E3泛素连接酶KLHL8通过泛素-蛋白酶体途径降解HBx蛋白并抑制HBV cccDNA转录

Abstract

Objective To screen for host factors involved in the degradation of hepatitis B virus X protein (HBx) and to investigate whether they affect hepatitis B virus (HBV) replication by modulating HBx stability. Methods HuProt™ human proteome microarrays were used to screen for HBx‑interacting proteins, combined with bioinformatics analysis focusing on E3 ligases within the ubiquitin‑proteasome system. The effects of candidate proteins on HBx stability were validated by western blotting, HiBiT activity assays, cycloheximide chase assays, and proteasome inhibitor treatment. In an HBV infection model, quantitative PCR, enzyme-linked immunosorbent assay, chromatin immunoprecipitation, and micrococcal nuclease assays were employed to assess the effects of the E3 ligase on the transcriptional activity of covalently closed circular DNA (cccDNA), viral replication, and epigenetic status. Intergroup comparisons were performed using one-way ANOVA, Student's t-test, or the non-parametric Mann-Whitney U test as appropriate. Results A total of 290 HBx-interacting candidate proteins were identified. Among them, the ubiquitin-proteasome system-related proteins Kelch-like protein 8 (KLHL8) and the canonical HECT-type E3 ligase WWP2 significantly reduced HBx protein levels and, more notably, suppressed cccDNA-mediated viral transcription. Cycloheximide chase assays demonstrated that KLHL8 overexpression markedly shortened the half-life of HBx, and this effect was reversed by a 26S proteasome inhibitor, whereas WWP2 had a comparatively limited effect on the degradation rate of HBx. Functional experiments showed that KLHL8 overexpression inhibited cccDNA transcriptional activity and viral replication, reduced HBx binding to cccDNA, and decreased chromatin accessibility. Conclusion The E3 ubiquitin ligase KLHL8 degrades HBx through the ubiquitin-proteasome pathway, thereby inhibiting HBV cccDNA transcription and replication. These findings provide a theoretical basis for novel anti-HBV strategies targeting the host ubiquitination machinery.

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种小的包膜DNA病毒，其基因组为长约3.2 kb的部分双链、松弛环状DNA（relaxed-circular DNA，rcDNA）^［1-4］。HBV感染宿主肝细胞后，rcDNA被运输至细胞核修复形成具有超螺旋结构的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）^［5-7］。cccDNA作为HBV所有病毒转录本的模板，以结构稳定的微染色体形式持续存在于肝细胞核内，并可通过新一轮感染以及细胞内扩增途径补充，因此被认为是HBV持续感染的最主要原因^［8-10］。HBV cccDNA转录过程可受宿主因子、病毒蛋白以及表观遗传修饰等多因素调控。其中乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）作为HBV编码的一种多功能调节因子，通过多维度机制动态直接或间接调节cccDNA微染色体的转录活性^［11］。在直接调控层面，HBx结合cccDNA，并通过募集多种染色质修饰复合物重塑其表观遗传景观，例如招募p300/CBP组蛋白乙酰转移酶复合物以促进转录^［12］，并阻止抑制性因子沉默信息调节因子1和组蛋白去乙酰化酶1的募集^［13-16］。在间接调控层面，HBx可介导限制性宿主因子的降解，例如劫持特异性DNA结合蛋白1-E3泛素连接酶复合物降解Smc5/6和WD重复结构域77，从而解除其对cccDNA转录的抑制^［17-18］。鉴于HBx维持cccDNA转录活性和HBV持续感染所必需的病毒调控蛋白，靶向其功能已成为开发新型抗病毒策略的关键方向^［19］。

已有研究证实，宿主的泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）在HBV复制以及肝癌发病中发挥重要作用^［19-20］。UPS主要由泛素激活酶E1、泛素偶联酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其底物蛋白组成。在蛋白质的泛素化降解过程中，泛素首先以ATP依赖的方式被E1酶激活，活化的泛素从E1转移到E2，E3酶负责特异性识别底物，并将泛素从E2转移至底物蛋白的赖氨酸残基上，形成多聚泛素链，进而引导底物被蛋白酶体识别并降解^［21-23］。其中，E3泛素连接酶是决定底物特异性的关键因子，在调控蛋白稳定性及功能中扮演核心角色。现有研究表明，HBx降解主要依赖于泛素-蛋白酶体系统^［24］。在蛋白酶体抑制剂MG132或lactacystin存在时，HBx蛋白的半衰期可显著延长，同时其多泛素化水平升高，这些结果共同表明HBx是UPS降解的典型靶蛋白^［19-20］。在此过程中，E3泛素连接酶Siah-1已被证实通过介导HBx的多聚泛素化，靶向其至26S蛋白酶体降解，从而抑制HBx的转录激活功能及致癌活性^［25］。尽管如此，目前对HBx泛素化降解机制的认识仍不完全，其中关键的E3泛素连接酶尚未被完全发掘。除Siah-1外，可能还存在其他关键的E3泛素连接酶参与调控，仍需进一步探究。因此，深入揭示HBx蛋白降解的依赖路径、鉴定其中关键的宿主因子，可为发展以HBx降解为策略的新型抗HBV疗法提供重要的理论依据和潜在靶点^［26］。

材料与方法

1.细胞培养：Huh-7细胞系购自日本健康科学研究院资源库。HepAD38细胞来源于美国典型培养物保藏中心。HepG2-NTCP稳定细胞系为本实验室构建。Huh-7、HepAD38、HepG2-NTCP细胞培养于含10%胎牛血清（美国HyClone公司）、100 IU/mL青霉素（美国HyClone公司）和100 mg/L链霉素（美国HyClone公司）的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）（美国Sigma公司）中。

2.质粒、引物和抗体：本研究通过pcDNA3.1-3xFlag-C真核表达载体，构建了分别携带人源泛素结合酶E2F（UBE2F，NM_080678）、泛素结合酶E2A（UBE2A，NM_003336）、F-box/WD重复域蛋白11（FBXW11，NM_012300）、Kelch样蛋白8（KLHL8，NM_020803）、泛素特异性肽酶25（USP25，NM_001283041）和WW结构域E3泛素连接酶2（WWP2，NM_007014）基因的系列质粒，所有质粒均由优宝生物提供。HIBiT-HBx质粒由本实验构建保存。研究使用的所有siRNA由北京擎科生物科技股份有限公司提供。鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（#97166）、鼠抗UBB单克隆抗体（#3936）、山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G抗体（#91196）、山羊抗兔IgG抗体（#98164）购自美国Cell Signaling Technology公司。兔抗Flag多克隆抗体（#AE092）购自美国Abclonal公司。

3.细胞转染：取对数生长期的细胞接种于12孔板中，待细胞汇合度达到70%～80%时进行转染。每孔加入1.25 μg质粒DNA或2.5 μg siRNA。配制转染体系时，首先将DNA与62.5 μL Gibco Opti-MEM™减血清培养基（美国赛默飞世尔科技公司）混匀，同时另取一管将1.875 μL Lipofectamine™3000转染试剂（美国赛默飞世尔科技公司）与62.5 μL Opti-MEM减血清培养基混匀。室温下静置5 min后，将两管液体混合，继续静置15～20 min形成脂质体-DNA复合物。随后将复合物滴加至对应孔中，轻晃培养板使其分布均匀。转染4～6 h后，更换为完全培养基。后续实验于转染后24～48 h收集细胞样本进行检测。

4.HBx蛋白的原核表达与纯化：将HBx基因克隆至pET32a载体，使其与硫氧还蛋白（TrxA）及His标签融合表达。将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，使用0.5 mmol异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于16 ℃下诱导表达18 h。收集菌体后，用裂解缓冲液（1×磷酸盐缓冲液、5 mmol/L咪唑、0.5% Triton X-100、1 mmol/L苯甲基磺酰氟）重悬。经超声破碎与离心后，收集含有包涵体的沉淀，并用裂解缓冲液洗涤。随后，将沉淀与20 mL 8 mol/L尿素在4 ℃下轻柔振荡孵育2 h，使其充分溶解。收集上清液，并采取梯度稀释法进行复性：每隔30 min加入5 mL磷酸盐缓冲液，直至总体积达到80 mL，使尿素浓度缓慢降低，以促进蛋白质正确折叠。最后，按照制造商说明书，使用HisPur™ Ni-NTA纯化试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）对带有TrxA和His标签的HBx蛋白进行纯化。纯化后的蛋白于-80 ℃保存。

5.蛋白质组芯片筛选与生物信息学分析：将纯化获得的HBx蛋白（HBx-TrxA-His）与对照蛋白（TrxA-His）参照CyDye Protein Labelling CY3 MONO 5-PACK试剂盒说明书（美国GE公司），分别用Cy3荧光染料进行标记。标记完成后，使用样品孵育缓冲液（含10%牛血清白蛋白的1×磷酸盐吐温缓冲液）将蛋白浓度稀释至5 mg/L。将标记蛋白与预先封闭的HuProt^TM人类蛋白质组芯片4.0进行孵育，于4 ℃孵育12 h。随后，依次使用磷酸盐吐温缓冲液（洗涤3次，每次5 min）和超纯水（洗涤2次，每次5 min）清洗芯片，以彻底去除未结合的蛋白。洗脱完毕后，用玻片清洗仪（北京博奥生物有限公司）干燥芯片，并采用LuxScan™10K微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物有限公司）获取荧光信号图像。通过配套软件GenePix Pro 6.0读取原始数据，并计算每个蛋白点的Z值。以Z值（pET32a-HBx）≥2且Z值（pET32a）<2（95%置信区间）为筛选标准，最终鉴定出290个潜在的HBx相互作用蛋白。利用R软件对筛选出的290个蛋白的互作评分进行排序并绘制等级图，其蛋白-蛋白相互作用数据来源于STRING数据库。为识别蛋白互作网络中的复合关系与功能相似性，采用R包igraph中的cluster_walktrap功能进行分析，仅保留包含4个及以上相互作用蛋白的模块。进一步对筛选出的模块内蛋白进行基因本体（GO）富集分析，以探索其在生物学过程、细胞组分和分子功能方面潜在的富集信息。

6.HBV病毒颗粒制备与感染：收集HepAD38细胞培养上清液，加入聚乙二醇8000（PEG-8000）至终浓度5%，于4 ℃缓慢旋转12 h，在4 ℃、4 000×g离心30 min收集沉淀，用适量Opti-MEM培养基重悬病毒颗粒。采用绝对定量PCR测定病毒基因组拷贝数，并进行标准化。在感染细胞时，将目标细胞接种于胶原包被的培养板中，加入适量病毒悬液，使感染复数达到500 vge/细胞，并在感染体系中维持5%PEG-8000浓度。感染16～24 h后，移除含病毒上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，更换新鲜培养基后继续培养，用于后续实验分析。

7.蛋白印迹检测：收集HepG2细胞使用RIPA裂解缓冲液裂解，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离后，转至聚偏二氟乙烯膜（英国GE Healthcare公司）。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入对应第一抗体孵育，洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的第二抗体孵育1 h，最后使用增强型化学发光试剂（美国Millipore公司）显影，使用ImageJ软件进行灰度值分析。

8.实时荧光定量PCR检测HBV RNA：采用Super FastPure Cell RNA Isolation Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）提取细胞总RNA，随后使用含gDNase的FastKing cDNA第一链合成试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，以1 μg RNA为模板合成cDNA。通过Quant Studio 6 Flex实时荧光定量PCR系统（美国Thermo FisherScientific公司），配合Universal SYBR Green Supermix（美国BioRad公司）进行扩增反应。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照基因，采用2^{‑ΔΔ Ct} 法计算目标基因mRNA的相对表达量。

相关PCR引物序列如下：β-actin mRNA-F：5´-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3´，β-actin mRNA-R：5´-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3´；HBV 3.5-kb RNA-F：5´-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3´，HBV 3.5-kb RNA-R：5´-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3´；总HBV RNAs-F：5´-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3´，总HBV RNAs-R：5´-GCCTACAGCCTCCTAGTACA-3´。

9.HBV cccDNA的提取和检测：采用改良Hirt法提取HBV cccDNA。使用500 μL裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10 mmol/L 乙二胺四乙酸，150 mmol/L NaCl，1%十二烷基硫酸钠）于37 ℃裂解感染细胞20 min。随后加入125 μL 2.5 mol/L KCl，4 ℃孵育过夜沉淀基因组DNA与蛋白质。离心收集上清液后，采用酚/氯仿抽提结合乙醇沉淀的方法对DNA进行纯化，并最终将其溶解于TE缓冲液中。为进一步特异性分析cccDNA水平，将纯化后的DNA样品经T5 Exonuclease处理以降解rcDNA及dsDNA，再经100 ℃加热变性。处理后的样品通过Taq-Man探针法进行实时荧光定量PCR检测。

特异性引物和探针如下：HBV cccDNA-F：5´-GTGCACTTCGCTTCACCTCT-3´，HBV cccDNA-R：5´-AGCTTGGAGGCTTGAACAGT-3´，探针：5´-ACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCC-3´。

10.微球菌核酸酶实验：收集六孔板中HBV感染的HepG2-NTCP细胞，加入1 mL预冷的核分离缓冲液（0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl  pH 7.5，5 mmol/L MgCl₂，1% Triton X-100），于4 ℃裂解15 min。随后在2 000×g离心5 min收集细胞核沉淀。用1 mL重悬缓冲液洗涤细胞核1次。之后使用200 μL微球菌核酸酶（MNase）酶切缓冲液重悬细胞核。将重悬的细胞核在37 ℃、800×g振荡条件下孵育30 min，以切割染色质。反应结束后加入4 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸终止反应，再加入8 μL的20 g/L蛋白酶K，于56 ℃消化蛋白质12 h。次日采用酚‑氯仿抽提DNA，并通过凝胶电泳进行分析。

11.染色质免疫沉淀实验（chromatin immunoprecipitation，ChIP）：采用Magnetic ChIP试剂盒（德国Merck Millipore公司）参照说明书进行染色质免疫共沉淀实验。简要步骤如下：细胞裂解重悬，离心收集细胞核沉淀。随后加入1%甲醛溶液，4 ℃固定30 min。用甘氨酸终止交联后，洗涤细胞核，并用细胞核裂解液重悬。超声处理染色质，将其断裂为约200～1 000 bp的片段。取100 μL上清液，用稀释缓冲液按1∶10稀释，加入特异性抗体及20 μL充分重悬的protein A/G磁珠，4 ℃旋转孵育12 h。次日，依次用低盐洗液、高盐洗液、LiCl洗液和TE缓冲液洗涤磁珠-抗体/染色质复合物。最后，在含有蛋白酶K的洗脱缓冲液中，62 ℃振荡洗脱2 h。通过离心柱纯化获得的染色质，并进行实时荧光定量PCR分析。

12.高发光标签（HiBiT）荧光素酶活性检测：细胞中HiBiT融合蛋白的表达水平通过Nano-Glo HiBiT Lytic检测系统（美国Promega公司）进行测定。简要步骤如下：吸弃12孔板中的培养上清液，使用预冷的磷酸盐缓冲液轻柔洗涤细胞1次。按如下比例配制裂解工作液：每孔加入1.5 μL LgBiT蛋白与148.5 μL Lytic缓冲液，混匀后每孔加入150 μL，于4 ℃孵育10～15 min以充分裂解细胞。将裂解液收集至离心管中，4 ℃、1 000×g离心3 min，取上清液转移至新管。按每孔1 μL底物与49 μL Lytic缓冲液的比例配制检测工作液，向上清液样品中加入50 μL，轻柔混匀后立即使用化学发光检测仪进行读数。所有操作均避光进行，并根据试剂盒说明书建议优化孵育与检测时间。

13.酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：采用ELISA对培养上清液中的乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）进行检测。收集的培养上清液经2 000×g离心5 min后，取上清液，参照试剂盒说明书（上海科华生物工程股份有限公司），通过酶联免疫吸附法测定抗原水平。

14.统计学方法：数据以均值±标准差（±s）表示。采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析，组间比较使用单因素方差分析、Student t检验或非参数Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.HBx降解相关互作蛋白的筛选：为筛选与HBx蛋白相互作用的宿主因子，利用pET32a表达并纯化了TrxA-HBx蛋白。依据图1A实验流程，将重组HBx蛋白用Cy3荧光标记后，与覆盖22 627个蛋白位点（覆盖率为81%）的HuProt^TM人类蛋白质组微阵列共孵育。根据筛选标准，共鉴定出290个可能与HBx结合的候选蛋白。GO生物学过程富集分析显示，这些HBx互作蛋白显著富集于多个功能类别，主要包括DNA修复、转录调控、染色质组织与重塑、先天免疫反应、病毒防御应答、自噬调控以及蛋白质翻译后修饰等通路（图1B）。随后我们通过整合UbiBrowser 2.0泛素化蛋白数据库^［27］、人类自噬数据库（HADb）^［28］及通用蛋白质资源（UniProt）^［29］对这些蛋白进行源数据集维恩图交集分析，从中进一步筛选出与蛋白质稳态调控相关的33种互作蛋白，并对这些蛋白进行聚类网络分析。根据功能相似性将其归类为4个主要功能模块，包含UPS、自噬-溶酶体途径，蛋白翻译后修饰以及HSP分子伴侣系统（图1C）。

图1. HBx降解相关互作蛋白的筛选 1A为HuProt人类蛋白质组微阵列分析HBx相互作用蛋白实验流程；1B为HuProt芯片筛选通路富集结果及热图；1C为整合UbiBrowser 2.0泛素化蛋白数据库、人类自噬数据库及UniProt蛋白质功能注释信息对候选蛋白进行源数据集维恩图交集分析并绘制聚类网络.

注：HBx为乙型肝炎病毒X蛋白；GO_Biological Process为基因本体生物过程；3D heatmap为三维热图

2.鉴定候选蛋白介导HBx的降解并抑制cccDNA的转录水平：HBx作为调控HBV cccDNA转录活性的关键蛋白，其降解主要依赖UPS^［24］。为证实HBx降解的主要途径，我们在转染HBx的HepG2细胞中，分别使用UPS抑制剂［MG132、硼替佐米（bortezomib）］和自噬抑制剂（3-MA、HCQ）进行处理。蛋白印迹检测结果显示，相较于自噬抑制，UPS抑制剂对HBx蛋白稳定性的影响更为显著（图2A），进一步证实UPS是HBx降解的主要通路。因此，后续研究将进一步探究UPS与HBx的相互作用，重点关注UPS中负责底物特异性识别与泛素化调控的E3泛素连接酶。我们使用6个候选泛素连接酶的重组质粒及siRNA与HiBiT-HBx/His-HBx共转染至HepG2细胞，通过蛋白印迹及蛋白定量系统检测候选蛋白过表达后对HBx蛋白水平的影响。同时为了评估其对HBV感染后cccDNA转录水平的影响，我们在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中过表达候选蛋白，检测HBV RNA与间接产物HBeAg的变化情况。结果提示（图2B～D），在过表达的候选蛋白中，Cullin-RING连接酶复合体CRL3的底物识别亚基（KLHL8）和典型的HECT型E3连接酶（WWP2）能够明显降低HBx蛋白水平，并同时更为显著地抑制cccDNA介导的病毒转录水平。

图2. 鉴定候选蛋白是否介导HBx的降解并抑制共价闭合环状DNA的转录水平 2A为蛋白印迹检测HepG2与Huh7细胞经泛素-蛋白酶体系统抑制剂（10 μmol/L MG132；10 μmol/L Bortezomib）及自噬抑制剂（5 mmol/L 3-MA；50 μmol/L HCQ）处理8 h后HBx蛋白的表达水平；2B为将His-HBx表达质粒、各候选E3连接酶质粒及各候选E3连接酶siRNA转染至HepG2细胞，蛋白印迹检测6种候选E3泛素连接酶过表达或沉默后对HepG2细胞中HBx蛋白水平的影响；2C检测候选E3连接酶过表达对HepG2细胞中HiBiT-HBx荧光素酶活性的影响；2D为细胞在乙型肝炎病毒（HBV）感染24 h后，将E3连接酶质粒转染至HepG2-NTCP细胞，转染后利用荧光实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测过表达候选E3连接酶对HBV感染HepG2-NTCP细胞后胞内HBV RNA水平及HBeAg水平.

注：Vector为空载体质粒；HBx为乙型肝炎病毒X蛋白；Con为对照组，二甲亚砜处理；MG132为一种26S蛋白酶体抑制剂；Bortezomib为硼替佐米，20S蛋白酶体抑制剂；3-MA为3-甲基腺嘌呤；HCQ为羟氯喹；His为组氨酸标签；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；FBXW11为含F-box和WD重复结构域11；KLHL8为Kelch样蛋白8；UBE为泛素结合酶；WWP2为含WW域E3泛素蛋白连接酶2；HepG2-NTCP为表达NTCP受体的HepG2细胞；HBeAg为乙型肝炎e抗原；^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.001，^d差异无统计学意义

3.验证E3连接酶降解HBx是否依赖于泛素化途径：初步筛选出KLHL8和WWP2两种E3泛素连接酶开展后续深入研究。为明确筛选得到的KLHL8和WWP2是否通过泛素化途径介导HBx蛋白降解，利用转染Flag-HBx的HepG2细胞中进一步验证。通过检测HBx RNA的半衰期，结果显示KLHL8和WWP2过表达均未对HBx mRNA产生明显影响，可能其调控作用发生于转录后水平（图3A）。环己酰亚胺蛋白稳定性实验测定结果表明，KLHL8过表达可显著缩短HBx蛋白的半衰期，加速其降解，而WWP2对HBx蛋白降解速率影响相对有限（图3B）。随后，我们分别采用泛素化途径的MG132（26S蛋白酶体抑制剂）与硼替佐米（20S蛋白酶体抑制剂）处理细胞。结果显示，MG132可显著逆转KLHL8过表达介导的HBx蛋白降解效应，而硼替佐米作用效果并不显著（图3C）。同时免疫沉淀结果表明，KLHL8过表达后可显著增加HBx的泛素化水平（图3D）。上述结果提示，KLHL8可能通过泛素依赖的26S蛋白酶体途径诱导HBx蛋白降解。

图3. 验证筛选得到的关键E3连接酶降解HBx是否依赖于泛素化途径 3A为Flag-HBx质粒与E3连接酶质粒共转染至HepG2细胞，转染48 h后加入放线菌素D（5 mg/L），处理6 h后通过定量PCR检测过表达候选E3连接酶的HepG2细胞中HBx mRNA水平；3B为蛋白印迹检测环己酰亚胺（CHX，50 mg/L）处理0、1、2、4、6 h后，过表达KLHL8或WWP2的HepG2细胞中HBx蛋白的衰减情况；3C为蛋白印迹检测蛋白酶体抑制剂MG132（10 μmol/L）和Bortezomib（10 μmol/L）处理后HBx蛋白的变化；3D为HepG2细胞转染3×Flag-HBx、Ub质粒和KLHL8表达质粒（或空载对照）后利用抗泛素抗体检测泛素化的HBx蛋白.

注：HBx为乙型肝炎病毒X蛋白；Vector为空载体质粒；KLHL8为Kelch样蛋白8；UBE为泛素结合酶；WWP2为含WW域E3泛素蛋白连接酶2；CHX为环己酰亚胺；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；MG132为一种26S蛋白酶体抑制剂；Bortezomib为硼替佐米，20S蛋白酶体抑制剂；DMSO为二甲亚砜；UBB为泛素质粒；IgG为免疫球蛋白G；IB为Ubiquitin为蛋白印迹检测泛素；input为输入样品；^aP<0.05，^b差异无统计学意义

4.验证筛选得到的关键E3连接酶对cccDNA转录活性和HBV复制能力的影响：上述结果证实，KLHL8依赖于泛素化途径降解HBx蛋白并显著抑制cccDNA介导的病毒转录水平。而HBx作为HBV编码的一种多功能调节因子，可通过多维度机制动态直接或间接调节cccDNA微染色体的表观遗传景观，从而影响其转录。因此，我们进一步探究了KLHL8对cccDNA转录活性的影响。ELISA与定量PCR结果显示，在感染HBV的HepG2-NTCP细胞中，过表达KLHL8显著降低了病毒的复制水平与cccDNA的转录活性，敲低KLHL8则得到相反的结果（图4A～B）。ChIP实验表明，以GAPDH和肌球蛋白重链6（MYH6）为内参照基因，KLHL8过表达后显著降低了HBx与cccDNA的结合（图4C）。同时我们通过MNase检测了cccDNA微染色体的可及性，结果表明，KLHL8过表达后HBV cccDNA的开放状态明显受到抑制（图4D）。以上结果表明，具有HBx降解能力的E3连接酶KLHL8可显著抑制cccDNA转录活性和HBV复制。

图4. 验证筛选得到的关键E3连接酶对cccDNA转录活性和HBV复制能力的影响 4A为KLHL8过表达质粒或KLHL8 siRNA转染至HBV感染细胞，酶联免疫吸附试验检测过表达或敲低KLHL8表达量，HBV感染HepG2-NTCP细胞上清液中HBeAg和HBsAg的分泌水平；4B为定量PCR检测过表达或敲低KLHL8的感染HBV的HepG2-NTCP细胞中HBV RNA及总HBV RNA的水平；4C为染色质免疫沉淀实验检测过表达KLHL8对HBx在cccDNA上富集水平的影响；4D为微球菌核酸酶消化实验检测过表达KLHL8后HBV cccDNA微染色体的可及性.

注：KLHL8为Kelch样蛋白8；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；HepG2-NTCP为表达NTCP受体的HepG2细胞；cccDNA为共价闭合环状DNA；HBV为乙型肝炎病毒；HBeAg为乙型肝炎e抗原；HBsAg为乙型肝炎表面抗原；Vector为空载体质粒；ChIP为染色质免疫共沉淀；%Input为免疫沉淀产物占输入样品的百分比；MYH6为肌球蛋白重链6；Marker为标示蛋白位置；Mock为模拟处理对照组；MNase为微球菌核酸酶；^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.001，^d差异无统计学意义

讨论

由于cccDNA具有较长的半衰期，结构稳定且难以清除，是导致HBV感染和复发的根本原因^［30］。而目前临床上广泛应用的核苷（酸）类似物和干扰素治疗均无法直接有效清除和灭活cccDNA^［31］。进一步发展能有效干预cccDNA的新策略，从根本上仍有赖于对其转录、表观遗传等调控机制的深入阐明。HBx蛋白是乙型肝炎病毒编码的关键病毒调节因子，在HBV生命周期和致病过程中发挥核心作用。研究表明，HBx缺失毒株的cccDNA转录活性显著降低，进一步证实了HBx在维持cccDNA转录功能中的关键地位^［32］。近年研究揭示，HBx可通过直接结合cccDNA，并募集宿主染色质修饰复合物，重塑cccDNA的表观遗传景观，从而激活病毒基因表达。基于HBx的重要功能，靶向HBx已成为抗HBV药物研发的潜在策略^［33］。本课题组前期研究发现，小分子化合物双香豆素能够有效促进HBx蛋白的降解，进而在体内外模型中显著抑制cccDNA的转录活性及HBV的复制^［34］，这提示通过诱导HBx降解来实现抗病毒效应是可行的治疗路径。

为探究HBx蛋白稳定性调控的宿主因子及其分子机制，本研究首先通过人类蛋白质组芯片进行了大规模筛选，初步筛选出290个与HBx存在潜在相互作用的候选宿主蛋白。为聚焦于调控HBx稳定性的关键因子，我们进一步整合了UbiBrowser 2.0、HADb及UniProt等数据库信息进行生物信息学分析，将候选蛋白范围富集至33个，并依据功能将其归类为UPS、自噬-溶酶体途径等主要功能模块。通过已有研究证实HBx的降解主要依赖于UPS^［24］，对模块内E3泛素连接酶等候选基因进行功能验证，本研究发现其中KLHL8的过表达可显著降低HBx蛋白水平，并有效抑制HBV感染模型中的病毒复制。

机制研究验证了KLHL8调控HBx稳定性。细胞实验表明，过表达KLHL8可显著缩短HBx蛋白的半衰期；而26S蛋白酶体抑制剂MG132能够有效逆转KLHL8介导的HBx降解，证明该过程依赖于泛素-蛋白酶体途径。作为CRL3复合物的底物识别亚基，KLHL8介导的降解途径揭示了HBx蛋白稳定性调控网络的又一重要环节。但是，本研究虽证实KLHL8可促进HBx的泛素化修饰，但未能进一步鉴定泛素链的连接类型（如K48或K63）。未来可通过泛素链类型特异性抗体或质谱分析，明确KLHL8催化形成的泛素链拓扑结构，从而更全面地阐明其介导HBx降解的分子机制。

在功能层面，本研究证实了KLHL8通过降解HBx进而有效抑制HBV的复制。在HBV感染细胞模型中，过表达KLHL8可显著降低病毒cccDNA的转录活性、病毒抗原HBeAg，HBsAg的表达及病毒复制水平；反之，敲低KLHL8则得到相反的结果。机制上，染色质免疫沉淀实验显示KLHL8降低了HBx与cccDNA的结合，MNase实验进一步证实其削弱了cccDNA微染色体的可及性。这些结果说明，KLHL8通过降解HBx，改变了cccDNA的表观遗传状态，从而抑制其转录，最终发挥抗病毒作用。

综上所述，本研究鉴定出KLHL8是一个能够通过泛素-蛋白酶体途径降解HBx并抑制HBV复制的关键宿主因子。因此，未来研究可沿以下几个方向深入：（1）探索靶向激活KLHL8的策略（如开发小分子激动剂^［35］），为以促进HBx降解为核心的新型抗HBV治疗策略提供潜在靶点；（2）评估KLHL8激活策略与现有核苷（酸）类似物及其他新型抗HBV药物的协同抗病毒作用，为联合治疗方案提供临床前依据；（3）在临床队列中进一步分析KLHL8表达水平与疾病进展、抗病毒治疗应答及功能性治愈相关指标之间的关系，评估其作为生物标志物和治疗靶点的临床转化潜力。本研究进一步深化了对HBx蛋白稳态调控机制的理解，并为实现慢性乙型肝炎的功能性治愈提供了新的潜在干预策略。

利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突

引用本文：

刘志浩, 何小梅, 赵波, 等. E3泛素连接酶KLHL8通过泛素-蛋白酶体途径降解HBx蛋白并抑制HBV cccDNA转录[J]. 中华肝脏病杂志, 2026, 34(9):868-877. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20260414-00151.

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