者。由此可见，开发同步抑制新发整合与清除现有整合肝细胞的联合治疗策略，有望推动更多CHB患者实现功能性治愈。

3. HBV整合对CHB新型疗法的影响：目前，以实现功能性治愈为目标的多种CHB治疗新药和新技术已进入临床试验阶段^［51］。这些药物主要包括两类：一是直接靶向病毒的药物和技术，如规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技术、衣壳变构剂、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASO）等；二是重建免疫应答的药物，如治疗性疫苗、先天免疫激活剂及中和抗体等（表1）。上述新药和新技术的研发为特异性清除或静默cccDNA与iDNA、重建宿主抗HBV免疫提供了新途径，也为更多CHB患者实现功能性治愈带来了希望。

表1.

乙型肝炎治疗新药和新技术

种类	新药和新技术	抗病毒机制
直接抗病毒药物	CRISPR/Cas9技术	靶向切割cccDNA和iDNA
	EPIREG技术	改变组蛋白修饰，靶向沉默cccDNA和iDNA
	碱基编辑器	引入终止密码子，沉默病毒蛋白表达
	siRNA	靶向降解HBV mRNA、减少病毒蛋白表达
	ASO	靶向降解HBV mRNA、减少病毒蛋白表达、免疫激活作用
抗HBV特异性免疫重建药物	单克隆抗体	解除对T细胞的抑制，激活免疫系统
	治疗性疫苗	打破免疫耐受，增强HBV特异性T细胞反应
	TCR-T	外源补充T细胞，弥补免疫细胞功能不足

注：HBV为乙型肝炎病毒；CRISPR/Cas9为规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白9；EPIREG为表观遗传调控；siRNA为小干扰RNA；ASO为反义寡核苷酸；TCR-T为T细胞受体工程化T细胞疗法；cccDNA为共价闭合环状DNA；iDNA为整合DNA

CRISPR/Cas9和碱基编辑器（base editor，BE）等基因编辑技术可直接靶向并清除cccDNA和iDNA^［52］。具体而言，CRISPR/Cas9技术通过设计靶向保守HBV序列的向导RNA（guide RNA，gRNA）来切割破坏cccDNA以及iDNA^［53-54］，亦可借助其衍生的dCas9，融合DNA甲基转移酶和组蛋白修饰效应器，通过修饰组蛋白来沉默cccDNA和iDNA^［55］。而BE技术则能在cccDNA与iDNA中精准引入终止密码子，从而沉默病毒蛋白表达并抑制HBV复制^［56］。目前，相关研究仍集中于临床前阶段，其安全性和有效性仍需深入验证。

siRNA和ASO是基于HBV RNA的靶向抗HBV策略。通过精准的靶向设计，二者均可特异性降解来自cccDNA和iDNA的所有种类HBV RNA，进而抑制病毒蛋白产生与病毒复制^［57-59］。临床进展方面，ASO药物Bepirovirsen在Ⅱb期临床试验中使29%的CHB患者实现HBsAg清除^［59］。而siRNA与PEG-IFN-α的联合治疗方案也显示出了较好的协同潜力，能在20%的患者中诱导持续的HBsAg清除^［60］，这为追求功能性治愈提供了有前景的组合路径。

实现功能性治愈的关键是重建CHB患者的HBV特异性免疫，其核心机制在于恢复HBsAg特异性CD8⁺T细胞反应，从而有效清除含有HBV复制或表达整合来源HBsAg的肝细胞。当前免疫治疗策略主要分为三类：一是免疫检查点抑制剂，如纳武单抗（单用或联用GS-4774）在Ⅱ期临床试验中使1/24的HBeAg阴性患者获得HBsAg清除^［61］。二是过继性细胞疗法，以靶向HBsAg的SCG101T细胞受体工程化T细胞疗法为代表，临床前研究显示其能特异性识别并攻击HBsAg阳性的肝细胞和肝癌细胞，显著降低血清HBsAg水平^［62］。三是治疗性疫苗，例如mRNA-LNP疫苗在小鼠模型中成功诱导了HBsAg血清学转换^［63］。而基于慢病毒载体的疫苗则改善了小鼠T细胞反应，并使2名携带者血清HBsAg持续下降^［64］。这些进展共同揭示了通过免疫重建实现临床治愈的可行路径。

七、. 当前难点与未来方向

iDNA对CHB功能性治愈的影响是近年研究热点，但领域内仍面临多重挑战，未来需从多维度突破。现有研究缺乏高仿真HBV整合模型，未来可借助CRISPR技术构建特定整合位点的肝癌细胞系，或结合患者来源肝类器官或人源化小鼠建立更贴近临床的iDNA动态研究模型。Enh1在iDNA转录表达HBsAg中作用明确，但相关宿主因子及分子机制尚未阐明，未来尚需依托仿真模型系统验证。当前缺乏无创的反映iDNA数量和转录活性的生物标志物，需挖掘血液中整合特异性转录本及特异性分子替代肝穿刺检测。此外，iDNA在宿主基因组中的整合位点分散导致选择性靶向清除或沉默困难，未来需研发基于表观编辑或广谱siRNA/ASO的精准靶向技术，并通过大样本队列验证直接抗病毒药物与免疫激活剂联合用药方案清除iDNA的安全性和有效性，为临床治愈提供新策略。

利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突

引用本文：

施烨娟, 张凯旋, 李沐雨, 等. 乙型肝炎病毒DNA整合的发生机制及其临床意义[J]. 中华肝脏病杂志, 2026, 34(7):699-707. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20250902-00359.

作者贡献声明

施烨娟、张凯旋、李沐雨：撰写文章、文献查询和整理；陆丹娟：对文章的知识性内容作批注性审阅；陈香梅：文章构思、指导、对文章的知识性内容作批注性审阅

Funding Statement

国家“十四五”重点研发计划（2024YFC2311000）

National Key Research and Development Program of China (2024YFC23110000)