基于动态杨氏模量的细胞电穿孔与电形变耦合特性：膜厚度的影响

Abstract

To investigate the effect of membrane thickness on the coupled electroporation–electrodeformation response of the cell membrane, a coupled model incorporating a dynamic Young’s modulus was developed to simulate transmembrane voltage, spatiotemporal pore evolution, and cell deformation at different membrane thicknesses. As membrane thickness increased from 6 to 10 nm, both the transmembrane voltage and pore radius peaked earlier. At 50 ns, pore density at the cell poles increased by 19.78%–67.44%, total electroporated area by 257.48%–859.36%, and the reduction in Young’s modulus became more pronounced. Despite increased membrane softening, peak Maxwell stress decreased by 26.15%–63.28% and remained the dominant factor, reducing peak displacement at the cell poles by 12.35%–34.75%. These findings show that membrane thickness modulates the coupled response by jointly affecting electrically induced pore formation, membrane mechanical properties, and Maxwell stress. The model provides a theoretical basis for designing pulse parameters for cells with different membrane structural characteristics.

0. 引言

电穿孔是指在外加电场作用下细胞膜脂质双层发生结构重排，进而形成亲水性微孔的现象^[1]。该技术已广泛应用于肿瘤消融^[2]、药物递送^[3]以及基因转染^[4]等方向。由于微孔尺度小、寿命短，直接观测困难^[5]，现有研究多借助膜电导率^[6]或分子摄取^[7]等间接表征，尚难完整解析其瞬态生物物理机制。

为克服实验上的观测局限，数值模拟成为观测电穿孔动力学的重要手段。常用的无厚度膜边界虽可降低计算量^[8-10]，然而这种简化忽略了膜厚度对电穿孔动力学的关键调节作用。分子动力学模拟分析指出，磷脂和胆固醇组成可通过改变膜厚度及界面氢键影响细胞膜平均穿孔时间、阈值电场和跨膜通量^[11-12]。有限元研究进一步证实，膜厚度影响跨膜电压^[13]，实体膜模型也比简化边界更能准确预测孔隙分布^[14]；但膜厚数值变化对孔隙动力学及穿孔后力学反馈的作用仍缺少系统定量研究。

脉冲电场在改变细胞膜通透性的同时，还会引起细胞电形变^[15-16]，使细胞形态及膜厚度等几何特征随电场作用发生动态变化^[17]。在数值模拟中，将细胞膜和细胞质视为多孔黏弹性介质，可以表征其滞回、蠕变等力学特性，并有助于提高电穿孔与细胞形变耦合仿真的准确性^[18-20]。与此同时，电穿孔形成的孔隙会增大细胞膜的孔隙率，导致膜的杨氏模量降低；膜力学性能的变化又会进一步影响细胞形变，从而使孔隙演化、膜软化与电形变相互关联^[21]。然而，现有研究多侧重于其中某一过程，对膜厚度变化、孔隙演化、杨氏模量变化及电形变之间耦合关系的系统研究仍较少。

本研究在实体膜有限元框架下耦合渐进电穿孔、多孔黏弹性电形变与达西渗流模型，并将孔隙率变化反馈至膜杨氏模量。在统一脉冲条件下比较不同膜厚的跨膜电压、孔隙特性、麦克斯韦应力张量（Maxwell stress tensor，MST）、动态杨氏模量和位移，阐明膜厚对电穿孔—电形变耦合过程的影响。

1. 方法

本研究以膜厚为关键变量，构建电学—孔隙—力学闭环耦合模型：实体膜模型求解跨膜充电，渐进电穿孔模型描述孔密度与孔半径演化，局部孔隙率用于实时更新膜的杨氏模量和渗透特性，MST作为外部载荷驱动多孔黏弹性膜形变。借助该耦合链路，可在统一脉冲条件下比较不同膜厚度对应的电穿孔和力学形变响应。

1.1. 细胞模型

本研究在COMSOL 6.2中建立二维轴对称实体膜模型（见图1a）。计算域尺寸为25 μm × 50 μm，膜内侧为细胞质，膜外侧为周围溶液。边界条件为：顶部施加电势，底部接地，左侧为旋转轴，右侧为电绝缘。脉冲自5 ns开始，持续40 ns，上升时间和下降时间均为0.9 ns，场强为14 kV/cm。A、O和C分别表示细胞极点、中心和赤道点，OA/OC用于表征细胞纵横比。

图 1.

Cell geometric model and pulse parameters

细胞几何模型与脉冲参数

a. 二维轴对称细胞几何模型及边界条件，膜厚度为便于观察作放大显示，A、O和C分别表示细胞极点、细胞中心和细胞赤道点；b. 施加的纳秒脉冲波形

a. two-dimensional axisymmetric cell model and boundary conditions, with the membrane thickness enlarged for clarity; A, O, and C denote the cell pole, center, and equatorial point, respectively; b. applied nanosecond pulse waveform

1.2. 电穿孔的渐进模型

细胞内外电势由拉普拉斯方程求解。电穿孔过程中，孔隙密度的演化采用Smoluchowski渐近方程描述^[22]：

1

式中，V_m为跨膜电压，定义为膜内、外表面的电势差；N(t)为孔隙密度。根据孔隙密度可进一步计算细胞膜电导率：

2

式中，为孔隙内溶液的电导率，K为跨膜电压的函数。参数K的具体计算方法，以及二阶Debye色散模型中介电常数的计算，均见文献[19]。

电穿孔形成后，亲水性微孔半径随时间的演化由下式描述^[23]：

3

式中，为膜的有效张力系数，k_p为孔隙总数；有效张力系数由下式计算：

4

式中，A为细胞膜表面积，为细胞膜总穿孔面积，其计算式为：

5

1.3. 多孔黏弹性电形变模型

由电场产生的MST按照式(6)计算，并作为电形变模型的外部载荷^{[19, 24]}：

6

式中，i、j可取r或z方向分量；为克罗内克函数， \varepsilon 为介电常数。

在求解过程中，细胞膜在外部应力作用下的变形满足动量平衡方程；细胞膜和细胞质的黏弹性行为均采用Maxwell模型描述，其本构关系为：

7

8

式中 f(t) 和 ε (t) 分别为总应力和总应变；为剪切模量函数。G₀为弹性分支的剪切模量，G₁为附加分支的剪切模量，为该分支的松弛时间，即黏度与剪切模量之比。

电穿孔过程中生成的大量孔隙会提高细胞膜孔隙率，并使其力学性质随之发生变化。为表征这一反馈，本研究将细胞膜视为多孔材料，并根据孔隙率计算其动态杨氏模量^[25]：

9

式中，为多孔材料的杨氏模量，为同种无孔材料的杨氏模量，P为孔隙率；系数a为泊松比的函数，其计算方法见文献[25]。

本研究将细胞膜和细胞质视为黏弹性介质，并在细胞质域耦合固体力学场与达西渗流场：固体力学场作用于细胞膜和细胞质域，用于描述二者的黏弹性变形；达西渗流场作用于细胞外液和细胞质域，用于表征压力梯度驱动的流体运动。具体而言，细胞外液和细胞质均按达西多孔介质处理，其孔隙率和渗透率设为常数。高压电脉冲使细胞膜形成大量水性微孔，改变膜的局部孔隙结构。因此，细胞膜任一位置的动态孔隙率P由该处微孔分布密度与单孔截面积的乘积确定，并随电穿孔过程动态变化［见式(10)］，进而用于更新膜的杨氏模量，将电穿孔过程反馈至膜的力学响应。细胞外液和细胞质域内流速与压力梯度之间的线性关系由式(11)所示的达西定律描述。

10

11

式中，k_n为多孔介质的渗透率，其值与穿孔后细胞膜的孔隙率有关； μ 为流体的动力黏度；p_n为以外部大气压为参考的相对流体压力；为流体在多孔介质中的流动速度。

2. 结果

2.1. 模型的参数与验证

本研究所采用的具体仿真参数详见附件1。为初步验证模型准确性，采用文献[21]的4 nm膜厚及相同脉冲条件进行验证，结果表明阳极点跨膜电压、孔隙半径、杨氏模量和总孔数的变化趋势与文献[21]的报道一致，最大相对误差在8%以内（具体对比结果参见附件2第1节）。

此外，为深入评估引入“动态杨氏模量”对电穿孔过程的具体影响，本研究将动态杨氏模量模型与定常杨氏模量模型^[19]进行了系统对比。结果表明，两者在穿孔初期的变化趋势相近；进入主要穿孔阶段后，动态模型的跨膜电压和孔隙半径较低，而孔隙密度较高，杨氏模量随孔隙形成而下降并在孔隙恢复阶段回升（具体对比结果参见附件2第2节）。这一趋势与穿孔后细胞力恢复^[26]、软细胞分子摄取增加^[27]的实验表征相符。

目前，关于细胞电穿孔的实验研究多依赖间接方法来评估细胞膜的通透性^[28]，例如，通过定量检测细胞对荧光染料的摄取通量，进而反演推算细胞膜的有效穿孔面积^[29]。然而，这种微观跨膜物质传输过程涉及复杂的动态演变，在数值仿真中精确重现该过程面临较大的计算挑战与不确定性。相比之下，细胞在特定电场驱动下产生的电形变行为（即纵横比的动态变化）则提供了更为直观且易于量化的实验观测数据。因此，为充分验证本文所建模型的有效性，本研究提取了文献[30]中的核心实验参数，并在同等条件下开展了数值模拟。定量对比分析显示，本模型仿真输出的细胞纵横比演变趋势与实验数据高度吻合，从而进一步证实了该理论模型的准确性与可靠性（具体对比结果参见附件3）。

上述对比表明，动态杨氏模量有助于同时表征穿孔后的膜软化与电形变响应，支持模型用于后续膜厚效应分析。

2.2. 膜厚度对跨膜电压与孔密度的影响

图2a显示了不同膜厚下细胞膜极点处跨膜电压的时变特征。各曲线均先快速升高，达到峰值后逐渐下降。膜厚由6 nm增加至10 nm时，跨膜电压峰值的出现时间由43 ns依次提前至28 ns。28 ns之前，较厚细胞膜对应的跨膜电压总体较高；28～43 ns内，各膜厚曲线依次达到峰值并相互交叉；43 ns之后，较厚细胞膜对应的跨膜电压低于较薄细胞膜。

图 2.

Effects of membrane thickness on electrical responses at the cell membrane pole

膜厚度对细胞膜极点处电学响应的影响

a. 跨膜电压；b. 孔密度

a. transmembrane voltage; b. pore density

图2b揭示了膜厚度对细胞膜极点处孔隙密度演化的影响。膜厚增加使孔隙更早形成并更快进入平台期。更为关键的是，膜厚度不仅改变了孔隙形成的速度，更提升了孔隙的密度。50 ns时，以6 nm膜的孔密度为基准（6.301 × 10¹⁵ m⁻²），7～10 nm膜的极点孔密度提高19.78%、35.76%、51.67%、67.44%，表明膜厚增加可缩短成孔时间并提高孔隙密度。

2.3. 膜厚度对微孔特性的影响

图3展示了不同膜厚条件下细胞膜极点处孔隙半径随时间的演化。约20 ns前，各曲线基本重合，孔隙半径保持在初始水平；随后孔隙开始快速扩张，并在达到峰值后趋于稳定或略有下降。尽管不同膜厚对应的峰值半径较为接近，但峰值出现时间存在明显差异：膜厚由6 nm增至10 nm时，峰值时间由约90 ns依次提前至约61 ns。在20～52 ns的扩张阶段，相同时间下膜厚越大，孔隙半径越大，曲线上升也越快。进入52～68 ns后，较厚膜的孔隙扩张率先减缓并接近峰值，而较薄膜的孔隙仍持续增大，各曲线因而逐渐交叉。68 ns后，孔隙半径的排列顺序发生反转，整体表现为膜厚越大，孔隙半径越小。

图 3.

Temporal evolution of pore radius at the cell membrane pole for different membrane thicknesses

不同膜厚度下细胞膜极点孔半径的时间演化

图4a显示了膜穿孔总面积随时间的演化曲线。膜厚增加使总穿孔面积增大且快速增长时刻提前。以50 ns时刻为例，7～10 nm膜的总穿孔面积较6 nm膜分别增加了257.48%、481.13%、679.53%和859.36%。

图 4.

Time-dependent evolution of overall cellular micropore characteristics under various membrane thicknesses

不同膜厚度下细胞整体微孔特性的时间演化

a. 电穿孔面积；b. 孔隙总数量

a. total electroporated area; b. total pore number

图4b展示了细胞整体孔隙数量随时间的变化趋势，该数值通过对细胞膜孔密度进行空间积分计算得出。结果显示，膜厚度的增加同样会提升孔隙总数。在50 ns时，7～10 nm膜的总孔数较6 nm膜分别增加248.20%、456.25%、637.05%和798.93%。

2.4. 膜厚度对细胞形变的影响

为了探究膜厚度对细胞膜机械特性的影响，本研究设定不同厚度的细胞膜具有相同的初始杨氏模量。图5a展示了不同膜厚下细胞膜极点处MST随时间的演化。膜厚增加使极点MST峰值提前出现并降低峰值幅值：当膜厚为6 nm时，MST在43 ns达到峰值；随着膜厚在7～10 nm范围内依次增加，峰值出现时间分别提前至37、33、30和28 ns。同时，较6 nm膜厚而言，7～10 nm膜的MST峰值幅值分别降低了26.15%、43.04%、54.60%和63.28%。此外，同一时刻的MST数值亦随膜厚的增加而减小。

图 5.

Mechanical responses at the cell membrane pole for different membrane thicknesses

不同膜厚度下细胞膜极点的力学响应

a. 麦克斯韦应力张量；b. 杨氏模量；c. 位移

a. Maxwell stress tensor; b. Young’s modulus; c. displacement

图5b展示了细胞膜极点处杨氏模量随时间的变化。电穿孔发生后，该处杨氏模量迅速下降，随后随孔隙恢复略有回升；同时，膜厚越大，杨氏模量的降幅越大，细胞膜软化越明显。以50 ns时为例，膜厚为6 nm时，杨氏模量为1054 Pa；膜厚在7～10 nm范围内以1 nm的步长递增时，杨氏模量较6 nm膜厚时分别下降0.98%、1.75%、2.47%、3.17%。

图5c展示了不同膜厚下细胞膜极点处位移随时间的变化。随着膜厚增加，负向位移极值的出现时刻逐步提前，其绝对值则逐渐减小。膜厚为6 nm时，位移绝对值在45 ns达到9.27 μm；膜厚为7、8、9和10 nm时，极值时刻分别提前至39、36、33和31 ns，最大位移绝对值较6 nm膜分别降低12.35%、20.98%、28.83%和34.75%。

3. 讨论

现阶段模型多独立探讨电穿孔或电形变现象，对二者的动态耦合及膜厚度的调控作用关注不足。例如，基于Schwan方程模型的研究主要关注膜厚对电场分布的影响^{[13, 31]}；而基于Smoluchowski渐近方程模型的研究则侧重孔密度演化，但在阐明膜厚度波动对电穿孔电形变耦合机制的具体贡献方面仍有探索空间^{[19, 21]}。本模型在以动态杨氏模量衔接孔隙演化与力学响应的统一框架下分析跨膜充电、成孔、膜刚度变化与形变，为解释这些过程的动态关联提供了补充。

如图2a所示，膜厚增加使细胞膜的穿孔起始时刻提前，与黄康^[13]的研究结论一致。从物理机制层面分析，细胞膜可视为电容器^[32]，膜厚增加相当于增大电容器极板间距，使膜电容和充电时间常数减小，进而使跨膜电压在脉冲初期上升更快并更早达到电穿孔阈值。这不仅使穿孔提前，还延长了纳秒脉冲期间的有效成孔时间，与膜厚影响平均穿孔时间的报道一致^[11]。有效成孔时间延长促进了孔隙累积，而跨膜电压的快速响应使孔密度更早达到饱和，从而解释了图2b中膜厚与孔密度的正相关关系。分子动力学模拟也表明，膜厚增加引起的孔密度升高是跨膜物质通量增大的主要原因^[12]。

细胞膜孔隙半径主要受跨膜电压调控^{[16, 33]}。脉冲初期，膜厚度的增加提升了瞬时跨膜电压，致使图3中孔隙半径随膜厚度增加而扩大。随着不同厚度模型的跨膜电压相继达到峰值，孔隙半径的变化曲线呈现出复杂的动态交织特征。而在脉冲后期，由于较厚的膜具有更快的充放电速率，同时较厚的膜也更早开始放电，因此其跨膜电压随膜厚度增加而迅速衰减，从而导致图3中膜越厚、孔隙半径下降越快的现象。为进一步考察膜厚效应在全细胞尺度上的表现，图4对细胞的总穿孔面积与总孔数进行了统计。结果显示，二者均随膜厚增加而上升，说明孔密度的升高并非仅由大孔分散为多个小孔所致。由此可见，膜厚度的影响并不局限于极化区域，而是作用于整个细胞膜。

根据MST计算式(6)可知，MST的强度主要取决于膜内电场强度^{[19, 24, 34]}。如图5a所示，膜厚增加使跨膜电压和MST峰值的出现时刻提前，同时削弱膜内电场，导致MST峰值降低。在力学特性方面，图5b表明孔隙增多会降低膜的杨氏模量^[25]；且膜越厚，软化程度越显著，说明在本模型参数范围内，穿孔面积扩大的软化效应占主导。因此，膜厚增加一方面通过减弱MST降低电驱动力，另一方面通过降低膜刚度增强其变形能力。为考察二者共同作用下的形变响应，本研究进一步分析了细胞膜极点处的位移。

如图5c所示，随着膜厚增加，位移峰值的出现时刻提前且峰值绝对值减小，表明膜厚会影响细胞膜的动态响应速率和形变幅度。这与不同组分囊泡膜因厚度差异而呈现不同响应特性的实验结果一致^[35-36]。总体而言，随着膜厚度增加，细胞膜的杨氏模量和MST均有所下降。MST作为电形变的直接驱动力，决定了施加于细胞膜的电载荷水平^[34]，而杨氏模量降低主要通过减小变形阻力间接促进形变。在此基础上，MST的相对降幅又大于杨氏模量，进一步强化了电驱动力减弱的主导作用。因此，膜软化产生的促变形效应不足以抵消MST降低的抑制作用，最终表现为最大形变量随膜厚增加而减小。脉冲结束后，细胞膜围绕平衡位置呈阻尼振荡，且较厚的膜其振荡衰减时间更长，这可能与其穿孔后杨氏模量降幅更大有关^[37-38]。

4. 结论

本文构建了一种考虑细胞膜杨氏模量动态变化的电穿孔—电形变耦合模型，并系统研究了膜厚度对电穿孔行为及力学响应的影响。仿真结果表明，随着膜厚度增加，电穿孔起始时刻提前，平均电穿孔持续时间延长，孔密度增大，总穿孔面积和微孔半径也随之发生变化。电穿孔引起的局部孔隙率变化进一步降低膜的杨氏模量，导致细胞膜软化；与此同时，膜厚度增加还会使MST峰值下降，并且细胞整体的电形变响应主要受MST支配，最终表现为最大位移随膜厚度增加而减小。

在实际的临床病理环境中，肿瘤细胞的恶性演进过程往往伴随着细胞形态、膜厚度及其杨氏模量的异质性变化^[39]。本研究构建的耦合模型定量分析了膜厚度对跨膜充电、穿孔起始时间及孔隙演化的影响，并通过动态杨氏模量表征成孔引起的膜软化及其对电形变的反馈。上述结果可为具有不同膜厚和力学特性的细胞优化纳秒脉冲参数提供理论参考，但尚不足以证明该方法对肿瘤细胞具有选择性或能够改善治疗效果。此外，本研究通过引入动态杨氏模量，深入阐释了纳秒脉冲电场作用下细胞膜软化以及MST的影响机制。这为进一步探究和理解高频电穿孔诱发细胞剧烈形变，乃至导致细胞不可逆机械性坏死的微观生物力学过程^[40-41]提供了建模基础。

本模型与既有仿真结果^{[19, 21]}及宏观实验数据^[30]在总体变化趋势上相符，但膜厚效应仍缺少直接微观实验的定量验证，且尚未考虑电穿孔后跨膜离子输运引起的局部电导率动态变化。后续研究将致力于耦合这种流体-电学的动态反馈机制，并寻求更精细的微观实验验证方案，从而进一步提升该模型的预测精度与适用范围。

Funding Statement

国家自然科学基金（62201544）；中国博士后科学基金（2020M671917）