脉冲电磁场对高糖诱导的HUVEC增殖抑制的影响及其机制

Highlights

(1) It was demonstrated that pulsed electromagnetic field (PEMF) stimulation with frequency of 15 Hz, intensity of 0.5 mT, and duration of 1.0 h/d for 2 consecutive days improved the inhibition of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) proliferation induced by high glucose, providing a reference for promoting angiogenesis in diabetic wounds through non-invasive treatment.

(2) Combined with transcriptomic sequencing, it was revealed that the high-glucose environment suppressed the Wnt/β-catenin pathway by upregulating adenomatous polyposis coli (APC) protein expression; while PEMF targeted the downregulation of APC protein expression and activated the Wnt/β-catenin pathway to promote proliferation of HUVECs, thereby unveiling the underlying molecular mechanism of this physical therapy.

Abstract

Objective

To investigate the effects of pulsed electromagnetic fields (PEMFs) on high-glucose (HG)-induced inhibition of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) proliferation and its underlying mechanisms.

Methods

This study was an experimental research involving grouping design and factorial design. HUVECs were divided into a conventionally cultured control group, a PEMF group with conventional culture exposed to PEMF stimulation at frequency of 15 Hz, intensity of 0.5 mT, and duration of 0.5 h/d for 2 consecutive days, a HG group cultured with final molarity of 30 mmol/L glucose (hereinafter referred to as HG culture), and a HG+PEMF group received the aforementioned PEMF stimulation while under HG culture. Cell proliferation was assessed using cell counting kit-8 (CCK-8) after 24, 36, and 48 h of culture. After the optimal PEMF stimulation duration 1.0 h/d was screened out, HUVECs were collected and grouped as before. Except for the PEMF stimulation duration of 1.0 h/d, all other treatments were the same as before. Western blotting was employed to detect the protein expression levels of Wnt-3a and β-catenin in cells in each group after 48 h of culture, transcriptomic sequencing was performed on cells in HG and HG+PEMF groups after 48 h of culture to screen for differentially expressed genes (DEGs) with significant differential expression, and Western blotting was used to detect the protein expression level of adenomatous polyposis coli (APC) in cells in each group after 48 h of culture. HUVECs were divided into a HG group, a HG+PEMF group, and an APC overexpression group. The cells in HG group were cultured in HG medium; the cells in HG+PEMF group were cultured in HG medium while receiving PEMF stimulation with frequency of 15 Hz, intensity of 0.5 mT, and duration of 1.0 h/d for 2 consecutive days; the cells in APC overexpression group were transfected using a plasmid to overexpress APC gene, and then subjected to the same treatment as that in HG+PEMF group. Cell proliferation was detected by CCK-8 after 36 and 48 h of culture, and protein expression levels of APC, β-catenin, and Wnt-3a in cells were detected by Western blotting after 48 h of culture. The sample size for the experiments was three.

Results

After 24, 36, and 48 h of culture, cell proliferation levels in HG group were all significantly lower than those in control group (P < 0.05). After 36 and 48 h of culture, the cell proliferation levels in HG+PEMF group were significantly increased compared with those in HG group (P < 0.05). After 48 h of culture, the protein expression levels of Wnt-3a and β-catenin in HG group of cells were significantly lower than those in control group and HG+PEMF group (P < 0.05). Transcriptomic sequencing showed that after 48 h of culture, compared with those in HG group, there were 573 DEGs significantly expressed in the cells of HG+PEMF group, among which the gene expression of APC, the key regulatory protein of the Wnt pathway, was significantly downregulated. After 48 h of culture, the protein expression level of APC in HG group of cells was significantly higher than that in control group and HG+PEMF group (with P values both < 0.05). After 36 and 48 h of culture, the cell proliferation levels in HG+PEMF group were 0.479±0.016 and 0.552±0.029, respectively, which were significantly higher than 0.363±0.019 and 0.437±0.010 in HG group and 0.358±0.005 and 0.439±0.020 in APC overexpression group (with P values all < 0.05). After 48 h of culture, the protein expression level of APC in cells of HG+PEMF group was significantly lower than that in HG group and APC overexpression group (with P values both < 0.05), and the protein expression levels of Wnt-3a and β-catenin were significantly higher than those in HG group and APC overexpression group (P < 0.05).

Conclusions

PEMF stimulation at the frequency of 15 Hz, intensity of 0.5 mT, and duration of 1.0 h/d for 2 consecutive days can alleviate the inhibitory effect of HG on HUVEC proliferation. The mechanism involves the downregulation of APC protein expression in cells by PEMF, which attenuates the suppression of the Wnt/β-catenin pathway and subsequently modulates the expressions of Wnt-3a and β-catenin.

2024年全球20~79岁糖尿病患者达5.89亿，预计到2050年，该数字将攀升至8.53亿^[1]，可见，糖尿病已成为威胁人类生命健康的重大疾病^[2]。糖尿病足溃疡是糖尿病最严重的并发症，其致残、致死率高，治疗困难^[3-5]。糖尿病创面难愈的关键因素之一为创面血管病变，包括高糖、高炎症状态所致的小血管病变，加之创基、创周无法形成有效的新生血管，从而不断加剧创面局部的缺血缺氧状态^[6-7]。因此，促进糖尿病创面局部有效微循环的建立是治疗该类创面的关键策略之一^[8]。

脉冲电磁场（pulsed electromagnetic field，PEMF）疗法是一种安全无创、价格低廉且使用便捷的物理方法，它利用低能量且非电离的电磁场对生理及病理状态下的细胞进行调节，改善细胞的功能状态^[9-11]。研究表明，在心肌梗死大鼠模型中，特定参数的PEMF可以有效调节血管生成，包括加快血管生长速度及增加毛细血管密度^[12-13]。因此，PEMF被广泛用于各类缺血性疾病，包括心肌缺血、脑缺血、组织损伤及糖尿病相关周围血管疾病等的治疗中^[14-16]。无论是在糖尿病创面临床治疗中，还是在糖尿病后肢缺血大鼠模型中，PEMF均可改善局部微循环状态，减轻损伤^[17-18]，但其具体机制暂不明确，可能与PEMF调节血管内皮细胞功能状态相关。本课题组应用前期探索出的频率15 Hz、强度0.5 mT、时长0.5 h/d、连续2 d的PEMF，改善了兔股骨缺损模型中股骨的成骨状态^[19]。本研究进一步探讨PEMF对高糖刺激的内皮细胞增殖抑制的影响及其机制，同时探索PEMF的最佳刺激参数，为临床应用PEMF治疗糖尿病创面提供理论依据。

1. 材料与方法

本研究为成组设计及析因设计实验研究。

1.1. 细胞及主要试剂与仪器来源

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）系购自武汉普诺赛生命科技有限公司，DMEM培养基、青霉素与链霉素双抗、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司，增强型细胞裂解液、化学发光检测试剂盒、二喹啉甲酸蛋白定量测定试剂盒、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物技术有限公司，细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，腺瘤性结肠息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因过表达质粒购自北京擎科生物科技股份有限公司，兔抗人Wnt-3a单克隆抗体、兔抗人β-连环蛋白单克隆抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司，兔抗人APC单克隆抗体、小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

PEMF发生仪由空军军医大学医学生物工程系罗二平教授团队自制，ChemiDoc Imaging System型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，FACS Aria Ⅲ型流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司，Infinite M200 Pro型全波长多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司，Axiovert 40型倒置相差显微镜购自德国ZEISS公司，HiSeq 6000型二代测序仪购自美国Illumina公司。

1.2. 细胞培养与传代

取HUVEC，加入含体积分数10%胎牛血清和常规浓度青霉素与链霉素双抗的DMEM培养基（即完全培养基），置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养（即常规培养），每3天传代1次。使用第3~8代细胞进行后续研究，细胞密度均为每孔2×10⁵个，样本数均为3。

1.3. PEMF刺激对高糖培养的HUVEC增殖和凋亡的影响

该部分细胞均分为对照组、PEMF组、高糖组及高糖+PEMF组，对照组细胞行常规培养，PEMF组细胞在行常规培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长0.5 h/d、连续2 d（分别于培养12、36 h后开始刺激，刺激开始时间后同）的PEMF刺激^[19]，高糖组细胞在加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖的完全培养基中培养（后称高糖培养），高糖+PEMF组细胞在行高糖培养的同时接受PEMF组参数PEMF刺激。

1.3.1. 细胞增殖水平检测

分别于培养0（即刻）、12、24、36、48 h后，按照CCK-8说明书操作，用全波长多功能酶标仪检测各组细胞在波长450 nm处的吸光度，以此反映细胞增殖水平。

1.3.2. 细胞凋亡率检测

于培养48 h后收集各组悬浮及贴壁细胞，经膜联蛋白V/碘化丙啶避光染色15 min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4. PEMF最佳刺激时长筛选

将HUVEC分为高糖组、PEMF刺激0.5 h组、PEMF刺激1.0 h组、PEMF刺激1.5 h组、PEMF刺激2.0 h组。高糖组细胞行高糖培养，PEMF刺激0.5 h组、PEMF刺激1.0 h组、PEMF刺激1.5 h组、PEMF刺激2.0 h组细胞均在行高糖培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、连续2 d的PEMF刺激，刺激时长分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h/d。分别于培养0（即刻）、12、24、36、48 h后同1.3.1检测细胞增殖水平。

1.5. PEMF刺激对高糖培养的HUVEC中Wnt/β-连环蛋白通路的影响

取HUVEC同1.3分组，除PEMF刺激时长为1.0 h/d外，其余处理同前，培养48 h后提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测细胞中Wnt-3a、β-连环蛋白的蛋白表达水平。一抗分别为兔抗人β-连环蛋白单克隆抗体、兔抗人Wnt-3a单克隆抗体和小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体和HRP标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体（稀释比均为1∶5 000）。采用凝胶成像仪获取图像，应用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析各蛋白条带的灰度，以β-肌动蛋白为内参照，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.6. 转录组测序

取HUVEC分为高糖组与高糖+PEMF组，同1.5相应组别进行处理，于培养48 h后提取2组细胞的总RNA，送杭州联川生物技术股份有限公司，经质检合格后进行转录组文库构建，利用Illumina HiSeq 6000平台进行转录组测序。筛选2组细胞间差异表达显著的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），以P < 0.05且∣log₂（差异倍数）∣≥1为筛选标准，其中log₂（差异倍数）≥1者为上调DEG，log₂（差异倍数）≤-1者为下调DEG。绘制热图对高糖+PEMF组相较于高糖组显著下调的前50个DEG进行展示。

1.7. PEMF刺激对高糖培养的HUVEC中APC蛋白表达的影响

取HUVEC同1.5行分组处理，于培养48 h后提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测细胞中APC的蛋白表达水平。一抗为兔抗人APC单克隆抗体（稀释比为1∶2 000）和小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（稀释比为1∶1 000），二抗及后续处理同1.5。

1.8. APC过表达对高糖培养的HUVEC增殖和Wnt/β-连环蛋白通路及APC蛋白表达的影响

1.8.1. 细胞增殖水平检测

取HUVEC分为高糖组、高糖+PEMF组、APC过表达组，前2组细胞同1.5相应组别处理；对于APC过表达组细胞，加入按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书比例混合的APC基因过表达质粒（正义链序列：5'-TGTCCTGCTGTGTGTGTTCTAAT-3'，反义链序列：5'-TGTCAAAGCCATTCCAGCATATC-3'）、Lipofectamine 2000与DMEM培养基，培养6 h后更换为完全培养基，并使用嘌呤霉素筛选，获得过表达APC基因的细胞，之后同高糖+PEMF组处理。分别于培养0（即刻）、12、24、36、48 h后同1.3.1检测细胞增殖水平。

1.8.2. Wnt/β-连环蛋白通路及APC蛋白表达水平检测

取HUVEC同1.8.1行分组处理，于培养48 h后提取总蛋白，同1.5和1.7采用蛋白质印迹法检测各组细胞中Wnt-3a、β-连环蛋白及APC的蛋白表达水平。

1.9. 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以 x±s表示。对分4组和分5组实验中的组间总体比较以及分3组实验中细胞增殖水平的组间总体比较行析因设计方差分析，对多个时间点多个分组中单一时间点组间总体比较行单因素方差分析；对分3组实验中蛋白表达水平组间总体比较行单因素方差分析。组间两两比较均采用Tukey检验。以上检验为双侧检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. PEMF刺激对HUVEC增殖和凋亡的影响

培养12 h后，高糖组与对照组细胞增殖水平比较，差异无统计学意义（P=0.174）；培养24、36、48 h后，高糖组细胞增殖水平较对照组显著下降（P值分别为0.016、 < 0.001、 < 0.001）。培养12、24 h后，高糖+PEMF组与高糖组细胞增殖水平比较，差异无统计学意义（P值分别为0.059、0.304）；培养36、48 h后，高糖+PEMF组细胞增殖水平较高糖组显著升高（P值均 < 0.001）。培养12、24、36、48 h后，PEMF组与对照组细胞增殖水平比较，差异均无统计学意义（P值分别为0.792、0.199、0.687、0.691）。见图 1。

图 1.

4组人脐静脉内皮细胞培养各时间点后增殖水平比较（样本数为3，x±s）

Comparison of proliferation levels of human umbilical vein endothelial cells among 4 groups at various time points after culture

注：对照组细胞行常规培养，脉冲电磁场（PEMF）组细胞在行常规培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长0.5 h/d、连续2 d的PEMF刺激，高糖组细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养），高糖+PEMF组细胞在行高糖培养的同时接受前述参数PEMF刺激；处理因素主效应，F=532.40，P < 0.001；时间因素主效应，F=11 171.00，P < 0.001；两者交互效应，F=162.40，P < 0.001；培养0（即刻）、12、24、36、48 h后，4组间总体比较，F值分别为0.73、4.27、5.34、383.80、445.70，P值分别为0.562、0.045、0.026、 < 0.001、 < 0.001；与高糖组相比，^aP < 0.05

培养48 h后，对照组、PEMF组、高糖组、高糖+PEMF组细胞凋亡率分别为（3.7±0.4）%、（3.5±0.7）%、（24.2±1.2）%、（24.2±1.3）%（高糖因素主效应，F=596.20，P < 0.001；PEMF刺激因素主效应，F=0.33，P=0.572；两者交互效应，F=0.76，P=0.393）。高糖组细胞凋亡率显著高于对照组（P < 0.001）；PEMF组与对照组、高糖组与高糖+PEMF组细胞凋亡率比较，差异均无统计学意义（P值分别为0.975、0.996）。

2.2. PEMF最佳刺激时长

培养36、48 h后，PEMF刺激0.5 h组、PEMF刺激1.0 h组、PEMF刺激1.5 h组、PEMF刺激2.0 h组细胞增殖水平均较高糖组显著升高（P < 0.001）。培养36 h后，PEMF刺激1.0 h组细胞增殖水平较PEMF刺激0.5 h组、PEMF刺激1.5 h组、PEMF刺激2.0 h组显著升高（P值分别为0.009、0.001、 < 0.001）；培养48 h后，PEMF刺激1.0 h组细胞增殖水平较PEMF刺激0.5 h组、PEMF刺激1.5 h组、PEMF刺激2.0 h组显著升高（P值均 < 0.001）。见图 2。1.0 h/d为最佳刺激时长。

图 2.

5组人脐静脉内皮细胞培养各时间点后增殖水平比较（样本数为3，x±s）

Comparison of proliferation levels of human umbilical vein endothelial cells among 5 groups at various time points after culture

注：高糖组细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养）；脉冲电磁场（PEMF）刺激0.5 h组、PEMF刺激1.0 h组、PEMF刺激1.5 h组、PEMF刺激2.0 h组细胞在行高糖培养的同时均接受频率15 Hz、强度0.5 mT、连续2 d的PEMF刺激，刺激时长分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h/d；处理因素主效应，F=91.72，P < 0.001；时间因素主效应，F=5 980.00，P < 0.001；两者交互效应，F=30.97，P < 0.001；培养0（即刻）、12、24、36、48 h后，5组间总体比较，F值分别为0.42、0.88、4.86、51.17、107.50，P值分别为0.789、0.511、0.680、 < 0.001、 < 0.001；与PEMF刺激0.5 h组比较，^aP < 0.05；与PEMF刺激1.5 h组比较，^bP < 0.05；与PEMF刺激2.0 h组比较，^cP < 0.05；与PEMF刺激1.0 h组比较，^dP < 0.05

2.3. PEMF刺激对高糖培养的HUVEC中Wnt/β-连环蛋白通路的影响

培养48 h后，高糖组细胞中Wnt-3a、β-连环蛋白的蛋白表达水平均显著低于对照组（P < 0.001）；高糖+PEMF组细胞中Wnt-3a、β-连环蛋白的蛋白表达水平均显著高于高糖组（P < 0.001）；PEMF组与对照组细胞中Wnt-3a、β-连环蛋白的蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P值分别为0.984、0.883）。见图 3。

图 3.

蛋白质印迹法检测的4组人脐静脉内皮细胞培养48 h后β-连环蛋白和Wnt-3a的蛋白表达水平。3A.条带图；3B、3C.分别为β-连环蛋白、Wnt-3a的条图（样本数为3，x±s）

Protein expression levels of β-catenin and Wnt-3a in 4 groups of human umbilical vein endothelial cells after 48 h of culture as detected by Western blotting

注：条带图上方和条图横坐标中1、2、3、4均分别指示细胞行常规培养的对照组，细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养）的高糖组，细胞在行常规培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长1.0 h/d、连续2 d的脉冲电磁场（PEMF）刺激的PEMF组，细胞在行高糖培养的同时接受前述参数PEMF刺激的高糖+PEMF组；Wnt-3a、β-连环蛋白的高糖因素主效应，F值分别为660.30、1 162.00，P < 0.001；PEMF刺激因素主效应，F值分别为84.58、534.90，P < 0.001；两者交互效应，F值分别为94.30、534.90，P < 0.001；与对照组相比，^aP < 0.05；与高糖组相比，^bP < 0.05

2.4. 转录组测序

培养48 h后，与高糖组比较，高糖+PEMF组细胞中有573个差异表达显著的DEG，其中，312个DEG显著上调，261个DEG显著下调。显著下调的前50个DEG见图 4，其中包括Wnt通路的关键调节蛋白APC，以及周期蛋白依赖性激酶6、细胞分裂控制蛋白中心体蛋白55等有丝分裂相关因子。

图 4.

转录组测序得出的高糖+PEMF组人脐静脉内皮细胞培养48 h后相较于高糖组显著下调的前50个差异表达基因热图

Heat map of top 50 differentially expressed genes significantly downregulated in human umbilical vein endothelial cells in high-glucose+PEMF group compared with those in high-glucose group after 48 h of culture as detected by transcriptomic sequencing

注：1~3为细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养）的高糖组，4~6为细胞在行高糖培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长1.0 h/d、连续2 d的脉冲电磁场（PEMF）刺激的高糖+PEMF组；基因由左至右依次为长链非编码RNA：AL139300、AC138696、转录本TMEM189-UBE2V1、二氢叶酸还原酶假基因1、未表征转录本AC009812、REL原癌基因、细胞分裂控制蛋白中心体蛋白55、苏氨酸和酪氨酸激酶、类解旋酶转录因子、包含卷曲螺旋/锚蛋白重复和普列克底物蛋白同源结构域的腺苷二磷酸-核糖基化因子鸟苷三磷酸（GTP）酶激活蛋白2、腺瘤性结肠息肉病、液泡蛋白分选13同源物A、驱动蛋白家族成员15、动质素1、甲硫氨酸腺苷转移酶2A、包含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列的蛋白6、溶质载体家族38成员2、DEK原癌基因、DNA拓扑异构酶Ⅱα、染色体结构维持蛋白3、结合GTP的Ras同源蛋白酶激活蛋白29、阿片生长因子受体样蛋白1、无义介导的mRNA降解相关磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶1、长链限制性非编码RNA 00942、乙醛脱氢酶1家族成员A1、CXC基序趋化因子配体8、周期蛋白依赖性激酶6、热休克蛋白家族D成员1、锌金属肽酶、输入蛋白5、G蛋白亚基γ12、包含冷休克结构域的E1、小亚基加工体组分20同源物、组蛋白乙酰转移酶1、着丝粒蛋白E、DEAD盒解旋酶18、热休克蛋白家族A成员9、热休克蛋白90 α家族A类成员1、白细胞介素6信号转导物、二氢硫辛酰胺脱氢酶、γ-微管蛋白环状复合物靶向因子、易位相关膜蛋白1、磷酸化酶激酶调节亚基β、雷帕霉素不敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白伴侣蛋白、甘露糖苷酶α2A类成员1、突触结合蛋白结合细胞质RNA相互作用蛋白、蛋白转运蛋白Sec 23同源物A、视黄酸诱导蛋白14、包含跨膜和四三肽重复的蛋白3、基质抗原2

2.5. PEMF刺激对高糖培养的HUVEC中APC蛋白表达的影响

培养48 h后，高糖组细胞中APC蛋白表达水平显著高于对照组（P < 0.001）；高糖+PEMF组细胞中APC蛋白表达水平显著低于高糖组（P=0.001）；PEMF组与对照组细胞中APC蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P=0.990）。见图 5。

图 5.

蛋白质印迹法检测的4组人脐静脉内皮细胞培养48 h后APC蛋白表达水平。5A.条带图；5B.条图（样本数为3，x±s）

APC protein expression levels in 4 groups of human umbilical vein endothelial cells after 48 h of culture as detected by Western blotting

注：APC为腺瘤性结肠息肉病；条带图上方和条图横坐标中1、2、3、4均分别指示细胞行常规培养的对照组，细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养）的高糖组，细胞在行常规培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长1.0 h/d、连续2 d的脉冲电磁场（PEMF）刺激的PEMF组，细胞在行高糖培养的同时接受前述参数PEMF刺激的高糖+PEMF组；高糖因素主效应，F=987.50，P < 0.001；PEMF刺激因素主效应，F=20.97，P=0.002；两者交互效应，F=17.30, P=0.003；与对照组相比，^aP < 0.05；与高糖组相比，^bP < 0.05

2.6. APC过表达对高糖培养的HUVEC增殖和Wnt/β-连环蛋白通路及APC蛋白表达的影响

培养36、48 h后，高糖+PEMF组细胞增殖水平均较高糖组显著升高（P < 0.001），APC过表达组细胞增殖水平均较高糖+PEMF组显著降低（P值分别为 < 0.001、0.002）。见图 6。

图 6.

3组人脐静脉内皮细胞培养各时间点后增殖水平比较（样本数为3，x±s）

Comparison of proliferation levels of human umbilical vein endothelial cells among three groups at various time points after culture

注：高糖组细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养）；高糖+脉冲电磁场（PEMF）组细胞在行高糖培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长1.0 h/d、连续2 d的PEMF刺激；腺瘤性结肠息肉病（APC）过表达组细胞先构建为过表达APC基因的细胞后，在行高糖培养的同时接受前述参数PEMF刺激；分组因素主效应，F=57.36，P < 0.001；时间因素主效应，F=999.70，P < 0.001；两者交互效应，F=22.20，P < 0.001；培养0（即刻）、12、24、36、48 h后，4组间总体比较，F值分别为0.24、0.10、2.77、63.87、29.02，P值分别为0.796、0.903、0.141、 < 0.001、 < 0.001；与高糖组相比，^aP < 0.05；与APC过表达组相比，^bP < 0.05

培养48 h后，与高糖组相比，高糖+PEMF组细胞中Wnt-3a、β-连环蛋白的蛋白表达水平均显著升高（P < 0.001），APC蛋白表达水平显著降低（P < 0.001）；与高糖+PEMF组相比，APC过表达组细胞中Wnt-3a和β-连环蛋白的蛋白表达水平均显著降低（P < 0.001），APC蛋白表达水平显著升高（P < 0.001）。见图 7。

图 7.

蛋白质印迹法检测的3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后APC和β-连环蛋白与Wnt-3a的蛋白表达水平。7A.条带图；7B、7C、7D.分别为APC、β-连环蛋白、Wnt-3a的条图（样本数为3，x±s）

Protein expression levels of APC, β-catenin, and Wnt-3a in three groups of human umbilical vein endothelial cells after 48 h of culture as detected by Western blotting

注：条带图上方和条图横坐标中1、2、3均分别指示细胞加入终物质的量浓度30 mmol/L葡萄糖培养（即高糖培养）的高糖组，细胞在行高糖培养的同时接受频率15 Hz、强度0.5 mT、时长1.0 h/d、连续2 d的脉冲电磁场（PEMF）刺激的高糖+PEMF组，细胞先构建为过表达腺瘤性结肠息肉病（APC）基因的细胞后再在高糖培养的同时接受前述参数PEMF刺激的APC过表达组；3组细胞中APC、Wnt-3a、β-连环蛋白的蛋白表达水平总体比较，F值分别为1 922.00、131.80、253.30，P值均 < 0.001；与高糖组相比，^aP < 0.05；与高糖+PEMF组相比，^bP < 0.05

3. 讨论

糖尿病创面难愈与血管内皮细胞功能障碍密切相关^[7，20-21]。PEMF作为一种低频非侵入性物理疗法，在促进组织再生方面展现出独特的优势^{[22, 23]}，其关键作用靶点之一即为血管内皮细胞^[24]。作为血管功能的主要调控者的内皮细胞，其增殖活性是血管新生和血管修复的生物学基础。大量研究表明，在缺血再灌注损伤、慢性创面及骨缺损等病理状态下，适宜参数的PEMF能通过复杂的信号转导网络，有效促进内皮细胞增殖，从而加快血管化进程^[25-27]，其机制可能涉及细胞周期改变、增殖通路激活、线粒体功能调节、抗氧化应激等多个方面^[11，27]。高糖刺激诱导内皮细胞发生一系列病理性改变，包括线粒体功能障碍、氧化应激增强及炎症刺激等^[21]，是阻碍糖尿病创面血管新生的关键因素。

本研究采用的PEMF发生仪在通入脉冲电流时，会在内部空间产生特定空间分布的脉冲电磁场^[19]，研究中选用15 Hz、0.5 mT的参数，是基于理论和临床的支撑。15 Hz的频率选择是基于物理生物学中的“频率窗口”理论，即特定频率的低频电磁场方能产生生物学负熵效应^[28]。15 Hz是目前临床应用中最为经典且研究成熟的频率，被多款经美国食品药品监督管理局批准用于骨不连治疗的PEMF设备采纳为标准频率^[29]。0.5 mT的强度属弱磁场范畴，可规避热效应干扰；前期本课题组在成骨细胞中证实该强度可显著促进成骨相关蛋白表达^[19]，结合“血管-成骨耦合”理论^[30]，本课题组推测其也适用于内皮修复。与以往研究（如1.2 mT）相比^[18]，该强度更接近内皮细胞内生的生物电场阈值，在维持高效修复的同时，能耗更低，生物安全性更佳。

一项研究表明，PEMF会加速HUVEC生成血管，这可能是通过诱导能量代谢重编程和线粒体分裂实现的^[24]；另一项关于PEMF用于动脉粥样硬化治疗的研究表明，PEMF能够减少炎症刺激的内皮细胞焦亡，这主要是通过调节膜张力和机械敏感性张力介导的瞬时受体电位辣椒素4通道，改善内皮细胞的线粒体功能障碍实现的^[25]。本研究结果表明PEMF可以改善高糖对HUVEC增殖活性的抑制，而对其凋亡无明显影响，说明PEMF在糖尿病创面血管新生方面的作用可能是通过提高内皮细胞活性实现的，具体机制可能与改善HUVEC中的增殖相关信号通路密切相关。

本研究观察到PEMF对于常规培养HUVEC的增殖并未产生明显激活作用，但对于高糖刺激48 h下的HUVEC会产生明显的促进增殖作用，这可能与细胞所处的高糖微环境有一定的关系，也提示生物系统对外部物理信号的响应存在阈值效应，且该效应与细胞的初始生理状态密切相关^[31-32]。正常内皮细胞处于促生长信号与抑生长信号精确维持的稳态，PEMF的微弱电磁感应可能难以打破这种稳态，而高糖暴露导致细胞功能严重受损并脱离这种稳态，在此背景下，PEMF提供的能量耦合信号更易被受损细胞捕获并对细胞进行修复性调节。这种特异性的调节为PEMF在临床中应用的安全性提供了依据，即PEMF能精准作用于病损组织而避免干扰正常组织的生理功能。

除了电磁场的频率与强度外，单次暴露的时长同样是决定PEMF生物学效应的关键变量，且客观存在着“时间窗口”效应。本研究结果显示，1.0 h/d的PEMF处理能最显著地逆转高糖对HUVEC增殖的抑制，而过短时间（如0.5 h/d）的PEMF处理由于物理能量累积不足而疗效欠佳，过长时间（如2.0 h/d）的PEMF处理则使其促增殖效应出现平台期甚至减退趋势。这一最佳治疗窗口的澄明，不仅进一步支撑了前述内皮细胞对电磁物理信号响应的精密时效阈值，也为后续直接锁定该时间节点的分子响应研究提供了确凿的参数依据。

Wnt/β-连环蛋白通路失调是糖尿病创面血管新生受阻的一个关键影响因素^[33]。在生理状态下，Wnt/β-连环蛋白通路可以通过调控细胞周期蛋白D1等靶基因促进内皮细胞增殖，而且可以通过调控内皮细胞间连接及出芽过程中尖端细胞的形成，确保新生血管的成熟与稳定^[34]。然而，在糖尿病创面中，由于高糖、晚期糖基化终末产物及慢性炎症微环境刺激，Wnt/β-连环蛋白通路被明显抑制，从而阻碍有序的血管新生过程，尤其是内皮细胞增殖过程^[33]。本研究结果显示，高糖刺激的HUVEC中Wnt/β-连环蛋白通路中的Wnt-3a及β-连环蛋白的蛋白表达显著下降，而1.0 h/d时长的PEMF刺激后这2个蛋白的表达水平明显提升。进一步在分子水平上，本研究通过转录组学筛选与实验验证，揭示了1.0 h/d时长的PEMF通过下调APC蛋白表达，进而解除对Wnt/β-连环蛋白通路的抑制，最终逆转高糖诱导的内皮细胞增殖障碍这一关键生物学过程。APC-Wnt/β-连环蛋白轴的激活是PEMF发挥内皮保护效应的核心环节。经典观点认为，APC作为β-连环蛋白降解复合体的核心骨架，通过维持胞质内β-连环蛋白的低水平抑制Wnt通路活性^[35]。本研究证实，高糖刺激显著上调了APC蛋白的表达，限制了Wnt通路的激活。而PEMF的介入下调了APC蛋白的表达，导致降解复合体失稳解体，使得逃逸泛素化的β-连环蛋白迅速向核内积聚。核内β-连环蛋白的增加进一步激活了下游与细胞增殖相关的通路，从而改善细胞应对高糖刺激时的增殖抑制^[36]。关于物理信号如何转化为对APC的抑制，目前尚无定论，本课题组推测其可能通过调节APC启动子区域的甲基化状态，或通过电感应离子通道介导的钙信号振荡干扰APC蛋白的代谢速率^[37]，然而该推测仍需进一步实验证实。

在研究结果中，本课题组注意到PEMF在显著促进细胞增殖的同时，对高糖诱导的细胞凋亡改善有限。这种差异可能反映了PEMF在当前参数下具有明显的路径选择性：APC-Wnt信号轴主要调控细胞周期进程，而非直接干预细胞凋亡相关通路。这表明，对于存在严重氧化应激损伤的内皮细胞，单纯依靠Wnt通路的激活可能不足以完全抵消凋亡的损伤反应。未来或需通过优化参数或联用抗氧化手段，以期在“促增殖”与“抗凋亡”2个维度对糖尿病创面实现协同修复。

本研究的创新点在于将PEMF的作用靶点定位于APC这一内源性负调控蛋白。与目前利用外源性配体或外泌体调控Wnt通路的研究不同，PEMF侧重于通过物理方式降低胞内负调控子的强度，这种内生性的调节模式可能具有更高的生物学效率。

综上所述，本研究证明PEMF是一种有效的高糖刺激下的HUVEC保护因子，其通过调节APC-Wnt/β-连环蛋白轴部分抵消高糖对细胞增殖的不利影响。尽管本研究尚处于体外细胞实验阶段，未能完全模拟糖尿病创面复杂的缺氧及炎症微环境，但其筛选的APC这一关键物理响应靶点，为后续开发针对糖尿病创面的非侵入性辅助治疗方案提供了坚实的理论支撑。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（82272269）

General Program of National Natural Science Foundation of China (82272269)