咖啡酸乙酯通过激活Wnt/β-Catenin通路恢复肠上皮紧密连接缓解小鼠结肠炎

Abstract

Objective

To observe the effect of ethyl caffeate (EC) on intestinal barrier function in mice with dextran sulfate sodium (DSS)-induced murine colitis and explore the possible mechanism.

Methods

Forty male C57BL/6 mice were randomized into control group, DSS model group, and 3 EC groups treated with EC at 5, 10, or 20 mg/kg. Mouse models of colitis were established bytreatment with 2.5% DSS for 7 days, and EC treatment was administered daily by gavage. Colitis phenotypes were assessed by changes in body weight, disease activity index (DAI), colon length and histology. Immunofluorescence staining and PAS staining were used to examine the changes in expressions of the tight junction proteins ZO-1 and claudin-1 and goblet cells, respectively. The intestinal levels of inflammatory factors were detected by ELISA, RT-qPCR and immunohistochemistry. Network pharmacology combined with Western blotting and Wnt inhibitor (IWR-1) was used to verify the mechanism of EC for ameliorating colitis.

Results

Treatment with EC at 10 mg/kg significantly alleviated DSS-induced colitis in the mouse models, reduced intestinal pro-inflammatory cytokines and MPO levels, increased goblet cell counts, and restored ZO-1 and claudin-1 expressions and their membrane localization. Network pharmacology identified Wnt/β‑catenin and tight junction pathways as the core targets of EC, which activated the Wnt/β‑catenin pathway by upregulating WNT3A/β‑catenin, and this effect was blocked by treatment with IWR-1.

Conclusion

EC ameliorates DSS-induced colitis in mice by activating Wnt/β‑catenin signaling to restore tight junction protein expressions and localization, thereby improving intestinal barrier function, suggesting the value of EC as a novel candidate for treatment of inflammatory bowel disease.

炎症性肠病（IBD）是一类慢性不可治愈的免疫介导性疾病，如今已成为全球性健康问题^［1］。近年来，全球IBD发病率呈显著攀升趋势，尤其在发展中国家增速明显，患者不仅面临腹泻、腹痛、便血等严重影响生活质量的症状，还长期承受肠道纤维化、狭窄甚至癌变的远期风险^［2-4］。目前，IBD的发病机制尚未完全阐明，普遍认为与遗传易感性、肠道菌群失调、免疫功能紊乱及肠黏膜屏障损伤密切相关，其中肠黏膜屏障功能紊乱被视为疾病发生的核心病理基础^{［5， 6］}。

肠黏膜屏障由杯状细胞分泌的黏液层与肠上皮紧密连接（ZO-1、Claudin家族、Occludin等）共同组成，二者功能异常均会导致肠道通透性增加，引发肠道菌群易位和固有层免疫系统过度激活，进而启动炎症因子级联释放，加剧肠道黏膜损伤^［7］。因此，靶向修复肠上皮紧密连接、重建肠黏膜屏障已成为IBD治疗的重要策略^{［8， 9］}。Wnt/β-catenin信号通路作为调控肠上皮细胞增殖、分化及黏膜稳态的核心通路，在肠黏膜屏障修复中发挥不可替代的作用^［10］。生理状态下，该通路通过促进肠干细胞更新和紧密连接蛋白合成维持肠道上皮完整性；而在IBD病理微环境中，Wnt/β-catenin通路活性显著降低，导致肠上皮细胞更新障碍、紧密连接蛋白表达紊乱，进一步加重肠道损伤^［11］。激活Wnt/β-catenin通路可有效修复结肠炎模型的肠黏膜屏障，提示该通路可能是IBD治疗的关键调控节点^{［12， 13］}。

IBD的临床治疗以抗TNF-α单抗、免疫抑制剂等为主，但存在治疗抵抗、不良反应明显及疾病易复发等问题，亟需挖掘兼具抗炎与肠黏膜屏障修复双功能的安全天然活性化合物^［14］。咖啡酸乙酯（EC）已被证实具有明确的抗炎、抗氧化、抗菌及调节黏膜免疫反应等药理活性^［15-19］，且可通过抑制MAPK、NF-κB等炎症通路减轻炎症反应，还能通过调节肠道菌群改善感染^［19-22］。尽管EC已在脓毒症急性肺损伤、创伤性异位骨化等炎性疾病中展现抗炎活性^{［21， 23］}，但其在IBD中的应用价值及相关机制尚未见报道。现有研究仅提及EC对石斑鱼黏膜免疫的抑制作用^［19］，却未涉及对屏障结构和功能的调控作用。同时，研究提示结构相似的酚类化合物（如槲皮素）可通过激活Wnt/β-catenin通路修复上皮屏障^［24］，但EC能否调控该通路及其在小鼠肠屏障修复中的作用未知。

基于此，本研究结合体内动物实验（DSS诱导小鼠结肠炎模型）、体外细胞模型（DSS诱导的Caco-2细胞）、网络药理学分析，评估EC对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用和分子机制，为天然活性化合物干预IBD提供了全新的实验支撑，同时为开发靶向肠黏膜屏障修复的新型精准治疗策略筑牢理论基础。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

1.1.1. 动物

本研究选取40只SPF级雄性C57BL/6小鼠（江苏集萃药康生物科技股份有限公司）。所用小鼠为6~7周龄，体质量20~25 g。所有动物均在屏障环境中饲养，环境条件严格控制：温度维持在23±3 ℃，相对湿度为50%±5%，每日照明设置为12 h∶12 h光照与黑暗循环交替。实验前，所有小鼠均经过6 d的环境适应期。本研究所有实验动物操作环节均经蚌埠医科大学实验动物伦理委员会审批通过（伦动科批字［2025］第398号）。

1.1.2. 试剂与仪器

1.1.2.1. 基础生物试剂

EC（陶术生物）；葡聚糖硫酸钠（DSS，MP Biomedicals）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma）；IWR-1（MCE）；RIPA裂解液（李记生物）。

1.1.2.2. 试剂盒与检测试剂

苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、AB-PAS染色试剂盒、CCK-8检测试剂以及不含酚红的胰蛋白酶消化液（索莱宝科技）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（斯达特）；TB Green荧光染料（Takara）；RNA提取试剂盒（Vazyme）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）。

1.1.2.3. 培养基与血清

DMEM培养基及胎牛血清（FBS，Gibco）。

1.1.2.4. 抗体

紧密连接相关抗体ZO-1、Claudin-1，以及山羊抗兔IgG H&L（FITC）、山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Flour®555）抗体（Abcam）；免疫组化抗体MPO、Claudin-1及WNT通路相关抗体WNT3A、β-catenin抗体（Proteintech）；兔抗GAPDH抗体、HRP-偶联的山羊抗兔IgG抗体、HRP-偶联的山羊抗小鼠IgG抗体（ZSGB-BIO）。

1.1.2.5. 实验仪器

荧光倒置显微镜（徕卡DMI8）、实时荧光定量PCR仪（QuantStudio DX）、多功能酶标仪（PerkinElmer Ensight）、多色荧光化学发光凝胶成像系统（ChemiDoc MP）、包埋机（徕卡HistoCore Arcadia）、玻片扫描仪（Olympus VS200）、石蜡切片机（HistoCore MULTICUT）。

1.2. 实验方法

1.2.1. DSS结肠炎建模与分组设计

本实验采用随机数字表法开展完全随机分组，40只小鼠分为对照组、DSS模型组（DSS组）、EC低剂量组（5 mg/kg）、EC中剂量组（10 mg/kg）、EC高剂量组（20 mg/kg）^{［21， 23］}，8只/组。模型构建与药物干预同步进行。造模：DSS组及各EC干预组小鼠，均自由饮用质量体积分数为2.5%的DSS无菌水溶液，每笼每日更换30 mL新鲜配制的溶液，连续干预7 d以构建实验性结肠炎模型。药物干预：造模当日起，各EC组于每日8∶00~10∶00进行灌胃给药，给药体积统一为0.1 mL/只。针对25 g体质量的小鼠，对应给药量分别为0.125、0.25、0.5 mg，药物均溶于100 μL复合溶剂，溶剂配方为1% DMSO原液与99%生理盐水混合。对照组与DSS组在相同时间点灌胃等体积的该溶剂，全程干预7 d。样本处理：造模结束后，处死小鼠。按如下流程处理：首先测量自肛门至回盲部的结肠全长；沿肠管纵轴剖开后，部分组织置于福尔马林中固定，以供后续组织病理学检测；截取结肠近端1 cm肠段，刮取肠黏膜备用，用于后续分子生物学实验。

1.2.2. 肠炎相关症状评估

体质量动态记录：每日上午9时，采用精密电子天平对小鼠体质量（g）进行精准测定并做好记录。DAI评分计算：基于小鼠体质量波动程度、粪便性状特征及消化道出血状况的综合评估，采用（体质量变化系数+粪便性状分值+出血程度分值）/3的计算公式，评分范围设定为0~4分，数值越高表明结肠炎病理表现越严重^［25］。结肠形态检测：实验动物处死后，迅速将完整的结肠样本展开于4 ℃预冷的标尺平台上，测定从肛门至回盲部的结肠长度，连续测量3次并取平均值作为最终数据。

1.2.3. HE和AB-PAS染色

结肠组织于福尔马林固定48 h后，经TBST缓冲液洗涤去除表面污染物，随后采用改良式“瑞士卷”制作流程处理样本^［26］：分离结肠外层粘着的血管和肠系膜，经PBS溶液冲洗肠腔内壁去除残余物，自结肠近端卷曲肠管并保持黏膜层完整连续，随即移入包埋盒，后续经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，制作3 μm厚的组织切片，按HE与AB-PAS染色试剂盒操作说明完成染色，封片后镜下评估组织的病理变化，并采用四级评分法（0~4分）对病变程度进行量化评估^［27］；AB-PAS染色封片后借助显微镜采集图像，通过计数400倍视野下杯状细胞数量，量化评估肠屏障的损伤情况。

1.2.4. ELISA检测炎症因子蛋白表达水平

结肠组织经充分研磨与裂解后，于12 000 r/min转速下离心15 min，收集上清液并于-20 ℃保存。后续实验严格遵循ELISA试剂盒操作指南进行。酶标仪检测各孔吸光度A _{450 nm}值，定量检测结肠黏膜组织中炎性因子IL-6与TNF-α的蛋白浓度。

1.2.5. RT-qPCR测定炎症介质mRNA转录水平

1.2.5.1. RNA提取与cDNA合成

提取组织和细胞样本的总RNA，测出其浓度后参照试剂盒说明书完成反转录反应，制备cDNA备用。

1.2.5.2. PCR扩增与基因表达分析

使用TB Green Premix Ex Taq II试剂盒，通过实时荧光定量PCR技术，测定结肠组织及细胞样本中IL-6与TNF-α的mRNA转录水平，并检测细胞样本中肠屏障相关指标（ZO-1、Claudin-1）的mRNA表达水平。PCR扩增程序设置为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s，重复40个循环。目的基因的表达水平采用2^-ΔΔCt相对定量法进行测定，实验所用引物均由上海生工设计合成（表1）。

表1.

引物序列

Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

Gene name	Gene ID	Primer sequences (5'-3')
IL-6	16193	F:TCTATACCACTTCACAAGTCGGA
		R:GAATTGCCATTGCACAACTCTTT
TNF-α	21926	F:CAGGCGGTGCCTATGTCTC
		R:CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG
ZO-1	21872	F: TTCACAGAGCAGCGACAACT
		R: TCTGCTGGAGTAGGCTACGA
Claudin-1	100771737	F: AAAGCACCGGGCAGATACAA
		R: TCATGCCAATGGTGGACACA
GAPDH	14433	F:TGGCCTTCCGTGTTCCTAC
		R:GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA

1.2.6. 免疫组织化学染色检测

取结肠组织石蜡切片，于70 ℃烘片固定，随后依次进行抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭非特异性结合位点。完成上述处理后，于切片上分别滴加相应一抗（MPO，1∶200）及（Claudin-1，1∶500），4 ℃孵育过夜后，室温复温后PBS洗涤3次，5 min/次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗。经DAB显色剂显色后，采用苏木素对细胞核进行复染，复染结束后依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明处理，最后用中性树脂进行封片。封片完成后，借助Olympus玻片扫描仪采集组织全视野图像，用于后续病理分析，每组随机选取6张代表性图片，利用ImageJ测量阳性区域。

1.2.7. Caco-2细胞CCK-8检测

Caco-2细胞融合度至70%时，经无酚红胰酶消化并重悬，按6×10⁴/mL密度接种于96孔板。待细胞融合度达65%~75%时，移除培养基，PBS洗涤两次。加入含不同浓度EC的培养基100 μL/孔，每组设5个复孔。处理24 h后，加CCK-8溶液，10 μL/孔，37 ℃孵育1~4 h，测量吸光度A _{450 nm}。细胞活力按以下公式计算：细胞活力（%）=（A _药物组-A _空白组）/（A _对照组-A _空白组）×100%。

1.2.8. 免疫荧光染色检测Caco-2细胞间紧密连接蛋白表达定位

1.2.8.1. 细胞爬片制备

胰酶消化对数生长期Caco-2细胞，离心收集后加入DMEM培养基，轻柔吹打制成单细胞悬液后分为3组：对照组、DSS模型组（2% DSS）、EC组（10 μmol/L），无菌镊子夹取细胞爬片放入6孔板（4片/孔），加入2 mL细胞悬液，轻轻摇晃使细胞均匀分布，37 ℃、5% CO₂培养至细胞密度达90%左右时，按分组加入相应药物干预。

1.2.8.2. 染色

造模处理3 d后，弃去培养基，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.2% Triton X-100通透10 min，5% BSA封闭1 h。滴加一抗（ZO-1，1∶200；Claudin-1，1∶400），4℃孵育过夜，复温后PBS洗涤3次，加入荧光二抗［山羊抗兔IgG H&L（FITC），1∶1000；山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Flour®555），1∶1000；DAPI（1 μg/mL）染细胞核］，避光孵育后洗涤封片，显微镜观察成像，ImageJ定量荧光强度及定位情况。

1.2.9. 网络药理学分析

通过PubChem获取咖啡酸乙酯（Ethyl Caffeate）的SMILES分子结构，录入SEA和Super-PRED在线系统预测潜在靶点。SEA仅保留人类（HUMAN）靶点，按默认阈值（E-value<1e-5）筛选；Super-PRED设定置信度>0.6为筛选标准。经UniProt标准化转换并去重，构建药物候选靶标库。检索GeneCards、CTD数据库获取“炎症性肠病”（Inflammatory bowel disease）相关基因，汇总去重后建立疾病靶标库。利用Venny 2.1比对得到350个药物-疾病交集基因，筛选确定关键靶点。将其上传至STRING平台，构建蛋白质互作（PPI）网络。借助微生信系统，通过DAVID工具进行KEGG通路及GO功能（生物过程、分子功能、细胞组分）富集分析，实现结果可视化。

1.2.10. Western blotting检测

1.2.10.1. 蛋白提取

结肠组织样本采用含有蛋白酶抑制剂的预冷RIPA裂解液进行裂解，13 000 r/min离心15 min，收集上清液；细胞样本经PBS洗涤2次后，使用预冷RIPA冰上裂解30 min，于4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，获取上清。

1.2.10.2. 蛋白处理

通过BCA法测定蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液，经95 ℃加热使蛋白变性，分装后于-80 ℃保存备用。

1.2.10.3. 电泳转膜

依据目标蛋白相分子质量配制适宜浓度的分离胶，在200 V电压下，电泳30 min分离蛋白；之后将蛋白转移至经甲醇活化的PVDF膜上，400 mA恒定电流转膜35 min。

1.2.10.4. 抗体孵育与检测

5%脱脂奶粉-TBST室温封闭60 min，4 ℃孵育一抗（ZO-1，兔源，1∶1000；Claudin-1，兔源，1∶2000；WNT3A，鼠源，1∶500；β-catenin，鼠源，1∶5000）及内参GAPDH（兔源，1∶2000）过夜。TBST洗膜3次（5 min/次），加入HRP二抗（HRP-偶联的山羊抗小鼠/兔IgG，1∶3000），室温孵育1 h。ECL化学发光成像，ImageJ软件定量条带光密度值。

1.3. 统计学分析

本研究采用SPSS 26.0分析数据。计量数据以均数±标准差表示，根据分布情况选用t检验或方差分析进行组间比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. EC干预可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎症状

经DSS诱导后，小鼠呈现体质量降低、稀便及出血等结肠炎症状，证明DSS诱导的结肠炎模型构建成功。预实验通过梯度浓度干预筛选发现，EC干预浓度为10 mg/kg时，对结肠炎具有改善作用。在第7天，EC-10组小鼠体质量为26.34±0.28 g，高于DSS组（P<0.05，图1A），DAI评分由3.63±0.52降至2.14±0.35（P<0.05，图1B），增加药物浓度并不能进一步改善肠炎，因此后续实验确定10 mg/kg为EC干预剂量。进一步结果显示，EC干预可逆转DSS诱导的结肠缩短（P<0.05，图1C、D）。

图1.

EC干预可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎症状

Fig.1 Ethyl caffeate (EC) alleviates dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis symptoms in mice. A: Body weight alterations in mice from the Control, DSS model, EC-5 mg/kg, EC-10 mg/kg, and EC-20 mg/kg groups. B: Disease activity index (DAI) scores of the 5 groups. C: Representative colonic images of the mice. D: Mouse colon length measurements (cm). *P<0.05 vs Control; ^# P<0.05 vs DSS.

2.2. EC减轻结肠组织病理损伤并抑制炎症水平

小鼠结肠组织经HE染色及炎症程度评分显示，EC干预能够减轻DSS诱导的结肠黏膜炎症细胞浸润，且有效降低结肠组织炎症评分（P<0.05，图2A）。免疫组化染色结合平均光密度值定量分析显示，DSS组肠黏膜组织中MPO表达水平升高（P<0.05，图2B），EC干预可有效抑制MPO的水平。RT-qPCR与ELISA检测结果显示，DSS组结肠黏膜促炎因子（TNF-α、IL-6）的mRNA及蛋白水平均升高（P<0.05，图2C、D），经EC干预后，表达量均下调（P<0.05，图2C、D）。

图2.

EC减轻结肠组织病理损伤并抑制炎症水平

Fig.2 EC attenuates colonic pathology and inflammation in mice with DSS-induced colitis. A: Histological analysis and inflammation scoring of mouse colons using HE staining. B: MPO immunohistochemistry and the average optical density (AOD) in the 3 groups. C: TNF‑α and IL‑6 protein concentrations in colonic mucosa quantified using ELISA. D: Relative mRNA expression of TNF‑α and IL‑6 in colonic mucosa measured by RT‑qPCR. *P<0.05 vs Control; ^# P<0.05 vs DSS.

2.3. EC改善DSS诱导小鼠肠屏障损伤

小鼠结肠组织AB-PAS染色显示，与对照组比较，DSS组小鼠肠黏膜内的杯状细胞数量降低；而在EC干预后，该细胞数量较DSS组明显回升（P<0.05，图3A）。免疫组化结果显示，与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中Claudin-1的阳性表达信号显著减弱，且其在肠上皮细胞间的定位由规则的连续线性分布转变为不规则的散在或斑块状分布，紧密连接结构的连续性被破坏；经EC处理后，Claudin-1的表达水平明显回升，蛋白定位紊乱状态得到改善，重新呈现出细胞间连续线性的分布模式，紧密连接结构的完整性得以恢复（P<0.05，图3B）。

图3.

EC改善DSS诱导小鼠肠屏障损伤

Fig.3 EC improves DSS-induced intestinal barrier dysfunction. A: AB-PAS staining of mouse colon and goblet cell counts. B: Claudin-1 expression (immunohistochemical staining) and the average optical density (AOD). *P<0.05 vs Control; ^# P<0.05 vs DSS.

2.4. EC上调肠黏膜紧密连接分子表达

通过Western blotting检测显示，紧密连接关键分子Claudin-1、ZO-1在DSS组表达下调，经EC干预后，两类蛋白表达水平回升，且接近对照组水平（P<0.05，图4A）。RT-qPCR结果同样显示，EC干预可促进肠黏膜组织中Claudin-1、ZO-1 mRNA表达水平上调（P<0.05，图4B）。

图4.

EC上调肠黏膜紧密连接分子表达

Fig.4 EC upregulates expression of intestinal mucosal tight junction proteins. A: Western blotting of ZO-1 and claudin-1 expression in colonic mucosal tissues. B: Relative mRNA expression levels of ZO-1 and claudin-1 in colonic mucosa determined by RT-qPCR. *P<0.05 vs Control; ^# P<0.05 vs DSS.

2.5. 网络药理学筛选

为分析EC改善肠屏障的作用机制，取EC与炎症性肠病（IBD）的交集基因350个（Venny图；图5A），将其导入STRING数据库构建蛋白质互作网络（PPI，图5B）。KEGG及GO功能富集分析结果表明，EC调控IBD的作用可能与Wnt/β-catenin通路及紧密连接通路密切相关（图5C、D）。

图5.

网络药理学筛选

Fig.5 Network pharmacology of EC. A: Venn map. B: PPI network C: KEGG pathway enrichment. D: GO functional annotation (BP, CC, MF).

2.6. EC对Caco-2细胞无明显毒性

为明确EC作用的分子机制，以Caco-2细胞为体外研究对象，首先采用CCK-8法证明EC对细胞的毒性，结果显示，EC≤20 μmol/L时，Caco-2细胞存活率均≥95%，与对照组无显著差异（P>0.05，图6），提示其无明显细胞毒性。

图6.

EC对Caco-2细胞无明显毒性

Fig.6 EC exhibits no obvious cytotoxicity in Caco-2 cells. *P<0.05 vs EC=0 μmol/L.

2.7. EC改善DSS诱导的Caco-2细胞屏障结构紊乱

体外实验中，RT-qPCR结果显示，与DSS组相比，EC组（10 μmol/L）Claudin-1和ZO-1的mRNA水平均升高（P<0.05，图7A）。Western blotting结果同样显示，EC干预后，Claudin-1和ZO-1的蛋白表达水平回升（P<0.05，图7B）。免疫荧光结果显示，对照组细胞间Claudin-1（绿色）、ZO-1（红色）连续定位于细胞膜上，荧光信号强且分布均匀，DSS干预后Claudin-1和ZO-1的细胞膜定位紊乱，荧光信号强度降低，而EC干预后，二者细胞膜定位恢复连续分布，荧光强度回升（P<0.05，图7C）。

图7.

EC改善DSS诱导的Caco-2细胞屏障结构紊乱

Fig.7 EC improves DSS-induced barrier structure disorder in Caco-2 cells. A: Relative mRNA expression levels of ZO-1 and claudin-1 in Caco-2 cells detected by RT-qPCR. B: Western blotting of ZO-1 and claudin-1 protein expressions in Caco-2 cells. C: Immunofluorescence staining of ZO-1 (red) and claudin-1 (green) localization and fluorescence intensity in Caco-2 cells. *P<0.05 vs Control; ^# P<0.05 vs DSS.

2.8. EC可激活Wnt/β-catenin通路

DSS干预可抑制WNT3A和β-catenin的蛋白表达，经EC干预后，WNT3A、β-catenin的表达升高（P<0.05，图8）。

图8.

EC可激活Wnt/β-catenin通路

Fig.8 EC activates the Wnt/β-catenin signaling pathway in DSS-induced Caco-2 cells. *P<0.05 vs Control; ^# P<0.05 vs DSS.

2.9. EC修复肠上皮屏障的效应依赖Wnt/β-catenin通路

Western blotting检测结果显示，IWR-1干预后，WNT3A、β-catenin的蛋白表达水平下降。与DSS+EC组相比，DSS+EC+IWR-1组的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1表达均下调（P<0.05，图9）。

图9.

EC修复肠上皮屏障的效应依赖Wnt/β-catenin通路

Fig.9 EC depend on the Wnt/β-catenin pathway to promote repair of intestinal epithelial barrier function. *P<0.05 vs DSS+EC.

3. 讨论

IBD的核心是肠黏膜屏障受损与炎症反应失衡，现有药物虽能暂时缓解症状，但耐药、不良反应及复发等问题突出^［14］。修复肠黏膜屏障、调控紧密连接蛋白表达，已被证实是改善IBD病理进程关键治疗方向^［28］。而兼具抗炎与屏障修复双重功能的天然植物活性化合物，凭借多靶点、低毒性的优势，成为当前IBD治疗研究的重点^［29］。基于此，本研究聚焦天然酚类化合物EC，探究其对IBD的治疗作用及机制，为天然化合物干预IBD补充新的实验依据。

EC是广泛存在于牵牛子、鬼针草等天然植物中的多酚类活性成分^{［15， 16］}，其抗炎潜力已得到研究证实，例如可通过抑制MAPK、NF-κB等信号通路发挥抗炎效应^{［17， 22］}。既往文献报道酚类化合物具有强大的抗炎与抗氧化特性，在慢性炎症疾病治疗研究中展现出广泛应用潜力^［30］，本课题组此前研究亦发现，酚类单体Sotetsuflavone可通过调控JNK及MAPK信号通路、抑制M1巨噬细胞介导的炎症反应，从而对克罗恩病样结肠炎发挥保护效应^［31］，进一步证明了多酚类化合物在肠道炎症干预中的应用价值。然而，EC的抗炎活性在IBD中的应用及对肠道炎症的调控作用未见报道。本研究在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中证实，EC（10 mg/kg）可显著改善疾病表型，缓解体质量下降、DAI升高及结肠缩短，减轻结肠黏膜病理损伤。其抗炎作用与多酚类化合物共性机制一致，既能抑制肠道炎症反应，又能下调促炎因子与MPO表达。

肠黏膜屏障作为分隔肠道菌群与宿主免疫系统的关键防线，其完整性破坏是IBD发生和发展的关键病理环节，紧密连接蛋白的表达和细胞间连接断裂，会直接导致肠道通透性升高，屏障结构和功能紊乱，进而诱发菌群易位与炎症反应放大^［32-34］。既往研究仅发现EC在其他疾病中可抑制黏膜炎症^［19］，并未涉及对肠道屏障结构与功能的调控，本研究明确EC的肠屏障修复作用。在酚类化合物中，槲皮素、姜黄素等已被证实可通过调控紧密连接蛋白表达改善肠屏障功能^{［35， 36］}，而本研究发现EC同样具备这一功能：EC通过上调关键紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1表达、修复两类蛋白的膜定位紊乱；同时显著升高ZO-1、Claudin-1转录水平，恢复杯状细胞数量，实现肠黏膜屏障修复。这一发现丰富了酚类化合物的生物学功能谱，提示EC可能通过“炎症抑制-屏障修复”的协同作用发挥IBD治疗效应，凸显了天然化合物的多效性优势。

本研究通过网络药理学与体外验证相结合的方式，阐明EC修复肠黏膜屏障的分子机制依赖Wnt/β-catenin信号通路的激活。Wnt/β-catenin通路作为调控肠上皮细胞增殖、分化及黏膜稳态的核心通路，其活性下降是IBD肠屏障损伤的关键分子机制，生理状态下，该通路通过促进肠干细胞更新和紧密连接蛋白合成维持肠道上皮完整性，而IBD病理微环境中通路活性受抑，导致肠上皮更新障碍和屏障功能紊乱^［11］。已有研究证实，18β-甘草次酸、槲皮素等天然化合物可通过激活该通路修复肠屏障^{［10， 24］}，而本研究发现EC可通过上调WNT3A、β-catenin表达激活通路，进而促进紧密连接蛋白的合成与功能定位。

综上所述，本研究证实EC可通过激活Wnt/β-catenin信号通路，实现抗炎与肠黏膜屏障修复的双重效应，进而缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。该研究明确了EC作为IBD天然候选药物的应用价值，为IBD精准治疗提供了新的靶点与实验依据，也为酚类化合物的多效性应用提供了重要参考。

基金资助

安徽省临床医学研究转化专项（202427b10020088）；炎症相关性疾病基础与转化研究安徽省重点实验室开放课题（YZ2025B04，YZ2025B03）；蚌埠医科大学研究生创新计划项目（Byycx25018）