电针改善血管性痴呆大鼠认知障碍并抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路介导的星形胶质细胞活化

Abstract

Objective

To investigate the effects of electroacupuncture (EA) on cognitive function and neuroinflammation in a rat model of vascular dementia (VD) and the underlying mechanism.

Methods

Sixty male SD rats were randomly assigned to sham-operated group (n=10) and VD model group (n=50) receiving bilateral common carotid artery occlusion. Thirty rats with successful VD modeling were randomized into model group, EA group, and donepezil treatment group (n=10). EA treatment was administered at the acupoints Baihui (GV20) and Shenting (GV24) with a disperse-dense wave (2/15 Hz, 1 mA, 30 min/day), and donepezil was given by gavage at 0.45 mg/kg. Both interventions lasted 28 days. Cognitive function of the rats was assessed using Morris water maze test, and neuronal pathologies were observed using HE and Nissl staining. GFAP-labeled astrocyte activation was assessed by immunohistochemistry, and astrocytic ultrastructure was examined with transmission electron microscopy. GFAP/p-NF-κB colocalization was detected by immunofluorescence staining. Hippocampal IL-1β, IL-6, and TNF-α levels were measured by ELISA, and the protein expression levels of C3, S100A10, TLR4, and MyD88 and the p-NF-κB/NF‑κB ratio were detected by Western blotting.

Results

Compared with the sham-operated rats, VD rats showed significant cognitive impairment, obvious neuronal disorganization and pyknosis in the hippocampus, excessive astrocyte activation, increased GFAP/p-NF‑κB colocalization, inflammatory cytokine levels and expressions of C3 and TLR4/MyD88/NF-κB pathway proteins, and decreased expression of S100A10. Treatment with EA and donepezil significantly improved the performance of the rats in Morris water maze test, alleviated neuronal injury, inhibited astrocyte overactivation and ultrastructural damage, reduced inflammatory cytokine levels, expressions of C3, TLR4, and MyD88 proteins and the p-NF-κB/NF-κB ratio, and increased the expression of S100A10 in the hippocampus.

Conclusion

EA at GV20 and GV24 improves cognitive impairment and attenuate neuroinflammation in VD rats possibly by inhibiting TLR4/MyD88/NF-κB signaling and regulating astrocytic A1/A2-like phenotypic imbalance.

血管性痴呆（VD）是临床常见的痴呆类型之一，其发病例数位列第2，仅低于阿尔茨海默病。作为一类由脑血管疾病诱发的认知障碍综合征，其核心病理基础为脑区慢性灌注不足^［1］。该病的典型临床表现包括记忆缺陷、执行功能障碍、信息处理速度减慢，以及与中枢神经损伤相关的症状和体征^［2］。目前，全球受VD影响的人数已达2000万，且受人口老龄化等趋势影响，未来几十年这一数字将显著增长。鉴于其高发病率及对患者生活质量的严重影响，VD已成为医学领域亟需深入探究干预策略的重要课题^［3］。

星形胶质细胞作为中枢神经系统先天免疫的重要成员，在病理刺激下具备显著的表型可塑性，可极化为神经毒性的A1表型或神经保护性的A2表型。其中，补体成分3（C3）被公认为A1型星形胶质细胞的核心标志物，而S100钙结合蛋白A10（S100A10）则是A2型的特征性标志。在神经损伤或炎症状态下，Toll样受体4（TLR4）作为关键的模式识别受体，通过其下游适配蛋白髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）启动信号转导，最终激活核因子κB（NF-κB）并促进其核转位。进入细胞核的NF-κB能够特异性识别并结合C3基因启动子区的κB位点，从而强力驱动C3的转录与表达。而TLR4/MyD88/NF-κB信号轴正是调控星形胶质细胞向A1毒性表型转化的核心分子通路。该信号轴在调控星形胶质细胞极化对炎症相关疾病的病理进程中发挥关键调控作用^［4，5］。已有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在VD的病理发展过程中扮演关键角色，对疾病进展具有重要影响^［6］。另有研究证实，抑制该通路能显著减轻VD模型大鼠的神经炎症反应与认知缺陷^［7］，这提示靶向TLR4/MyD88/NF-κB通路可能是干预VD的潜在治疗策略。

针灸疗法具有多靶点干预、副作用少且无耐药性等显著优势。研究^{［8， 9］}证实，针灸可通过调控星形胶质细胞、细胞凋亡等途径，有效减轻大鼠的学习记忆障碍。然而，电针是否通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来影响星形胶质细胞极化，从而发挥神经保护作用，目前尚不完全明确。鉴于此，本研究拟建立VD大鼠模型，选用“百会”“神庭”穴进行电针干预，从行为学、超微结构及分子生物学角度，初步探讨电针对TLR4/MyD88/NF-κB通路及星形胶质细胞介导神经炎症的调节作用，为临床应用和后续机制验证提供实验依据。

1. 材料和方法

1.1. 实验动物及分组

60只2月龄SPF级雄性SD大鼠，体质量为200±20 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。所有大鼠饲养于SPF级实验动物房，环境温度在24±2 ℃，相对湿度在50%~60%，大鼠给予自由饮水及摄食。适应性喂养1周，将大鼠随机分为10只假手术组（Sham）和50只造模组，Sham组不实施结扎，仅操作双侧颈总动脉分离。造模组通过双侧颈总动脉结扎术（2-VO）制备VD模型，手术中死亡4只，术后死亡6只，排除Morris水迷宫测试失败的10只，最终剩30只，随机分为电针组（EA）、西药组（WM）与模型组（Model），10只/组。经安徽中医药大学动物伦理委员会审批通过（伦理批号：AHUCM-rats-2024138），实验过程中大鼠的抓取、日常饲养、造模操作及相关处置均严格遵照《关于善待实验动物的指导性意见》^［10］执行。

1.2. 主要试剂及仪器

主要试剂：苏木素染色液、伊红染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；尼氏染色液（上海碧云天生物技术股份有限公司）；5%BSA封闭液（北京索莱宝科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western及IP细胞裂解液、Western封闭液（上海碧云天生物技术股份有限公司）；HRP标记山羊抗兔IgG（Abcam）；Cy3/488标记荧光抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、C3抗体、S100A10抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；TLR4抗体、MyD88抗体、NF-κB抗体、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）抗体（Abmart）；β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

主要仪器：电针仪（6805-D，广州佳誉医疗器械有限公司）；一次性针灸针（0.30 mm×13 mm，苏州华佗医疗器械有限公司）；Vortex-Genie 2数字涡旋混合器（Scientific Industries）、水迷宫系统（Clever Sys Inc.）、Mini-PROTEAN Tetra电泳系统（Bio-Rad Laboratories）、Multiskan GO全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific）、钻石切片刀（Daitome）、透射电子显微镜（FEI）、高速离心机（Eppendorf）、倒置荧光显微镜及成像系统（Nikon）。

1.3. 造模方法

根据文献相关造模方式^{［11， 12］}，腹腔注射2%戊巴比妥钠（剂量35 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定，沿颈部正中线切开皮肤，再以钝性方式分离皮下组织与筋膜，暴露并分离双侧颈总动脉，去除动脉表面附着的神经与结缔组织后进行结扎处理，术后常规缝合切口并做好局部护理。造模操作完成3 d后，采用Morris水迷宫实验评估大鼠逃避潜伏期。若造模组大鼠的逃避潜伏期高于假手术组均值20%以上，则视为VD模型成功建立^［13］。

1.4. 干预方法

电针组：俯卧位固定大鼠，再依据《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》^［14］的标准进行穴位定位。实验选取“神庭”（GV24）与“百会”（GV20）作为主穴，对穴位区域皮肤常规消毒后，用针灸针向后斜刺，进针深度约3 mm。随后连接电针仪，将电极夹于针柄，给予2 Hz/15 Hz疏密波，电流强度设置为1 mA，持续刺激30 min。大鼠局部肌肉出现微颤、无挣扎嘶叫为宜。造模成功后开始干预，1次/d，连续28 d。西药组：参照前期研究结果^［15］，对该组大鼠采用盐酸多奈哌齐进行灌胃处理，给药剂量设定为0.45 mg/kg。其余2组大鼠只与其他组进行同等条件抓取固定。

1.5. 取材

行为学检测后，麻醉大鼠，每组随机取4只大鼠脑组织，用生理盐水、4%多聚甲醛固定24 h后石蜡包埋，该部分组织用于HE染色、尼氏染色及免疫荧光染色。每组剩余3只大鼠用生理盐水、多聚甲醛灌流、2.5%戊二醛固定，供透射电镜观察；其余3只大鼠，取海马置于-80 ℃冰箱备用，分别用于Western blotting检测与ELISA检测。

1.6. 观察指标及检测方法

1.6.1. Morris水迷宫检测

大鼠认知功能利用水迷宫实验评估，于取材前7 d开展定位航行实验。实验使用圆形水池，将其虚拟划分为4个等大的象限。将隐匿平台放置于第3象限中心，并使其没于水面下2 cm。设定游泳时间60 s；实验时将大鼠面向池壁沿1、2、4象限边缘放入水中，若60 s未找到平台，则引导其在平台停留15 s以形成记忆。在实验第6天给予休息，第7天进行定位航行试验，记录60 s内的游泳轨迹和逃避潜伏期。随后实施空间探索实验：撤去平台，将大鼠从第一象限入水，观察并记录其在60 s内的穿越平台次数及在目标象限的停留时长。

1.6.2. HE染色

制作4 μm厚度的切片，切片依次经烘烤、脱蜡、梯度脱水处理后，用苏木精染色10 min，再经盐酸乙醇分化15 s，随后用伊红复染2 min，后续依次完成脱水、透明操作，最后进行封片。扫描观察皮层及海马区病理形态变化。

1.6.3. 尼氏染色观察尼氏小体

脑组织石蜡包埋后切4 μm切片，经二甲苯和梯度乙醇（100%~75%）脱蜡。尼氏染色40 min，蒸馏水冲洗5 min，二甲苯透明后用中性树胶封片，在显微镜下观察尼氏小体状态。

1.6.4. 免疫组织化学法检测GFAP阳性表达

4 μm切片脱蜡水化后，进行柠檬酸100°C抗原修复20 min，PBS漂洗。后续依次加入封闭剂孵育、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）一抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司，1∶200），室温孵育1.5 h；PBS漂洗后加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗（Abcam，1∶200）及DAB显色液（避光3 min），苏木精复染1 min，脱水透明处理后封片。

1.6.5. 透射电子显微镜

取1 mm³大小的脑组织海马样本，于电镜固定液中保存过夜。之后，进行固定、分级乙醇系列脱水处理，随后进行组织渗透、包埋及超薄切片制备，切片经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，收集图像。

1.6.6. 免疫荧光染色检测GFAP和p-NF-κB双标

石蜡切片（4 μm）经脱蜡、水化及抗原修复后，滴加GFAP一抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司，1∶200）与磷酸化核因子κB（p-NF-κB）一抗（Abmart，1∶200），4 ℃冰箱孵育过夜。PBS洗涤后，避光孵育Cy3/488标记荧光二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，1∶200）1 h，DAPI复染，封片，采集图像。

1.6.7. ELISA法检测炎症因子IL-6、TNF-α与IL-1β水平

ELISA检测严格按照试剂盒操作说明进行。首先，将标准品梯度稀释并定容至500 μL。随后于反应孔中分别加入组织样本及生物素化工作液各100 μL，密封后于37 ℃孵育1 h。孵育结束后洗板，向每孔加入酶结合物工作液（由a液与b液按比例混合），继而加入100 μL显色底物溶液，避光反应15 min。终止反应后立即用酶标仪检测各孔A _{450 nm}。

1.6.8. Western blotting检测蛋白表达水平

称取20 mg 组织置于EP管内，加入200 µL裂解混合液（裂解液与PMSF按100∶1比例配制），依次开展组织剪碎、研磨、超声处理及裂解操作，后续经离心收集上清液后，对各组蛋白进行浓度配平，确保上样量一致。随后依次完成凝胶制备、电泳、转膜及封闭操作，再加入稀释后的一抗：C3抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，1∶1000）、S100A10抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司， 1∶2000）、TLR4抗体（Abmart，1∶1000）、MyD88抗体（Abmart，1∶1000）、NF-κB抗体（Abmart，1∶7500）、p-NF-κB抗体（Abmart，1∶1000）及β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，1∶10 000），将样本置于4 ℃环境孵育一抗过夜；次日孵育HRP标记山羊抗兔IgG二抗（Abcam，1∶5000）1 h，经显影处理后计算条带灰度值。

1.7. 统计学分析

本研究所有实验数据均采用SPSS 27.0统计学软件完成处理，所有实验独立重复至少3次，结果以均数±标准差呈现。对于符合正态分布的实验数据比较采用单因素方差分析，方差齐性时组间比较采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T₃法；实验数据不符合正态分布则用Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 电针对VD模型大鼠学习记忆水平的影响

Morris水迷宫定位航行实验显示，与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长（P<0.01）；在空间探索实验中，模型组平台穿越次数及目标象限停留时间明显减少（P<0.01），游泳轨迹杂乱无章。经电针或西药干预后，大鼠逃避潜伏期明显缩短，平台穿越次数和目标象限停留时间显著增加，游泳轨迹趋于清晰及指向性明确（P<0.01，图1）。

图1.

Morris水迷宫结果比较

Fig.1 Comparison of performance of the rats in Morris water maze test (Mean±SD, n=10). **P<0.01 vs Sham group; ^## P<0.01 vs Model group.

2.2. 电针对VD模型大鼠病理形态的影响

假手术组海马神经元结构完整、形态规则、排列紧密。模型组神经元排列显著松散紊乱，细胞间隙增宽，可见部分神经元胞体皱缩、核固缩深染及溶解坏死现象。与模型组相比，电针组和西药组神经元排列趋于整齐，细胞间隙缩小，核固缩等病理损伤程度显著减轻，正常形态神经元数量增多（图2）。

图2.

病理形态学比较

Fig.2 Comparison of pathomorphology of the hippocampal neurons of the rats (HE staining).

2.3. 电针对VD模型大鼠尼氏小体的影响

假手术组神经元胞质内尼氏小体丰富且排列紧密。模型组尼氏小体数量减少，排列松散紊乱，甚至出现溶解消失。经电针及西药干预后，尼氏小体排列恢复整齐有序，数量较模型组明显增加（图3）。

图3.

尼氏小体比较

Fig.3 Comparison of Nissl bodies in the hippocampus of the rats (Nissl staining, n=4).

2.4. 电针对VD模型大鼠GFAP阳性细胞的影响

假手术组仅见少量呈静息态的星形胶质细胞（GFAP阳性）。模型组GFAP阳性表达显著增强，细胞胞体肥大肿胀、突起粗短增多，呈典型异常激活状态，且在局部脑区可见密集聚集。与模型组相比，电针组和西药组GFAP阳性表达明显减少，星形胶质细胞胞体肿胀缓解，突起形态趋于纤细，过度激活状态得到显著抑制（图4）。

图4.

GFAP阳性表达比较

Fig.4 Comparison of GFAP expression in the hippocampus of the rats (Immunohistochemistry, n=4).

2.5. 电针对VD模型星形胶质细胞超微结构的影响

假手术组星形胶质细胞核膜完整，染色质分布均匀，细胞器结构正常。模型组星形胶质细胞超微结构损伤显著，表现为线粒体肿胀、嵴断裂或模糊，细胞骨架结构破坏，突起轮廓不清。电针组和西药组超微结构损伤明显减轻，仅见轻度线粒体形态改变，细胞骨架及中间丝结构相对完整，整体趋于好转（图5）。

图5.

各组大鼠星形胶质细胞超微结构比较

Fig.5 Ultrastructure of the astrocytes in the hippocampus of the rats (Transmission electron microscopy, A: original magnification: ×10 000; B: ×20 000).

2.6. 电针对VD模型大鼠GFAP与p-NF-κB共定位表达的影响

假手术组p-NF-κB荧光微弱。模型组可见GFAP（星形胶质细胞标记）与p-NF-κB共定位表达增强，且GFAP阳性细胞突起增粗，提示星形胶质细胞活化并伴随NF-κB通路激活。电针组与西药组GFAP与p-NF-κB的共定位荧光强度较模型组明显减弱（图6）。

图6.

GFAP与p-NF-κB共定位表达比较

Fig.6 Colocalization of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and phosphorylated nuclear factor-κB (p-NF-κB) in the hippocampus of the rats (Immunofluorescence staining).

2.7. 电针对VD模型大鼠神经炎症的影响

与假手术组相比，VD模型组海马组织中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量均升高（P<0.01）。给予电针或西药干预后，3种炎症因子的含量均较模型组回落（P<0.01，图7）。

图7.

IL-1β、IL-6和TNF-α含量比较

Fig.7 Levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the hippocampus of the rats (Mean±SD, n=3). **P<0.01 vs Sham group; ^## P<0.01 vs Model group.

2.8. 电针对VD模型大鼠C3、S100A10的影响

与假手术组相比，模型组C3蛋白表达水平比值上升（P<0.01）；与模型组相比，电针组和西药组指标均降低（P<0.05或P<0.01）。相反，与假手术组相比，模型组S100A10蛋白表达水平下降（P<0.01）；与模型组相比，电针组和西药组指标均上升（P<0.05或P<0.01，图8）。

图8.

C3、S100A10蛋白表达

Fig.8 Expression of C3 and S100A10 proteins in the hippocampus of the rats (Mean±SD, n=3). **P<0.01 vs Sham group; ^# P<0.05, ^## P<0.01 vs Model group.

2.9. 电针对VD模型大鼠TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB的影响

与假手术组相比，模型组TLR4、MyD88蛋白表达水平及p-NF-κB/NF-κB比值上升（P<0.01）。与模型组相比，电针组和西药组上述指标均降低（P<0.05，P<0.01，图9）。

图9.

TLR4、MyD88蛋白表达和p-NF-κB/NF-κB值比较

Fig.9 TLR4 and MyD88 protein expressions and the p-NF‑κB/NF‑κB ratio in the hippocampus of the rats (Mean±SD, n=3). **P<0.01 vs Sham group; ^# P<0.05, ^## P<0.01 vs Model group.

3. 讨论

VD以脑组织慢性缺血缺氧为病理基础，临床表现为进行性认知功能下降及社会适应能力减退，其核心机制涉及神经元因灌注不足而发生的退行性病变。这一病理机制与中医理论高度契合。中医认为“脑为髓之海”，脑的功能依赖于髓海的充盈与气血的濡养。VD的核心病机在于脑络瘀阻导致气血无法上荣，髓海渐空，神机失用。督脉为“阳脉之海”且“入络于脑”，对调节脑部气血至关重要。基于此，本研究选取督脉核心穴位“百会”与“神庭”作为干预核心：百会位于巅顶，善于升阳举陷、充养髓海，以改善脑部灌注不足；神庭为元神所居，长于宁神定志、调理气机，以恢复认知功能。二穴合用，一升一镇，共奏通督调神、益髓醒脑之效，精准契合了VD“髓海不足、神机失调”的病理本质。既往研究^{［16，17］}已证实，电针刺激该组穴位确能显著改善VD模型大鼠的空间学习记忆能力。与之一致的是，本研究Morris水迷宫实验结果显示，电针干预显著改善了VD大鼠的空间学习与记忆能力，使其逃避潜伏期缩短、平台穿越策略更具指向性。组织病理学进一步证实，电针有效减轻了因缺血导致的神经元核固缩、排列紊乱及细胞丢失，显著增加了尼氏小体。这些宏观行为学与微观组织学的同步改善，不仅验证了电针改善脑缺血后认知障碍的确切疗效，也证实了其对神经元结构完整性的保护作用。

神经炎症是VD病理进程中的关键环节，而星形胶质细胞的异常激活是神经炎症启动与放大的核心诱因，最终会通过炎症微环境损伤神经元^{［18，19］}。在VD病理状态下，星形胶质细胞会异常激活，表现为胞体肥大、突起增粗、特异性标志物GFAP表达升高，并常极化至具有神经毒性的A1表型。此表型的关键特征之一是激活NF-κB信号通路，推动IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子释放，同时表达补体成分C3等特异性标志物，而具有保护功能的A2表型标志物S100A10则受到抑制^{［20，21］}。既往研究^［22-24］虽已证实抑制胶质细胞活化可降低炎症水平、保护神经元，但较少深入探讨其对表型转化的调控作用。本研究的一个重要发现是，电针干预不仅降低了VD大鼠海马组织中炎症因子的水平，更显著下调了A1型标志物C3的表达，同时上调了A2型标志物S100A10的表达。这提示电针可能不仅减轻星形胶质细胞过度活化，还可能通过调节A1/A2样表型相关标志物的表达，改善VD大鼠海马区炎症微环境，从而为受损神经元提供相对有利的生存条件。

深入探讨其分子机制，本研究结果显示电针对TLR4/MyD88/NF-κB信号轴具有显著的负向调控作用。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是介导VD神经炎症与神经元损伤的核心信号轴^［25-27］。在缺血缺氧条件下，该通路被激活并形成“通路激活-炎症放大-神经损伤”的级联效应^［28-30］。本研究中，模型组大鼠海马TLR4、MyD88蛋白高表达，且免疫荧光双标显示GFAP与磷酸化NF-κB（p-NF-κB）共定位显著增强，证实了VD病理下星形胶质细胞内该通路可能存在过度激活。而电针干预显著抑制了TLR4、MyD88的表达及NF-κB的磷酸化水平，并减弱了GFAP与p-NF-κB的共定位信号。这一结果提示，TLR4/MyD88/NF-κB信号轴可能是电针调控星形胶质细胞异常活化及炎症反应的重要相关通路。

此外，本研究仍存在一定局限性。现有结果主要从相关蛋白表达及星形胶质细胞活化状态等方面提示电针可能调控TLR4/MyD88/NF-κB通路，但尚需进一步从因果关系和细胞特异性层面加以验证。后续研究将开展TLR4激动剂或抑制剂干预实验，并结合星形胶质细胞特异性TLR4干预模型，进一步阐明电针调控神经炎症、改善VD认知障碍的作用机制。

综上所述，本研究结果提示，电针督脉“百会”“神庭”穴可改善VD大鼠学习记忆能力，减轻海马神经元病理损伤及神经炎症反应。其作用机制可能与下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化、抑制星形胶质细胞异常激活、减少促炎因子释放及改善海马免疫微环境有关。上述发现为中医“通督调神”针法治疗血管性痴呆提供了一定的实验依据。

基金资助

国家中医药管理局青年岐黄学者支持项目（国中医药人教函〔2022〕256号），第九批安徽省特支计划人才项目（皖组办字〔2023〕35号），安徽高校自然科学重点研究项目（KJ2021A0549）