尿源性干细胞体外扩增生物学特性研究

Abstract

Objective

To explore the biological characteristics of urine-derived stem cells (USCs) during in vitro expansion to provide a reference for seed cell selection.

Methods

USCs were isolated from fresh midstream urine samples from healthy volunteers by using the centrifugation combined with adherent cultivation method, followed by continuous passaging at a 1∶3 ratio. The morphological changes of cells were observed under inverted microscopy and analyzed using Image J software. After osteogenic and chondrogenic induction and identification of cells at passage 3 (P3), the biological characteristics of cells at different passages (P3, P5, and P7) were compared. Cell proliferation, cell cycle, senescence, and apoptosis were assessed via cell counting kit 8 assays, flow cytometry, β-galactosidase staining, and Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide staining. RT-PCR was used to detect the expression of stemness genes (Nanog, Oct4, c-Myc, and Sox2). Tube formation assays were conducted to evaluate the in vitro tube-forming ability of cells at different passages.

Results

After osteogenic and chondrogenic induction, USCs were positive for alkaline phosphatase‌, Alizarin red, and Alcian blue staining, respectively. During expansion, the morphology of USCs gradually shifted from rice-grain-like to spindle-shaped, with increasing trends in long diameter, short diameter, area, and aspect ratio (P<0.05). Surface antigen expression was similar across passages. The proliferation capacity declined with increasing passages, and the proportions of S and G₂/M phases decreased. The proportion of senescent cells gradually increased (P<0.05), but the proportion of apoptotic cells showed no significant change (P>0.05). Compared to USCs at P3, the expression of Oct4 was significantly lower in USCs at P7 (P<0.05), whereas no significant difference was found in the expression of other stemness genes among different passages (P>0.05). Tube formation assays demonstrated that USCs at P3 and P5 exhibited superior in vitro tube-forming ability compared to cells at P7 (P<0.05). When co-cultured with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), USCs at P3 showed higher total tube length than the HUVECs only group (P<0.05).

Conclusion

During in vitro expansion, USCs was accompanied by cell enlargement, reduced proliferation, and accumulation of senescence. Compared to USCs at P7, those at P3 and P5 retained better proliferative status and in vitro tube formation ability.

血管新生是创面修复重要生物学基础。创面形成后，损伤组织通过新生血管重建微循环，以保证氧和营养物质供应，促进代谢废物清除、肉芽组织形成及组织重塑。对难愈性创面而言，由于持续炎症、感染、糖尿病及局部血供障碍等因素，血管内皮细胞迁移、增殖及成管过程受到抑制，最终导致创面迁延不愈^[1]。因此，促血管新生是难愈性创面的重要研究方向。

近年来，成体干细胞在血管新生中的应用受到广泛关注。研究常用的MSCs具有自我更新、多向分化及免疫调节功能^[2-3]，可通过改善局部组织微环境，促进血管生成、提高修复效果^[4-5]，但临床应用仍受细胞来源有限、取材方式有创等因素限制。与MSCs相比，尿源性干细胞（urine-derived stem cells，USCs）来源丰富、取材无创、分离简便，体外扩增能力强^[6]，并且表型与MSCs较为相似^[7]，在再生医学中有潜在应用前景^[8-9]。

获得数量充足且功能稳定的种子细胞是USCs修复组织损伤的重要前提。然而，体外扩增并非单纯增加细胞数量，可能伴随细胞形态、增殖、衰老、表型及功能变化。既往研究主要集中于骨髓、脂肪等组织来源MSCs，USCs在体外传代过程中的生物学性质仍鲜见报道。Zhou等^[10]发现早期代次的USCs具有更高的端粒酶活性。我们既往研究发现不同形态USCs亚群的生物学特性存在一定差异^[11]；而且在体外扩增过程中也发现USCs出现明显形态学改变。但是，这些变化是否伴随着其他生物学特性的改变，例如复制性衰老和体外成管能力，目前仍不清楚。为此，本研究拟系统比较不同代次USCs的多维度生物学特性，以期为USCs质量评价和代次选择提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂及仪器

角质形成细胞无血清培养基（keratinocyte serum-free medium，K-SFM）、H-DMEM、DMEM/F12（GIBCO公司，美国）；Ham’s F12培养基、青霉素-链霉素双抗溶液（上海源培生物科技股份有限公司）；FBS（HyClone公司，美国）；成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基 ［赛业（苏州）生物科技有限公司］；ALP染色试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）；PE标记CD29、CD90、CD45抗体以及FITC标记CD73、CD31、CD34抗体（Biolengend公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）；β-半乳糖苷酶染色试剂盒、PBS（北京索莱宝科技有限公司）；FastPure^®细胞/组织总RNA提取试剂盒V2、HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR逆转录试剂盒、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Matrigel基质胶（Corning公司，美国）。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）系（中国科学院细胞库）。

倒置显微镜（Nikon公司，日本）；流式细胞仪（BD Biosciences公司，美国）；荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；多功能酶标仪（BioTek公司，美国）。

1.2. 实验方法

1.2.1. 细胞分离培养及形态学观察

本研究尿液样本由7名7～30岁健康男性志愿者提供，均无泌尿系统相关疾病，每名志愿者采集1～2份新鲜中段尿液。不同志愿者标本不进行混合，分别行细胞分离、培养和检测。

尿液以500×g离心10 min后，分离细胞沉淀，接种于USCs完全培养基（由50%K-SFM、33.75% H-DMEM、11.25%Ham’s F12培养基、5%FBS、1%青霉素-链霉素双抗溶液和特殊因子组成），置于37℃、5%CO₂及饱和湿度培养箱中培养。待原代（P0代）接种约10 d形成明显细胞克隆后进行首次传代，记为P1代。随后，当细胞培养至80%融合时，按1∶3比例连续传代。

倒置显微镜下观察P0～P7代细胞形态，记录P1～P6代每次传代获得的细胞总数；选取P3、P5和P7代细胞，采用Image J软件测量细胞长径、短径、面积，并计算长径/短径比值（长宽比）。

1.2.2. 细胞鉴定

取P3代细胞按照1×10⁴个/孔接种于24孔板，分别采用成骨、成软骨诱导培养基进行诱导培养（诱导组）。其中，成骨诱导培养7、28 d分别行ALP染色和茜素红染色，成软骨诱导培养28 d行阿利新蓝染色，倒置显微镜观察染色情况。以未经诱导的USCs作为对照（对照组）。

1.2.3. 细胞表面标志物检测

取P3、P5、P7代细胞，在PBS中重悬制备成单细胞悬液后，分别与CD29、CD73、CD90、CD31、CD34、CD45抗体冰上避光孵育20 min。采用流式细胞仪检测细胞表面标志物表达情况，并用FlowJo软件进行分析。

1.2.4. 细胞增殖及周期检测

取P3、P5、P7代细胞，按2 000个/孔接种于96孔板，各代次10个复孔。采用USCs完全培养基，于37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养。培养7 d内，每天取细胞按照CCK-8试剂盒说明操作检测细胞增殖，于酶标仪450 nm处检测吸光度（A）值，绘制生长曲线。

另取P3、P5、P7代细胞，采用PI染色法检测细胞周期。乙醇固定细胞后，按细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒说明进行染色，使用流式细胞仪检测细胞内DNA含量，并用FlowJo软件拟合分析G₀/G₁期、S期、G₂/M期比例。

1.2.5. 细胞衰老及凋亡检测

取P3、P5和P7代细胞，按照1×10⁴个/孔接种于24孔板，各代次4个复孔，采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老情况。细胞染色后倒置显微镜拍照，使用Image J软件统计衰老细胞比例。同时，按Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书染色后，使用流式细胞仪检测各代次细胞早期、晚期凋亡率及总凋亡率。

1.2.6. RT-PCR检测

取P3、P5和P7代细胞，按照1×10⁵个/孔接种于6孔板，各代次4个复孔。采用USCs完全培养基，于37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养，待细胞长至80%融合时，采用FastPure^®细胞/组织总RNA提取试剂盒V2提取总RNA，HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行RT-PCR反应，在荧光定量PCR仪上检测，具体步骤：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。β-actin作为内参基因，采用2^−ΔΔCt法计算USCs干性基因相对表达量，包括Nanog同源盒（Nanog）、八聚体结合转录因子4（Oct4）、原癌基因c-Myc（c-Myc）和性别决定区Y框蛋白2（Sox2）。引物序列见表1。

表 1.

Primer sequences of RT-PCR (5'→3')

RT-PCR引物序列（5'→3'）

基因 Gene	引物序列 Primer sequences
Nanog	上游：AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG 下游：TGCGTCACACCATTGCTATTCTTC
Oct4	上游：GTATTCAGCCAAACGACCATC 下游：CTGGTTCGCTTTCTCTTTCG
c-Myc	上游：GCCGGCTAGGGTGGAAGA 下游：CCTTGCTCGGGTGTTGTAAGTT
Sox2	上游：GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG 下游：TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG
β-actin	上游：AGCCTCGCCTTTGCCGA 下游：CTGGTGCCTGGGGCG

1.2.7. 体外成管能力检测

采用Matrigel成管实验评价不同代次USCs的成管能力。将Matrigel基质胶按40 µL/孔铺于24孔板底部，置于37℃、饱和湿度孵箱中约30 min充分成胶后，取P3、P5和P7代USCs，每孔接种1.2×10⁵个细胞，各代次设5个复孔。用含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基培养，培养8 h后每孔随机选取4个视野，倒置显微镜下观察细胞形态，并利用Image J软件分析总管长、总网状面积、总分支长度及总分支数，取均值进行统计分析。以HUVECs为阳性对照。

另取P3、P5和P7代USCs，分别与HUVECs按1∶1比例混合，同上法（每孔细胞总量1.2×10⁵个）培养8 h后观察，比较不同代次USCs对HUVECs成管能力的影响。

1.3. 统计学方法

采用GraphPad Prism 10软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示。当数据满足方差齐性时，采用单因素方差分析进行组间比较，Tukey法进行组间多重比较；当方差不齐时，采用Welch方差分析进行组间比较，Dunnett’s T3法进行多重比较。检验水准取双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. 细胞形态学观察及鉴定

2.1.1. 细胞形态学观察

采用离心联合贴壁培养法成功分离USCs。P0代接种4～6 d，倒置显微镜下可见少量细胞贴壁，形态不一，以米粒状为主；继续培养约10 d，可见明显细胞克隆。在连续传代过程中，USCs形态逐渐发生改变，米粒状细胞减少，梭形比例逐渐增加（图1a～h）。P1～P6代细胞计数分别为109.5万、420.5万、1 215.0万、4 374.0万、7 614.0万、17 010.0万个，自P4代后细胞数量增幅相对下降。

图 1.

Morphological observation of USCs at different passages

不同代次细胞形态学观察

a～h. 倒置显微镜下P0～P7代细胞（×100）；i～l. P3、P5和P7代细胞面积、长径、短径以及长宽比比较 ^*P<0.05

a-h. USCs at P0-P7 under inverted microscopy, respectively (×100); i-l. Comparison of area, long diameter, short diameter, and aspect ratio among USCs at P3, P5, and P7 ^*P<0.05

随着传代次数增加，USCs长径、短径、面积以及长宽比均增加，其中长径、面积不同代次间，短径、长宽比P3代与P5、P7代间，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1i～l。

2.1.2. 细胞鉴定

P3代USCs成骨诱导培养7 d ALP阳性细胞增多，28 d可见明显钙结节；成软骨诱导培养28 d，阿利新蓝染色阳性且细胞呈聚集趋势。对照组细胞形态未发生明显改变，阳性染色比例低于诱导组细胞。见图2。

图 2.

Cell identification (Inverted microscopy×100)

细胞鉴定（倒置显微镜×100）

从左至右分别为成骨诱导7 d ALP染色、成骨诱导28 d茜素红染色及成软骨诱导28 d阿利新蓝染色　a. 对照组；b. 诱导组

From left to right for ALP staining after 7 days of osteogenic induction, Alizarin red staining after 28 days of osteogenic induction, and Alcian blue staining after 28 days of chondrogenic induction, respectively　a. Control group; b. Induction group

2.2. 细胞表面标志物检测

流式细胞术检测示，P3、P5和P7代细胞均高表达CD29、CD73和CD90（阳性率>95%），低表达造血干细胞标志物CD34、白细胞标志物CD45及内皮细胞标志物CD31（阳性率<2%）。见图3。

图 3.

Cell surface marker expressions of USCs at different passages

不同代次细胞表面标记物表达情况

从左至右分别为CD29、CD73、CD90、CD31、CD34、CD45　a. P3代；b. P5代；c. P7代

From left to right for CD29, CD73, CD90, CD31, CD34, and CD45, respectively　a. P3; b. P5; c. P7

2.3. 细胞增殖及周期检测

CCK-8检测示，不同代次USCs增殖能力存在明显差异。培养1、2 d时，各代次间差异无统计学意义（P>0.05）；3 d后随代次增加，A值逐渐降低且差异有统计学意义（P<0.05）。见图4a。

图 4.

Cell proliferation and cell cycle analysis of USCs at different passages

不同代次细胞增殖及周期观测

a. CCK-8法检测细胞增殖；b. 细胞周期　从左至右分别为P3、P5、P7代

a. CCK-8 assay of cell proliferation; b. Cell cycle analysis From left to right for P3, P5, and P7, respectively

细胞周期检测结果与CCK-8检测变化趋势一致。随代次增加，处于S期和G₂/M期细胞比例逐渐减少，提示进入DNA复制及有丝分裂阶段的细胞减少，细胞增殖活性下降。见图4b。

2.4. 细胞衰老及凋亡检测

β-半乳糖苷酶染色示随代次增加，阳性细胞逐渐增多；定量分析示P3、P5和P7代衰老细胞比例分别为0.294±0.070、0.453±0.055和0.648±0.060，差异均有统计学意义（P<0.05）。Annexin Ⅴ-FITC/PI检测示，P3、P5和P7代早期、晚期细胞凋亡率及总凋亡率无明显差异。见图5。

图 5.

Cellular senescence and apoptosis of USCs at different passages

不同代次细胞衰老及凋亡检测

从左至右分别为P3、P5、P7代　a. β-半乳糖苷酶染色（倒置显微镜×100）；b. 流式细胞仪检测细胞凋亡率

From left to right for P3, P5, and P7, respectively　a. β-galactosidase staining (Inverted microscopy×100); b. Flow cytometric analysis of cell apoptosis

2.5. RT-PCR检测

与P3代相比，P5代USCs干性基因（Nanog、Oct4、c-Myc和Sox2）相对表达量相似，差异均无统计学意义（P>0.05）；P7代Oct4基因相对表达量下降且差异有统计学意义（P<0.05），其余基因无明显变化（P>0.05）。P5和P7代的干性基因相对表达量相似，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。

图 6.

Relative expressions of stemness genes in USCs from different passages

不同代次细胞干性基因相对表达量比较

^*P<0.05　a. Nanog；b. Oct4；c. c-Myc；d. Sox2

^*P<0.05　a. Nanog; b. Oct4; c. c-Myc; d. Sox2

2.6. 体外成管能力检测

在Matrigel培养条件下，P3、P5和P7代USCs均可形成不同程度血管样网络（图7a）。各代次USCs总管长、总网状面积和总分支长度分析示，P3和P5代成管效果较好，优于HUVECs（P<0.05），且P3与P5代差异无统计学意义（P>0.05）；而P7代成管能力低于P3、P5代（P<0.05）。各代次总分支差异无统计学意义（P>0.05）。

图 7.

In vitro tube-formation ability of USCs at different passages

不同代次细胞体外成管能力检测

上：倒置显微镜观察（×100）　下：成管指标比较　^*P<0.05　a. HUVECs及P3、P5和P7代USCs；b. HUVECs及其与P3、P5和P7代USCs混合

Upper: Inverted microscopy images (×100)　Bottom: Comparisons of tube-formation indices　^*P<0.05　a. HUVECs and USCs at P3, P5, and P7; b. HUVECs and HUVECs mixed with USCs at P3, P5, or P7

USCs与HUVECs等比混合后观测示，与HUVECs相比，各混合组成管指标均呈上升趋势；其中，P3组总管长明显高于HUVECs组（P<0.05），其余各指标组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见图7b。

3. 讨论

由于取材无创、来源丰富等优势，利用USCs促进组织修复越来越受关注。通过体外培养获取足够数量的高质量种子细胞，是保障干细胞临床应用的基本前提。本研究聚焦体外培养过程中USCs的生物学性质，发现随着细胞代次增加，USCs发生明显的形态学和功能改变，为细胞质量控制提供了参考。

细胞形态是反映干细胞状态的重要表型指标^[12]。已有研究表明，BMSCs在体外培养过程中逐渐出现体积增大、形态变长以及功能减退^[13-14]。近期研究发现，多次传代后，颌骨BMSCs出现体积增大、增殖和迁移能力下降、β-半乳糖苷酶阳性率升高，并伴随P16、P21和P53等衰老相关分子表达增加，说明细胞形态变化与复制性衰老之间具有一定一致性^[15]。与此类似，本研究发现USCs在体外扩增过程中存在形态漂移，由米粒状逐渐变为长梭形，细胞面积增大，长宽比升高，并伴随细胞状态和功能改变。首先，USCs增殖能力逐渐下降。CCK-8结果显示，P3、P5和P7代细胞增殖速度依次减慢。细胞周期结果示，S期和G₂/M期比例下降，说明处于增殖期的细胞数量减少。同时，β-半乳糖苷酶染色示，衰老细胞比例逐渐升高，而凋亡率未见明显增加。这些结果提示，体外扩增后USCs的数量增长受限，主要与其增殖能力减弱和细胞衰老积累有关，并非细胞凋亡导致。此外，P3代与P5代细胞的干性基因表达水平总体稳定，而P7代部分基因表达下降，提示高代次USCs干性降低。结合上述结果可见，USCs扩增至P5代尚能维持相对稳定的状态，而P7代则出现明显质量下降。因此，USCs质量控制不应仅依赖CD29、CD73和CD90等标志物，还应包括增殖、衰老和目标用途相关功能。

再血管化是干细胞修复难愈性创面的重要机制^[16-18]。研究表明，USCs能分化成血管内皮细胞^[19]，体内移植USCs有利于血管再生^[20-22]。Fu等^[23]发现USCs条件培养基可促进HUVECs迁移、增殖和成管。Chen等^[22]发现USCs细胞外囊泡可提高内皮细胞的血管新生功能，促进股骨头坏死修复。尾静脉注射USCs外泌体可减少1型糖尿病大鼠肾损伤、促进血管再生^[24]。众所周知，获取足够数量的干细胞是细胞移植基本条件。既往研究表明，MSCs随着传代扩增发生明显的生物学特性改变。例如，脂肪MSCs经连续传代后，成骨分化能力丧失^[25]。对于扁桃体MSCs，其细胞表面标记物CD146的表达率、成脂和成软骨分化能力都随着体外扩增而迅速降低^[26]。有趣的是，Shen等^[27]发现BMSCs促血管再生能力随着细胞扩增而显著下降。通过成管实验，我们发现P3代和P5代USCs成管能力明显高于P7代（P<0.05），且各代次USCs与HUVECs共培养后成管指标均呈上升趋势。但是，在共培养体系中，除了P3代总管长显著高于HUVECs组外，其余各组间各指标差异均无统计学意义。上述结果提示，连续扩增可能降低USCs成管功能，实际应用中应考虑细胞代次带来的影响。相较于P7代细胞，P3代和P5代更适合作为血管再生种子细胞。

除传代次数外，供体来源也是影响USCs质量稳定性的重要因素。Zhou等^[10]比较了健康青年、健康老年及糖尿病肾病患者USCs，发现不同供体来源USCs在P0～P5代阶段生物学特征相似，但P5代以后健康老年及糖尿病肾病患者来源USCs更早出现细胞体积增大、β-半乳糖苷酶阳性增加、端粒酶活性下降及最大传代次数减少等变化。这表明供体年龄和疾病状态可能与代次共同决定USCs扩增稳定性。关于供体性别的影响，目前证据仍有限。Afonso等^[28]比较了男性和女性健康供体USCs，发现在细胞活力、凋亡、坏死、线粒体呼吸及糖酵解等指标中未观察到具有明确生物学意义的性别差异。但该研究样本量较小，且主要关注代谢和存活状态，尚不能排除性别对细胞分离效率、克隆形成、分化潜能或特定功能的影响。因此，供体性别仍应作为USCs标准化研究中的潜在生物学变量予以记录和评价。

本研究仍存在以下局限。首先，未在相同培养条件下设置BMSCs或脂肪MSCs作为平行对照，因此尚不能判断细胞形态增大、衰老积累及体外成管能力下降是否为USCs特有的生物学变化，还是多种MSCs长期体外扩增的共同规律。其次，未按标准化条件收集培养上清，尚未检测VEGF和bFGF等相关因子水平，也未通过条件培养基、阻断实验或体内模型验证旁分泌机制。因此，现有结果仅说明不同代次USCs的体外成管能力存在差异，不能直接等同于体内促血管再生能力。由于缺乏体内实验，不同代次USCs对难愈性创面的修复效果差异，其再血管化是否差异显著，这些问题仍待探索。此外，导致USCs功能改变的关键分子尚不清楚，后续可结合转录组测序和生物信息学来寻找关键靶标分子^[29]，或者通过优化体外扩增条件（例如低氧培养^[30-31]）来进一步提高USCs的应用潜能。

综上述，在本研究所采用的供体和体外培养条件下，P3代和P5代USCs较P7代保持了更好的增殖状态和体外成管能力，可为USCs体外扩增过程中的质量评价和代次选择提供参考。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（32071331）；四川省自然科学基金（2024NSFSC0576）；四川大学华西医院博后研发基金（2018HXBH053）

National Natural Science Foundation of China (32071331); Natural Science Foundation of Sichuan Province (2024NSFSC0576); Post-Doctor Research Project, West China Hospital, Sichuan University (2018HXBH053)