PBNP联合小鼠ADSC对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的影响及其机制

Highlights

(1) It revealed that Prussian blue nanoparticles (PBNPs) significantly inhibited high glucose-induced senescence of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) by downregulating the expressions of senescence-associated proteins p16 and p21, and decreasing β-galactosidase activity.

(2) It demonstrated that PBNPs combined with mouse ADSCs could accelerate the repair of full-thickness skin defects in diabetic mice, providing a novel stem cell "rejuvenation" strategy for non-healing diabetic wounds.

Abstract

Objective

To investigate the influence and mechanism of Prussian blue nanoparticles (PBNPs) combined with mouse adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) on full-thickness skin defect wounds in diabetic mice.

Methods

This study was an experimental study using group design and repeated-measures design. PBNPs were prepared by hydrothermal synthesis, and their morphology was characterized by transmission electron microscopy. ADSCs were isolated from five male 6-8-week-old Institute of Cancer Research (ICR) mice, USA via collagenase digestion. The cells were divided into control group cultured under routine conditions, high-glucose group cultured with glucose in a final molarity of 30.0 mmol/L, and low-PBNP group and high-PBNP group pretreated with 10 or 20 μg/mL PBNP for 12 h, respectively, followed by the same treatment as in high-glucose group. After 24 h of culture, cell viability was assessed using the cell counting kit-8, the proportion of senescent cells in the cells was detected by β-galactosidase staining, and the protein expression levels of senescence-associated proteins p16 and p21 were determined by Western blotting. Twenty-four male 6-8-week-old ICR mice were used to establish the diabetic model. A full-thickness skin defect wound was then created on the back of each mouse. The injured mice were divided into four groups (with 6 mice in each group) according to the random number table method, including control group with wounds treated with normal saline, ADSC group with wounds treated with normal saline containing 5×10⁶ ADSC (the same number of cells used below), low-PBNP group and high-PBNP group with wounds treated with normal saline containing ADSC pretreated with 10 and 20 μg/mL PBNP for 12 h, respectively. Wound healing was observed at post-injury day (PID) 0 (immediately), 3, 7, 10, and 14. The percentage of remaining wound area was calculated at PID 3, 7, 10, and 14. At PID 7, the protein expression levels of the cell proliferation markers Ki67 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in wound tissue were detected by immunofluorescence method. At PID 14, the expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-6, and IL-10 in wound tissue were determined by enzyme-linked immunosorbent assay.

Results

PBNPs exhibited a dispersed regular cubic structure. After 24 h of culture, compared with those in control group, cells in high-glucose group showed a significantly lower cell viability (P < 0.05), a significantly higher proportion of senescent cells (P < 0.05), and significantly higher protein expression levels of p16 and p21 (P < 0.05). Compared with those in high-glucose group, cells in low-PBNP and high-PBNP groups showed significantly higher cell viability (P < 0.05), significantly lower proportions of senescent cells (P < 0.05), and significantly lower protein expression levels of p16 and p21 (P < 0.05). From PID 0 to 14, the wounds of mice in all four groups healed gradually. At PID 3, 7, 10, and 14, the percentages of remaining wound area of mice in high-PBNP group were (75.3±3.1)%, (46.7±2.5)%, (24.0±5.2)%, and (8.0±1.0)%, respectively, all significantly lower than (85.0±2.0)%, (62.7±3.1)%, (46.7±3.8)%, and (19.3±2.1)% in ADSC group (P < 0.05). At PID 7, the percentage of remaining wound area of mice in ADSC group was significantly lower than that in control group ((77.3±3.2)%, P < 0.05). At PID 7, the protein expression levels of Ki67 and VEGF of cells in ADSC group were significantly higher than those in control group (P < 0.05), the protein expression levels of Ki67 of cells in low-PBNP and high-PBNP groups and the protein expression level of VEGF of cells in high-PBNP group were significantly higher than those in ADSC group (P < 0.05). At PID 14, compared with those in control group, wound tissue in ADSC group showed a significantly higher expression level of IL-10 (P < 0.05) and significantly lower expression levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 (P < 0.05); compared with those in ADSC group, wound tissue in low-PBNP and high-PBNP groups showed significantly higher expression levels of IL-10 (P < 0.05) and significantly lower expression levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 (P < 0.05).

Conclusions

PBNP can inhibit high glucose-induced senescence of mouse ADSCs. PBNP combined with mouse ADSCs is more effective than mouse ADSCs alone in promoting cell proliferation and angiogenesis in full-thickness skin defect wounds of diabetic mice, inhibiting the release of inflammatory cytokines, and accelerating wound healing.

糖尿病是一种全球范围内高发的代谢性疾病，其慢性并发症之一是糖尿病足溃疡，这不仅影响患者的生活质量，还可能导致截肢甚至死亡^[1]。糖尿病患者伴随的高血糖、免疫功能紊乱、微循环障碍等情况，使得其创面愈合能力显著下降，对此，传统的治疗手段往往效果有限^[2]。

脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesen-chymal stem cell，ADSC）来源广泛、免疫调节能力强、促血管生成及组织修复能力突出，被认为是治疗糖尿病创面的理想种子细胞。ADSC不仅能分泌多种促愈合因子，还能通过旁分泌作用改善局部微环境，促进创面的组织再生和修复^[3]。然而，单一的干细胞治疗在临床应用中存在许多挑战，如细胞移植后存活率低、局部微环境调控不足等问题^[4]。糖尿病创面高糖环境及创面中的晚期糖基化终末产物会诱导ADSC内活性氧产生并诱导ADSC凋亡^[5]，同时高糖环境会诱导ADSC衰老^{[6, 7]}，因此需要探寻改善ADSC在糖尿病创面应用效果的方法。

普鲁士蓝纳米颗粒（Prussian blue nanoparticle，PBNP）因其优异的抗氧化性能、低毒性及良好的生物相容性，已被广泛用于治疗炎症性疾病、神经退行性疾病等多种疾病^[8]。研究证实PBNP通过减轻细胞的氧化应激损伤和凋亡，有助于加快糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的愈合进程^[9]。此外，本课题组的前期细胞实验证明PBNP的抗氧化、抗炎作用保护了ADSC，使其具有抗过氧化氢导致的凋亡的作用^[10]。然而，目前关于PBNP是否能抑制高糖环境导致的ADSC衰老尚未被阐明，对此，本研究开展相关实验，并评估PBNP与ADSC联合应用治疗糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的效果。

1. 材料与方法

本成组设计与重复测量设计实验研究经扬州大学实验动物伦理委员会批准（批号：202501010），实验操作严格遵循扬州大学实验动物管理规定及国家有关实验动物管理和使用的规定。

1.1. 动物及主要试剂与仪器来源

29只6~8周龄、体重（20.0±2.0）g的健康无特殊病原体级雄性美国癌症研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠购自扬州大学比较医学研究院，生产许可证号：SCXK（苏）2022-0009，使用许可证号：SYXK（苏）2022-0044。小鼠饲养于无特殊病原体级环境中，自由进食及饮水，实验前适应性喂养1周。

铁氰化钾、聚乙烯吡咯烷酮购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，1 g/L胶原酶Ⅰ、特级胎牛血清、α-MEM培养基、DMEM培养基、StemPro Accutase细胞解离试剂购自美国赛默飞世尔科技有限公司，链脲佐菌素溶液、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚、Masson染色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、β-半乳糖苷酶染色试剂盒、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗小鼠p21、p16、VEGF、Ki67（细胞增殖标志物）、β-微管蛋白单克隆抗体及Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体购自美国Abcam公司，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司。

HT7800型透射电子显微镜购自日本日立公司，LSM 880NLO型双光子激光扫描共聚焦显微镜购自德国卡尔蔡司公司，Tanon 5200系列全自动化学发光仪购自上海天能生命科学有限公司，ELX-800型酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，DM4B型光学显微镜购自德国徕卡公司。

1.2. PBNP的制备与表征

称取12.375 g铁氰化钾和125 g聚乙烯吡咯烷酮，参考本课题组前期研究^[11]，采用水热合成法制备PBNP。将PBNP溶液滴加于铜网，静置30 min干燥，置于透射电子显微镜100 000倍放大倍数下观察PBNP微观形貌。

1.3. 细胞实验

1.3.1. ADSC的分离与培养及鉴定

取5只ICR小鼠，常规麻醉后采用颈椎脱臼法处死（处死方法下同）。取小鼠腹股沟两侧脂肪，用PBS洗涤3次，剪刀剪碎，加入2 mL胶原酶Ⅰ，于37 ℃水浴消化30 min，用孔径为70 μm细胞筛过滤。收集滤液，于4 ℃，以离心半径7.5 cm、1 000 r/min离心10 min，弃去上清液。用含体积分数10%特级胎牛血清的α-MEM培养基重新悬浮细胞后，转移到细胞瓶中，于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳的细胞培养箱中培养，每隔48 h更换1次培养基。当细胞生长至90%以上融合时，用细胞解离试剂消化细胞后传代，传至第3代，冻存，用于后续实验。参考本课题组前期研究方法，采用流式细胞术检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD90、CD73、CD34、CD45，鉴定细胞为ADSC^[10]。

1.3.2. ADSC存活率检测

将ADSC以每孔5×10⁴个的密度接种到96孔板中，用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养（下称常规培养），待细胞生长至50%融合时，将其分为常规培养的对照组、用含终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养的高糖组，以及分别经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h后同高糖组处理的低PBNP组、高PBNP组。培养24 h后，按照CCK-8说明书，每孔加入10 μL CCK-8试剂，用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度，按常规计算细胞存活率。本实验样本数为3。

1.3.3. ADSC中衰老细胞占比检测

将ADSC以每孔1×10⁵个的密度接种于12孔板中后同1.3.2进行分组处理。培养24 h后，用β-半乳糖苷酶染色试剂盒处理细胞，根据说明书进行染色。在光学显微镜200倍放大倍数下观察细胞衰老（衰老细胞阳性染色为蓝色）情况，每孔计数100个细胞，计算衰老细胞占比，衰老细胞占比=衰老细胞数÷总细胞数×100%。本实验样本数为3。

1.3.4. ADSC中p16与p21的蛋白表达水平检测

将ADSC以每孔1×10⁵个的密度接种于6孔板中后同1.3.2进行分组处理。培养24 h后，提取各组细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测细胞中p16与p21的蛋白表达水平。一抗为兔抗小鼠p16、p21、β-微管蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体（稀释比为1∶10 000）。用全自动化学发光仪显影目的蛋白，用ImageJ 6.0软件（美国国立卫生研究院）分析灰度值，以β-微管蛋白为内参照，计算p16、p21的蛋白表达。本实验样本数为3。

1.4. 动物实验

1.4.1. 小鼠分组与处理

取24只ICR小鼠，使用高脂高糖饲料喂养6周后，按10 mL/kg的剂量一次性腹腔注射10 g/L链脲佐菌素溶液，注射后3 d测量尾静脉血糖，将血糖水平连续3 d≥16.7 mmol/L的小鼠视为糖尿病模型建立成功，纳入后续研究。对糖尿病小鼠行背部剃毛，常规麻醉后将直径为10 mm的圆形全层皮肤切除，构建全层皮肤缺损创面模型。伤后0 d（即刻），采用随机数字表法，将小鼠分为对照组、ADSC组、低PBNP组、高PBNP组（每组6只小鼠），其创面分别一次性滴加体积均为200 μL的生理盐水、含5×10⁶个ADSC（细胞数量后同）的生理盐水，以及含经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h的ADSC的生理盐水。用无菌纱布覆盖创面，每日更换纱布。

1.4.2. 创面愈合情况观测

每组取3只小鼠，分别于伤后0、3、7、10、14 d观察创面愈合情况并拍照，采用ImageJ 6.0软件测量创面面积并计算伤后3、7、10、14 d剩余创面面积百分比。

1.4.3. 创面组织中Ki67和VEGF的蛋白表达检测

伤后7 d，取各组剩余3只小鼠，常规麻醉后处死，无菌条件下从距创缘5 mm处切取包括整个创面在内的组织块，常规石蜡包埋后制备4 μm厚组织切片。采用免疫荧光法检测创面组织中Ki67和VEGF的蛋白表达水平，一抗为兔抗小鼠Ki67、VEGF单克隆抗体（稀释比均为1∶100），二抗为Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体（稀释比为1∶200），用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，用抗荧光淬灭封片剂封片。在激光扫描共聚焦显微镜200倍放大倍数下观察Ki67和VEGF（阳性染色均呈红色）的蛋白表达（以荧光强度表示）情况，使用ImageJ 6.0软件对荧光强度进行定量分析。

1.4.4. 创面组织中胶原纤维合成情况观测

伤后14 d，将各组行创面愈合情况观察后的3只小鼠常规麻醉后处死，同1.4.3取材并取部分创面组织制作4 μm厚组织切片，常规进行Masson染色，在光学显微镜200倍放大倍数下观察创面组织中胶原纤维（阳性染色呈蓝色）合成情况。

1.4.5. 创面组织中炎症因子表达水平检测

取1.4.4中各组剩余创面组织，加入适量PBS进行研磨制备匀浆液，于4 ℃、以5 000×g离心10 min后收集上清液，按照TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA试剂盒说明书对前述上清液进行处理，采用酶标仪检测其在450 nm波长处的吸光度，以此表示各炎症因子表达水平。

1.5. 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布且方差齐，以x±s表示。单一时间点多组间总体比较采用单因素方差分析；多组多个时间点总体比较采用重复测量方差分析，组间多重比较采用Tukey检验。所有统计检验为双侧检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. PBNP的表征

PBNP形貌规则，呈均一立方体结构，分散性良好，未见明显团聚现象，见图 1。

图 1.

普鲁士蓝纳米颗粒呈散在规则立方体结构  透射电子显微镜 ×100 000

Prussian blue nanoparticle exhibited a dispersed, regular cubic structure

2.2. ADSC存活率

培养24 h后，对照组、高糖组、低PBNP组、高PBNP组细胞存活率分别为（100.0±2.0）%、（61.3±2.4）%、（77.8±3.2）%、（94.2±1.1）%，组间总体比较，差异有统计学意义（F=170.90，P < 0.001）。与对照组相比，高糖组细胞存活率显著降低（P < 0.001）；与高糖组相比，低PBNP组、高PBNP组细胞存活率均显著升高（P < 0.001）；与低PBNP组相比，高PBNP组细胞存活率显著升高（P < 0.001）。

2.3. ADSC中衰老细胞占比

培养24 h后，对照组、高糖组、低PBNP组、高PBNP组细胞中衰老细胞占比分别为（39.0±1.2）%、（84.1±2.8）%、（60.2±3.0）%、（49.1±1.9）%，组间总体比较，差异有统计学意义（F=212.54，P < 0.001）。与对照组相比，高糖组细胞中衰老细胞占比显著升高（P < 0.001）；与高糖组相比，低PBNP组、高PBNP组细胞中衰老细胞占比均显著降低（P < 0.001）；与低PBNP组相比，高PBNP组细胞中衰老细胞占比显著降低（P=0.002）。见图 2。

图 2.

4组小鼠脂肪间充质干细胞培养24 h后衰老情况β-半乳糖苷酶×200。2A.对照组衰老细胞较少；2B.高糖组衰老细胞相较于图 2A明显增多；2C.低PBNP组衰老细胞较图 2B减少；2D.高PBNP组衰老细胞较图 2B明显减少

Senescence status of four groups of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells after 24 h of culture

注：对照组细胞常规培养，高糖组细胞加入终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖培养，低普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）组、高PBNP组细胞分别经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h后同高糖组处理；衰老细胞阳性染色呈蓝色

2.4. ADSC中p16与p21的蛋白表达水平

培养24 h后，4组细胞中p16和p21的蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（F值分别为25.07、13.00，P值分别为 < 0.001、0.002）。与对照组相比，高糖组细胞中p16和p21的蛋白表达水平均显著升高（P < 0.001）；与高糖组相比，低PBNP组细胞中p16和p21的蛋白表达水平显著降低（P值分别为0.003、0.017），高PBNP组细胞中p16和p21的蛋白表达水平显著降低（P值分别为 < 0.001、0.002）；低PBNP组和高PBNP组细胞中p16和p21的蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P值分别为0.665、0.832）。见图 3。

图 3.

蛋白质印迹法检测的4组小鼠脂肪间充质干细胞培养24 h后p16与p21的蛋白表达水平。3A.条带图；3B、3C.分别为p16、p21蛋白表达水平的条图（样本数为3，x±s）

Protein expression levels of p16 and p21 in 4 groups of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells detected by Western blotting after 24 h of culture

注：图 3A条带上方1~3、4~6、7~9、10~12及图 3B与3C横坐标中1、2、3、4分别为细胞常规培养的对照组、加入终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖培养的高糖组，以及分别经终质量浓度10、20 μg/mL普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）预处理12 h后同高糖组处理的低PBNP组、高PBNP组；与对照组比较，^aP < 0.05；与高糖组比较，^bP < 0.05

2.5. 创面愈合情况

伤后0~14 d，4组小鼠创面均逐渐愈合。伤后7 d，ADSC组小鼠剩余创面面积百分比显著低于对照组（P < 0.05）；伤后3、7、10、14 d，高PBNP组小鼠剩余创面面积百分比均显著低于ADSC组（P < 0.05）；伤后14 d，高PBNP组小鼠剩余创面面积百分比显著低于低PBNP组（P < 0.05）。见图 4、表 1。

图 4.

4组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。4A、4B、4C.分别为对照组伤后0（即刻）、7、14 d创面，逐渐愈合；4D、4E、4F.分别为ADSC组伤后0、7、14 d创面，逐渐愈合；4G、4H、4I.分别为低PBNP组伤后0、7、14 d创面，逐渐愈合；4J、4K、4L.分别为高PBNP组伤后0、7、14 d创面，图 4K剩余创面面积明显小于图 4E

The healing status of full-thickness skin defect wounds in 4 groups of diabetic mice at each time point after injury

注：对照组、脂肪间充质干细胞（ADSC）组、低普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）组、高PBNP组创面分别滴加生理盐水、含5×10⁶个ADSC（细胞数量后同）的生理盐水，以及含经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h的ADSC的生理盐水

表 1.

4组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点剩余创面面积百分比比较（%，x±s）

Comparison of the percentage of remaining wound area in the full-thickness skin defect wounds of 4 groups of diabetic mice at each time point after injury

组别	样本数	3 d	7 d	10 d	14 d
注：对照组、脂肪间充质干细胞（ADSC）组、低普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）组、高PBNP组创面分别滴加生理盐水、含5×106个ADSC（细胞数量后同）的生理盐水，以及含经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h的ADSC的生理盐水；时间因素主效应，F=1 987.72，P < 0.001；处理因素主效应，F=173.65，P < 0.001；二者交互作用，F=18.44，P < 0.001；F值、P值为4组间各时间点总体比较所得，P1值、P2值、P3值、P4值分别为对照组与ADSC组、ADSC组与低PBNP组、ADSC组与高PBNP组、低PBNP组与高PBNP组各时间点比较所得
对照组	3	88.7±3.2	77.3±3.2	60.7±1.5	32.7±3.2
ADSC组	3	85.0±2.0	62.7±3.1	46.7±3.8	19.3±2.1
低PBNP组	3	80.3±1.5	56.3±1.5	38.3±3.5	14.7±0.6
高PBNP组	3	75.3±3.1	46.7±2.5	24.0±5.2	8.0±1.0
F值		15.42	70.10	50.50	81.56
P值		0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
P1值		0.556	0.009	0.108	0.096
P2值		0.203	0.263	0.376	0.174
P3值		0.028	0.023	0.003	0.028
P4值		0.492	0.130	0.227	0.006

2.6. 创面组织中Ki67和VEGF的蛋白表达水平

伤后7 d，对照组、ADSC组、低PBNP组、高PBNP组小鼠创面组织中Ki67与VEGF的蛋白表达水平分别为5.5±0.9、12.4±1.2、17.7±1.0、24.8±1.3与3.2±0.7、7.8±1.0、11.1±0.8、15.0±2.4，组间总体比较，差异均有统计学意义（F值分别为167.55、38.90，P < 0.001）。与对照组相比，ADSC组小鼠创面组织中Ki67与VEGF的蛋白表达水平显著升高（P值分别为 < 0.001、0.016）；与ADSC组相比，高PBNP组、低PBNP组小鼠创面组织中Ki67的蛋白表达水平显著升高（P值分别为 < 0.001、0.002），高PBNP组小鼠创面组织中VEGF的蛋白表达水平显著升高（P=0.001）；低PBNP组与ADSC组小鼠创面组织中VEGF的蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P=0.111）；高PBNP组小鼠创面组织中Ki67的蛋白表达水平显著高于低PBNP组（P < 0.001），但该2组小鼠创面组织中VEGF的蛋白表达比较差异无统计学意义（P=0.056）。见图 5。

图 5.

4组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后7 d时细胞增殖标志物Ki67及血管内皮生长因子的蛋白表达Alexa Fluor 555-4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B、5C、5D.分别为对照组、ADSC组、低PBNP组、高PBNP组Ki67蛋白表达，依次逐渐增加；5E、5F、5G、5H.分别为对照组、ADSC组、低PBNP组、高PBNP组血管内皮生长因子蛋白表达，依次逐渐增加

Protein expressions of cell proliferation marker Ki67 and vascular endothelial growth factor in the full-thickness skin defect wounds of 4 groups of diabetic mice at post-injury day 7

注：对照组、脂肪间充质干细胞（ADSC）组、低普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）组、高PBNP组创面分别滴加生理盐水、含5×10⁶个ADSC（细胞数量后同）的生理盐水，以及含经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h的ADSC的生理盐水

2.7. 创面组织中胶原纤维合成情况

伤后14 d，对照组小鼠创面组织中胶原纤维排列紊乱、分布不均，可见明显过度沉积；ADSC组小鼠创面组织中胶原纤维排列及分布较对照组有所改善，但仍存在部分区域沉积增多；低PBNP组、高PBNP组小鼠创面组织中均可见胶原纤维排列有序、分布均匀，未见过度沉积。

2.8. 创面组织中炎症因子表达水平

伤后14 d，与对照组相比，ADSC组小鼠创面组织中IL-10的表达水平显著升高（P < 0.05），TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平均显著降低（P < 0.05）；与ADSC组相比，低PBNP组、高PBNP组小鼠创面组织中IL-10的表达水平均显著升高（P < 0.05），TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平均显著降低（P < 0.05）；与低PBNP组相比，高PBNP组创面组织中IL-10的表达水平显著升高（P < 0.05），TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平均显著降低（P < 0.05）。见表 2。

表 2.

4组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后14 d组织中炎症因子水平比较（pg/mL，x±s）

Comparison of inflammatory factor levels in full-thickness skin defect wounds of 4 groups of diabetic mice at post-injury day 14

组别	样本数	TNF-α	IL-1β	IL-6	IL-10
注：对照组、脂肪间充质干细胞（ADSC）组、低普鲁士蓝纳米颗粒（PBNP）组、高PBNP组创面分别滴加生理盐水、含5×106个ADSC（细胞数量后同）的生理盐水，以及含经终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h的ADSC的生理盐水；TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL为白细胞介素；F值、P值为4组间各指标总体比较所得，P1值、P2值、P3值、P4值分别为对照组与ADSC组、ADSC组与低PBNP组、ADSC组与高PBNP组、低PBNP组与高PBNP组各指标比较所得
对照组	3	84±7	111.5±3.5	118.7±7.5	29.9±6.5
ADSC组	3	61±4	83.6±4.2	77.2±7.8	56.8±3.0
低PBNP组	3	47±5	67.2±3.0	60.0±1.7	72.6±2.4
高PBNP组	3	27±4	43.5±3.8	42.1±2.8	90.2±4.5
F值		70.91	183.34	101.63	101.47
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
P1值		0.003	< 0.001	< 0.001	< 0.001
P2值		0.046	0.003	0.034	0.014
P3值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
P4值		0.007	< 0.001	0.027	0.007

3. 讨论

创面正常愈合过程需经历4个时期：止血期、炎症期、增殖期和重塑期^[12]，但当创面处于高糖环境时，常常难以愈合，进而转为慢性炎症^[13]。糖尿病创面不易愈合可能与促炎因子过度表达、氧化应激水平过高、细胞衰老等有关^{[14, 15]}。ADSC因其独特的生物学特性，在难愈性创面治疗中显示出巨大潜力，它们不仅能够通过自身多向分化潜能迁移至受损部位，分化为皮肤附属器表型，并用分化细胞重新修复受损皮肤；同时可以通过促进血管新生及血管网的形成、减轻创面炎症反应、促进上皮化等途径，加速糖尿病创面愈合^[16]。然而，在糖尿病患者中，高血糖促使细胞易发生氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤^{[17, 18]}，从而诱导创面部位细胞衰老^[19]，而创面衰老细胞的存在可能会加剧炎症并进一步抑制创面愈合^{[20, 21]}。有研究表明，高浓度葡萄糖通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路诱导间充质干细胞衰老，促进衰老相关分泌表型因子的释放，损害组织修复^[22]；另有研究表明，高浓度葡萄糖可以增强ADSC中p16、p21、p53和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mRNA的表达，从而诱导ADSC的早期衰老表型^[23]。这些研究强调了在糖尿病创面愈合的背景下，解决ADSC衰老的重要性。单独将ADSC运用于糖尿病创面，恐难以获得最佳效果，目前迫切需要寻找一种能增强ADSC应用效果同时又具有良好生物相容性的物质，来增强ADSC的临床应用能力。

PBNP由铁离子和六氰合铁（Ⅱ）酸根通过氰桥连接组装而成，具有可调的物理和化学性质、孔隙性、低密度以及良好的稳定性和生物相容性^[24]。PBNP由于自身结构中存在铁离子的多个价态而具有丰富的催化活性，如类过氧化氢酶、过氧化物酶和SOD等多种酶活性^[25]，使其在氧化应激相关疾病中具有潜在的应用价值。氧化应激会导致椎间盘中的ECM损伤和细胞凋亡，从而导致椎间盘退变，而PBNP可以通过稳定SOD1来抑制大鼠椎间盘退变的发展^[26]。Chen等^[27]制备的普鲁士蓝纳米杂交多细胞球体具有良好的抗氧化功能，运用于大鼠拔牙后牙槽创面，能有效减少氧化应激条件下的细胞凋亡，并促进骨组织修复。在糖尿病创面中，炎症、氧化应激和细菌感染是创面延迟愈合的主要原因，而PBNP能够有效清除活性氧从而减轻氧化应激。基于此，He等^[28]制备的PBNP和VEGF共载水凝胶不仅可以抑制炎症反应，还能促进血管生成，加速db/db小鼠的皮肤创面愈合。

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，这种衰老的特征表现为细胞周期抑制因子如p16和p21的上调、衰老相关β-半乳糖苷酶活性的增加，以及其他生物标志物如5-羟甲基胞嘧啶的表达变化，此外，蛋白激酶C-δ水平在衰老的ADSC中常常降低，进一步损害其功能^[29]。细胞衰老最显著的后果是衰老相关分泌表型的发展^[30]，衰老的ADSC分泌多种促炎性细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1等，以及抗血管生成因子IL-4、α2干扰素、干扰素诱导蛋白10、IL-1β、血小板因子4、二肽基肽酶Ⅳ和激活素A，这些因子不仅加剧局部炎症，还降解ECM，阻碍组织修复，导致糖尿病创面的愈合缓慢^{[31, 32, 33, 34]}。衰老ADSC分泌的促炎性细胞因子和基质降解酶，创造了一种不利于正常愈合过程的敌对微环境^{[35, 36, 37]}。

预实验显示，在5.5、10.0、20.0、30.0 mmol/L葡萄糖作用下，随着葡萄糖浓度的升高，ADSC的存活率呈梯度下降趋势，衰老细胞占比呈递增趋势，且p16、p21的蛋白表达同步上调，提示30 mmol/L葡萄糖可构建可靠的“高糖诱导ADSC衰老”模型，因此后续选用该浓度葡萄糖进行实验。

本研究的细胞实验部分明确了PBNP对高糖环境下ADSC的保护作用。与既往研究关注高糖诱导干细胞凋亡不同，本研究聚焦于细胞衰老这一更隐匿但同样关键的功能障碍。结果显示，30.0 mmol/L高糖处理24 h后，ADSC存活率显著下降，而衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞占比显著升高，关键衰老蛋白p16和p21表达亦显著上调，证实高糖可诱导ADSC进入衰老状态。与单纯高糖处理相比，给予终质量浓度10、20 μg/mL PBNP预处理12 h后，细胞存活率均显著升高，衰老细胞占比显著降低，p16和p21表达亦显著降低。这些数据表明，PBNP不仅能保护细胞活力，更能从表型和分子水平逆转高糖诱导的衰老进程。值得注意的是，高浓度PBNP效果显著优于低浓度PBNP，提示其抗衰老作用具有剂量依赖性。推测PBNP主要通过其类过氧化氢酶、SOD等多种酶活性，高效清除高糖诱导的过量活性氧，从而减轻氧化应激对ADSC的持续性损伤，延缓或阻断衰老进程。

在动物实验中，单独应用ADSC虽对糖尿病创面有一定疗效，但效果有限：伤后3、7、10、14 d，ADSC组小鼠剩余创面面积百分比均显著高于高PBNP组。这表明单纯移植ADSC难以在恶劣的高糖、高炎症微环境中充分发挥功能，而PBNP预处理显著增强了ADSC的修复能力。进一步机制探索表明，伤后7 d，高PBNP组创面组织中细胞增殖标志物Ki67和VEGF的蛋白表达水平均显著高于ADSC组，提示联合治疗显著促进了创面局部细胞增殖和新生血管形成。良好的血管网络是创面愈合的关键，VEGF的上调可能是创面加速闭合的重要原因之一。

炎症失调是糖尿病创面愈合障碍的另一核心问题。本研究中，伤后14 d，ADSC处理虽已在一定程度上降低糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平，并升高抗炎因子IL-10表达水平，但ADSC+高浓度PBNP处理表现出更显著的抗炎效果，即TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平进一步下降，IL-10表达水平进一步升高。此外，高PBNP组小鼠创面组织中胶原纤维排列有序、分布均匀，未见过度沉积，而对照组小鼠创面组织中胶原纤维呈现紊乱的过度沉积状态，这提示联合治疗不仅抑制了炎症，还促进了更加有序的组织重塑。综合来看，PBNP预处理可能通过减轻ADSC在移植后遭受的氧化应激和衰老，从而保护其旁分泌功能，使其能够更有效地调节创面免疫微环境、促进血管新生和基质重建。

本研究首次系统地将PBNP介导的ADSC“年轻化”与其在糖尿病创面中的增强疗效直接联系起来，提出了“干细胞年轻化”策略这一概念。本研究结果不仅验证了PBNP作为干细胞“赋能”工具的有效性，也为解决干细胞治疗中细胞存活率低、功能受损的临床瓶颈提供了新的思路。

本研究存在一定局限性。第一，使用小鼠来源的ADSC和ICR小鼠模型进行实验，其结论向人类糖尿病创面的转化价值尚需验证；第二，PBNP抑制ADSC衰老的具体分子通路，如是否涉及p53/p21或p16/Rb信号轴尚未深入探讨；第三，未对移植的ADSC在体内的归巢、存活及分化进行长期示踪。未来研究应聚焦于阐明PBNP抗衰老的核心信号通路，并在大动物模型或临床前研究中验证该联合治疗策略的安全性和有效性，同时探索PBNP与其他干细胞或生物材料的协同应用潜力。

Funding Statement

江苏省中医药科技发展计划项目（YB2020086）；扬州市卫生健康委科研专项资金资助项目（2023-2-18）

Jiangsu Provincial Science and Technology Development Program for Traditional Chinese Medicine (YB2020086); Project Supported by Special Scientific Research Fund of Yangzhou Health Commission (2023-2-18)