五味子醇甲通过抑制ACSL4/TFRC/PTGS2信号通路缓解缺氧缺血性脑损伤小鼠神经元铁死亡

Abstract

Objective

To investigate the inhibitory effect of schisandrin A (Sch A) on neuronal ferroptosis following hypoxic ischemic brain damage (HIBD) and the underlying mechanism.

Methods

Thirty-six neonatal C57BL/6J mice (7-10 days old) underwent sham operation (n=6) or permanent left carotid ligation followed by 40 min of hypoxic exposure and daily treatment with Sch A at 10, 30, or 90 mg/kg or with Fer 1 (5 mg/kg) for 3 consecutive days (n=6). Western blotting was used to detect protein expressions of ACSL4, TFRC, and PTGS2 in the cortical ischemic penumbra of the mice; ACSL4/4 HNE co localization in the neurons was detected by immunofluorescence staining, and the levels of ROS, MDA, GSH, and Fe²⁺ were quantified. In cultured HT22 hippocampal neurons with oxygen glucose deprivation (OGD), the effects of pretreatment (1 h prior to OGD) with Sch A (10 μmol/L) and PRGL493 (10 μmol/L), alone or in combination, were assessed by detecting expressions of ferroptosis related proteins, ROS production, lipid peroxidation, cell viability, mitochondrial membrane potential, and the levels of MDA, GSH, and Fe²⁺.

Results

In the neonatal mice, HIBD significantly upregulated ACSL4/TFRC/PTGS2, increased ACSL4/4 HNE co-localization and ROS, MDA, and Fe²⁺ levels, and decreased GSH in the cortical ischemic penumbra. Sch A dose-dependently reversed these changes with effects comparable to that of Fer-1. In cultured HT22 cells, OGD similarly upregulated these proteins, enhanced ACSL4/NeuN co-localization, increased ROS, lipid peroxidation, MDA, and Fe²⁺ levels, and reduced GSH, cell viability, and mitochondrial potential. Both Sch A and PRGL493 alone significantly ameliorated these changes, and their combined treatment further downregulated ACSL4, TFRC and PTGS2 expressions, more effectively alleviated oxidative stress and lipid peroxidation, restored cell viability and mitochondrial function, and reduced Fe²⁺ accumulation.

Conclusion

Sch A protects against HIBD in mice by inhibiting the ACSL4/TFRC/PTGS2 pathway and alleviating neuronal ferroptosis and produces synergistic effects with PRGL493.

缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是源于脑组织供氧和供血中断的一类严重病理过程，常见于新生儿窒息等临床急重症^［1］。其病理机制错综复杂，涉及兴奋性毒性、氧化应激、钙超载、炎症反应以及多种形式的程序性细胞死亡^{［2， 3］}。尽管对其机制的研究不断深入，但除时间窗狭窄的亚低温疗法外，临床上仍缺乏高效、特异的神经保护药物^［4］。因此，深入揭示HIBD后神经元死亡的新型分子机制，并寻找相应的干预靶点，具有重大的临床意义。

近年来，铁死亡作为一种铁依赖性的、以脂质过氧化物蓄积为特征的调节性细胞死亡形式，被证实是介导HIBD后神经元损伤的关键机制^［5］。不同于凋亡、坏死和自噬，铁死亡源于细胞内抗氧化防御体系的失活，以及脂质代谢紊乱导致的过量脂质过氧化^［6］。大脑脂质含量高且耗氧量巨大，神经元尤为易受铁死亡攻击^［7］。在HIBD病理进程中，能量代谢衰竭、活性氧爆发、游离铁离子释放等事件共同构成了铁死亡的触发条件^{［8， 9］}。然而，目前针对HIBD后铁死亡的特异性干预策略仍十分有限，相关调控机制尚待深入阐明。

在铁死亡的分子调控网络中，长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）、转铁蛋白受体（TFRC）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）被认为是3个关键节点^［10］。ACSL4负责催化多不饱和脂肪酸的活化，为脂质过氧化提供核心底物，是决定细胞对铁死亡敏感性的开关^［11］。TFRC作为细胞铁摄入的主要门户，其表达上调将导致细胞内游离铁池扩大，通过芬顿反应催化脂质过氧化，直接驱动铁死亡进程^［12］。而PTGS2作为一种经典的炎症因子，其转录水平在铁死亡过程中被显著且特异性地诱导上调，常被视为铁死亡发生的生物标志物^［13］。这三者构成的ACSL4/TFRC/PTGS2信号轴，从底物供应、催化动力和炎症放大3个层面，协同促进了HIBD后的铁依赖性神经元死亡。因此，干预这一信号轴被视为遏制铁死亡、缓解脑损伤的合理策略。

从天然产物中探寻具有多靶点作用的神经保护剂是应对HIBD复杂病理机制的理想策略。五味子醇甲（Sch A）是中药五味子的主要活性木脂素成分，素有“收敛固涩、益气生津、补肾宁心”之功效，现代药理学研究证实其具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和线粒体保护等多种生物活性^［14-17］。既往研究提示五味子醇甲对脑缺血再灌注损伤具有明确的保护效应^［18］。鉴于铁死亡的核心是抗氧化防御系统（特别是GPX4）崩溃和脂质过氧化，而五味子醇甲在调节氧化还原平衡方面作用突出，我们推测它可能是一种潜在的铁死亡抑制剂。然而，五味子醇甲能否通过抑制ACSL4/TFRC/PTGS2信号轴来缓解HIBD后的神经元铁死亡，目前尚不清楚。

基于上述问题，本研究拟利用体内小鼠HIBD模型及体外神经元氧糖剥夺（OGD）模型，系统探究五味子醇甲对HIBD后神经元铁死亡的干预效果，并明确其作用机制是否与调控ACSL4/TFRC/PTGS2信号通路相关。该研究的开展，将为五味子醇甲的神经保护作用提供新的机制解释，并为HIBD的临床防治提供潜在候选药物和理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

1.1.1. 实验动物与细胞

体内实验选用出生7~10日龄、体质量4~6 g的SPF级C57BL/6J幼鼠，由北京斯贝福生物技术有限公司提供（许可证编号：SCXK（京）2024-0001）。本研究经昆明医科大学实验动物伦理委员会审批通过（伦理批号：kmmu20240248），所有操作均遵循《实验动物管理条例》相关规定。实验动物饲养于SPF级屏障系统内，环境参数设置为恒温（22±2）℃、12 h∶12 h明暗交替循环，并提供自由饮食条件。细胞实验采用武汉普诺赛生命科技有限公司提供的HT22小鼠海马神经元细胞系（产品编号：CL-0697），其遗传特征经STR分型验证。细胞培养体系为添加10%胎牛血清及1%双抗（青霉素-链霉素）的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5%CO₂浓度的恒温培养箱中进行常规传代。所有实验操作均选择细胞对数增殖期完成。

1.1.2. 主要试剂与仪器

主要试剂包括：五味子醇甲（纯度≥99.99%，S3823，Selleck）；铁死亡抑制剂Fer-1（HY-100579）、ACSL4抑制剂PRGL493（HY-139180）（MCE）；一抗包括兔抗ACSL4（A20414）、TFRC（A5865）、PTGS2（A1253）、4-HNE（A26085）及β-actin（AC026）抗体（ABclonal）；小鼠抗NeuN（ab104224）抗体（Abcam）；荧光二抗为Alexa Fluor® 594标记的抗兔IgG（111-585-045）及Alexa Fluor® 488标记的抗小鼠IgG（115-545-003）（Jackson）；ROS检测包括Dihydroethidium（DHE）、DCFH-DA、体内亚铁离子含量检测试剂盒、脂质过氧化检测采用BODIPY 581/591 C11探针、线粒体膜电位检测采用JC-1试剂盒、细胞活力检测采用CCK-8试剂盒（索莱宝）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（建成）；体外亚铁离子检测采用FerroOrange荧光探针（F374，同仁）；DMEM培养基（Gibco）；胎牛血清（HyClone）；恒温细胞培养箱、高速离心机及多功能酶标仪（Thermo Fisher）；荧光显微镜（Leica）；Western blotting电泳、转膜及化学发光成像系统（Bio-Rad）；OGD专用缺氧小室（Billups-Rothenberg）。

1.2. 实验方法

1.2.1. 缺氧缺血性脑损伤模型制备及药物干预

采用改良的Rice-Vannucci法建立HIBD模型^［19］。小鼠经异氟烷吸入麻醉后，于体视显微镜下行左侧颈总动脉永久性结扎术，确认血流阻断后缝合切口。术后小鼠恢复30 min，随后置于低氧舱中，持续通入含8% O₂与92% N₂的混合气体，维持40 min。假手术组仅暴露左侧颈总动脉，不予结扎及低氧处理。将36只C57BL/6J新生小鼠随机分为6组，6只/组：假手术组（Sham）、模型组（HIBD）、Sch A低剂量组（HIBD+Sch A-L，10 mg/kg）、Sch A中剂量组（HIBD+Sch A-M，30 mg/kg）、Sch A高剂量组（HIBD+Sch A-H，90 mg/kg）及铁死亡抑制剂组（HIBD+Fer-1，5 mg/kg）。Sch A用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-NA）配制成混悬液，采用灌胃给药；Fer-1用生理盐水配制，采用腹腔注射。各组于造模后0、24、48 h分别给药，假手术组与模型组给予等体积相应溶剂对照。所有小鼠于造模后第3天经深度麻醉后处死，取大脑皮层缺血半暗带组织用于后续指标检测。

1.2.2. 细胞培养及氧糖剥夺模型建立

HT22细胞常规培养于含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱内。当细胞融合度达70%~80%时，按以下分组进行实验：正常对照组（Control）、氧糖剥夺模型组（OGD）、Sch A干预组（OGD+Sch A，10 μmol/L）、ACSL4抑制剂PRGL493干预组（OGD+PRGL493，10 μmol/L）及联合干预组（OGD+Sch A+PRGL493）。氧糖剥夺（OGD）模型建立方法：弃去原培养基，用无糖Earle's平衡盐溶液轻柔漂洗细胞3次，随后加入无糖DMEM培养基，将细胞转移至缺氧小室中。持续通入95% N₂与5% CO₂的混合气体，于37 ℃恒温条件下培养6 h，以模拟体外缺氧缺血损伤。正常对照组细胞在含糖完全培养基中于常规培养箱内培养相同时间。药物干预组在OGD处理前1 h分别加入相应浓度的Sch A或PRGL493进行预处理。OGD处理结束后，收集细胞用于后续检测。

1.2.3. Western blotting检测蛋白表达

取脑皮质缺血半暗带样本或HT22细胞系，加入含有蛋白酶抑制因子的RIPA组织裂解缓冲液，在冰浴条件下充分裂解后，置于4 ℃环境以12 000×g转速离心15 min，提取上清液组分。运用BCA蛋白定量试剂盒检测样本浓度，混入5×SDS电泳上样缓冲液，通过95 ℃金属浴加热装置进行10 min蛋白变性处理。将定量蛋白样本（20 μg/孔）经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用湿式转印技术将蛋白转移至PVDF膜上。使用5%脱脂乳-TBST封闭液在室温条件下封闭2 h，随后分别孵育ACSL4、TFRC、PTGS2及β-actin特异性一抗（抗体稀释度为1∶1000），4 ℃条件下过夜孵育。经TBST缓冲液3次洗涤（每次5 min）后，加入HRP偶联的二抗（稀释比例1∶5000）室温反应1 h，再次用TBST清洗膜片。应用ECL化学发光底物进行显色反应，通过化学发光检测系统捕获图像信号，采用Image J图像分析软件测定蛋白条带光密度值，并以β-actin作为内参蛋白进行标准化定量分析。

1.2.4. 免疫荧光双标染色

脑切片经脱蜡复水处理后，采用0.5% Triton X-100溶液进行5 min膜通透化处理，继以10%胎牛血清封闭1 h。将混合一抗溶液（包含兔源ACSL4抗体与鼠源NeuN抗体，或兔源4-HNE抗体与鼠源NeuN抗体，抗体稀释度均为1∶400）加入样本，4 ℃条件下孵育12 h。磷酸缓冲盐溶液清洗后，分别加入对应荧光标记二抗（Alexa Fluor 594标记的兔IgG二抗及Alexa Fluor 488标记的小鼠IgG二抗，稀释浓度为1∶800），室温避光条件下反应2 h。经DAPI核染色5 min后，使用抗荧光淬灭封片剂固定样本，通过荧光显微系统进行图像采集。对于HT22细胞样本，先以4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100透膜处理10 min，再以5%牛血清白蛋白封闭30 min。后续免疫荧光染色步骤（包括一抗/二抗孵育及封片）与上述组织切片处理方案一致，最终通过荧光共聚焦显微镜观察ACSL4与NeuN蛋白的共定位现象。

1.2.5. 活性氧（ROS）水平检测

为测定脑组织ROS含量，选用二氢乙锭（DHE）作为荧光标记物。脑切片样本与10 μmol/L DHE溶液在37 ℃无光条件下共培养30 min，经PBS冲洗后，通过荧光显微成像系统进行观察记录。此外，在HT22细胞系中运用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针测定胞内ROS浓度。将细胞悬液与5 μmol/L DCFH-DA溶液在37 ℃、含5% CO₂的恒温培养箱中避光反应30 min，经PBS清洗后即刻采用荧光显微镜完成图像采集。

1.2.6. 透射电镜观测线粒体结构

各组小鼠经心脏灌注生理盐水冲洗后，快速开颅取脑，冰上分离缺血侧大脑皮层缺血半暗带组织，修剪为1 mm³小块，浸入预冷2.5%戊二醛4 ℃固定24 h。经0.1 mol/L PBS漂洗3次后，1%锇酸4 ℃避光后固定2 h；梯度乙醇逐级脱水，丙酮过渡后经丙酮-环氧树脂混合液梯度渗透，纯环氧树脂包埋后60 ℃聚合48 h。制备70 nm超薄切片，经醋酸铀-枸橼酸铅双重染色后，透射电镜下观察神经元线粒体超微结构并采集图像。

1.2.7. 脂质过氧化及氧化应激指标检测

采用BODIPY 581/591 C11荧光探针检测HT22细胞脂质过氧化水平。将细胞与2 μmol/L BODIPY-C11工作液于37 ℃培养箱中避光孵育10 min，PBS洗涤后于荧光显微镜下观察。脂质过氧化程度以绿色荧光与红色荧光比值表示。其次，丙二醛（MDA）含量测定：取脑组织或HT22细胞，加入预冷生理盐水匀浆，4 ℃、12 000×g离心15 min，收集上清。按照试剂盒说明书操作，与TBA工作液混匀后于95 ℃水浴孵育30 min，冷却后离心取上清，酶标仪测定吸光度A _{532 nm}。另外，谷胱甘肽（GSH）含量测定：样本处理同上，按照试剂盒说明书与DTNB工作液反应后，酶标仪测定吸光度A _{420 nm}。

1.2.8. 亚铁离子水平检测

采用FerroOrange荧光探针检测HT22细胞中的亚铁离子水平。将细胞爬片与1 μmol/L FerroOrange工作液于37 ℃、5% CO₂培养箱中避光孵育30 min，无需洗涤，直接于荧光显微镜下观察并采集图像。此外，采用亚铁离子含量检测试剂盒测定脑组织中的Fe²⁺水平。按组织质量与提取液体积1∶10比例进行冰上匀浆，4 ℃、10 000×g离心15 min，取上清液。与显色工作液反应后，酶标仪测定吸光度A _{532 nm}，根据标准曲线计算Fe²⁺含量。

1.2.9. 线粒体膜电位检测

利用JC-1荧光标记法测定HT22细胞线粒体跨膜电位变化。细胞样本与JC-1染色液在37 ℃恒温条件下避光处理20 min，经缓冲液清洗2次后，采用荧光显微技术进行观察。线粒体膜电位变化通过JC-1聚合物（红色荧光）与单体（绿色荧光）的荧光强度比值进行量化分析。

1.2.10. 细胞活力检测

通过CCK-8试剂盒评估HT22细胞增殖状态。细胞悬液被接种至96孔培养板，处理完成后各孔分别加入100 μL不含血清的培养液与10 μL CCK-8工作液，置于37 ℃恒温箱避光反应2 h。采用酶标仪读取光密度A _{450 nm}，以对照组作为基准，换算得出实验组细胞的活性百分比。

1.2.11. 统计学分析

所有实验均独立重复3次，计量资料据采用均数±标准差呈现。采用GraphPad Prism 9.5.1软件进行统计分析。针对多组样本的差异性评估，选用单因素方差分析（ANOVA）方法，特定组别间的比较则运用Tukey多重检验法。统计显著性阈值设定为P<0.05。

2. 结果

2.1. 五味子醇甲抑制HIBD诱导的铁死亡蛋白ACSL4/TFRC/PTGS2的表达上调

在体内实验中，Western blotting结果显示（图1A~D），与Sham组相比，新生小鼠HIBD后3 d脑皮层缺血半暗带组织中，铁死亡关键蛋白ACSL4、TFRC及PTGS2的相对表达水平均升高（P<0.001）。与HIBD组相比，五味子醇甲低剂量（HIBD+Sch A-L）、中剂量（HIBD+Sch A-M）、高剂量（HIBD+Sch A-H）干预及铁死亡抑制剂Fer-1（HIBD+Fer-1）处理后，ACSL4、TFRC及PTGS2的相对表达水平均呈剂量依赖性降低（P<0.05）。

图1.

五味子醇甲对HIBD后铁死亡蛋白ACSL4/TFRC/PTGS2表达的影响

Fig.1 Effects of schisandrin A (Sch A) on expressions of ferroptosis-related proteins ACSL4, TFRC and PTGS2 in neonatal mice with hypoxic ischemic brain damage (HIBD). A: Western blotting of ACSL4, TFRC, and PTGS2 in the ischemic penumbra of the cerebral cortex of the neonatal mice in each group. B-D: Statistical analysis of the relative expression levels. ***P<0.001 vs Sham group; ^# P<0.05, ^## P<0.01, ^### P<0.001 vs HIBD group (n=3). L: Low; M: Medium; H: High; Fer-1: Ferrostatin-1.

2.2. 五味子醇甲对HIBD神经元ACSL4及4-HNE表达的抑制作用

免疫荧光共定位结果显示（图2A~D），与Sham组相比，新生小鼠HIBD组脑皮层缺血半暗带组织中，铁死亡关键蛋白ACSL4与神经元标记物NeuN的共定位荧光强度升高（P<0.001），脂质过氧化标记物4-HNE与NeuN的共定位荧光强度亦升高（P<0.001）。与HIBD组相比，五味子醇甲低剂量（HIBD+Sch A-L）、中剂量（HIBD+Sch A-M）、高剂量（HIBD+Sch A-H）干预及铁死亡抑制剂Fer-1（HIBD+Fer-1）处理后，ACSL4-NeuN共定位荧光强度分别显著降低（P<0.01），4-HNE-NeuN共定位荧光强度也分别降低（P<0.01），且五味子醇甲对两种因子的抑制效应呈剂量依赖性。

图2.

五味子醇甲对HIBD神经元ACSL4及4-HNE表达的影响

Fig.2 Effects of Sch A on expressions of ACSL4 and 4-HNE in brain neurons in mice with HIBD. A, D: Co-localization of ACSL4 or 4-HNE (red) with the neuronal marker NeuN (green) in the ischemic penumbra of the cerebral cortex detected by immunofluorescence double staining. B, C: Quantitative analysis of fluorescence intensity of ACSL4-NeuN and 4-HNE-NeuN. Scale bar=10 μm. ***P<0.001 vs Sham group; ^## P<0.01, ^### P<0.001 vs HIBD group (n=3).

2.3. 五味子醇甲对HIBD的氧化应激及铁积累的改善作用

DHE荧光染色结果显示（图3A、B），与Sham组相比，新生小鼠HIBD组脑皮层缺血半暗带组织中ROS水平升高（P<0.001）；与HIBD组相比，五味子醇甲低剂量（HIBD+Sch A-L）、中剂量（HIBD+Sch A-M）、高剂量（HIBD+Sch A-H）干预及铁死亡抑制剂Fer-1（HIBD+Fer-1）处理后，ROS水平均呈剂量依赖性降低（P<0.001）。生化检测结果表明（图3C-E），与Sham组相比，HIBD组丙二醛（MDA）及亚铁离子（Fe²⁺）相对表达水平升高（P<0.001），而谷胱甘肽（GSH）相对表达水平降低（P<0.001）。与 HIBD 组相比，五味子醇甲各剂量组及Fer-1组均能降低MDA及Fe²⁺水平（P<0.05），同时升高 GSH水平（P<0.05），且五味子醇甲的改善效应呈剂量依赖性。采用透射电镜观察神经元超微结构，为铁死亡提供形态学证据（图3F）。Sham组线粒体形态规则，膜结构完整，嵴排列有序。HIBD组线粒体呈典型铁死亡特征：体积皱缩、膜密度增高，嵴模糊断裂甚至消失，膜完整性受损。Sch A-H及Fer-1干预可显著缓解上述线粒体损伤，结构趋于正常。

图3.

五味子醇甲对HIBD的氧化应激及铁过载的影响

Fig.3 Effects of Sch A on oxidative stress and iron overload following HIBD. A, B: ROS levels in the ischemic penumbra of mouse cerebral cortex detected by DHE fluorescence staining and quantitative analysis (Scale bar=10 μm). C: Relative expression levels of malondialdehyde (MDA). D: Relative expression levels of glutathione (GSH). E: Levels of ferrous ions (Fe²⁺). F: Ultrastructure of the neurons in the ischemic penumbra in each group observed by transmission electron microscopy (Original magnification: ×30 000; scale bar=500 nm). Red arrows indicate mitochondria. ***P<0.001 vs Sham group; ^# P<0.05, ^## P<0.01, ^### P<0.001 vs HIBD group (n=3).

2.4. 五味子醇甲联合ACSL4抑制剂PRGL493协同缓解OGD诱导的神经元铁死亡

在体外实验中，Western blotting结果显示（图4A~D），与对照组相比，OGD组神经元中铁死亡关键蛋白ACSL4、TFRC及PTGS2的相对表达水平均升高（P<0.001）。与OGD组相比，五味子醇甲干预组（OGD+Sch A）及ACSL4特异性抑制剂PRGL493干预组（OGD+PRGL493）中ACSL4、TFRC及PTGS2的表达均降低（P<0.01）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组（OGD+Sch A+PRGL493）中ACSL4、TFRC及PTGS2 的表达进一步降低（P<0.05）。此外，免疫荧光共定位结果显示（图4E、F），与对照组相比，OGD组神经元中ACSL4与神经元标记物NeuN的共定位荧光强度升高（P<0.001）。与OGD组相比，OGD+Sch A组及OGD+PRGL493组中ACSL4-NeuN共定位荧光强度均降低（P<0.001）；与OGD+Sch A组相比，OGD+Sch A+PRGL493组中ACSL4-NeuN 共定位荧光强度进一步降低（P<0.05）。

图4.

五味子醇甲联合ACSL4抑制剂PRGL493对OGD诱导神经元铁死亡的影响

Fig.4 Effects of Sch A combined with the ACSL4 inhibitor PRGL493 on OGD‑induced neuronal ferroptosis. A: Western blotting of ACSL4, TFRC, and PTGS2 protein expression levels in the neurons of each group. B-D: Statistical analysis of the relative expression levels of ACSL4, TFRC, and PTGS2 proteins. E, F: Immunofluorescence double staining for detecting co-localization of ACSL4 (red) with the neuronal marker NeuN (green). Scale bar=50 μm. ***P<0.001 vs Control group; ^## P<0.01, ^### P<0.001 vs OGD group; ^& P<0.05, ^&&& P<0.001 vs OGD+Sch A group (n=3). OGD: Oxygen-Glucose Deprivation.

2.5. 五味子醇甲通过调控氧化应激与脂质过氧化减轻OGD诱导的神经元损伤

DCFH-DA荧光染色结果显示（图5A、B），与对照组相比，OGD组神经元中ROS水平升高（P<0.001）；与OGD组相比，五味子醇甲干预组（OGD+Sch A）及ACSL4抑制剂PRGL493干预组（OGD+PRGL493）中ROS水平均降低（P<0.001）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组（OGD+Sch A+PRGL493）中ROS水平进一步降低（P<0.01）。BODIPY-C11脂质过氧化检测结果显示（图5C、D），与对照组相比，OGD组神经元中氧化型/还原型BODIPY-C11比值显著升高（P<0.001）；与OGD组相比，OGD+Sch A组及OGD+PRGL493组中该比值均显著降低（P<0.01）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组中该比值进一步显著降低（P<0.05）。另外，生化检测结果表明（图5E、F），与对照组相比，OGD组丙二醛（MDA）相对表达水平升高（P<0.001），谷胱甘肽（GSH）相对表达水平降低（P<0.001）；与OGD组相比，OGD+Sch A组及OGD+PRGL493组中MDA水平降低（P<0.05），GSH水平升高（P<0.05）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组中MDA水平进一步降低，GSH水平进一步升高（P<0.05）。

图5.

五味子醇甲对OGD诱导的神经元氧化应激及脂质过氧化的影响

Fig.5 Effects of Sch A on OGD induced neuronal oxidative stress and lipid peroxidation. A, B: ROS levels in the neurons detected by DCFH DA fluorescence staining. C, D: Oxidized/reduced lipid peroxidation levels in the neurons detected by BODIPY C11 fluorescence staining. E: Relative expression levels of MDA. F: Relative expression levels of GSH. Scale bar=50 μm. ***P<0.001 vs Control group; ^# P<0.05, ^## P<0.01, ^### P<0.001 vs OGD group; ^& P<0.05, ^&& P<0.01 vs OGD+Sch A group (n=3). MDA: Malondialdehyde; GSH: Glutathione.

2.6. 五味子醇甲降低OGD诱导的神经元活力下降、线粒体功能障碍与铁积累

CCK-8检测结果显示（图6A），与对照组相比，OGD组神经元活力降低（P<0.001）；与OGD组相比，五味子醇甲干预组（OGD+Sch A）及ACSL4抑制剂PRGL493干预组（OGD+PRGL493）中神经元活力均升高（P<0.05）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组（OGD+Sch A+PRGL493）中神经元活力进一步升高（P<0.05）。JC-1染色结果表明（图6B、C），与对照组相比，OGD组神经元线粒体膜电位（JC-1聚集/单体比值）降低（P<0.001）；与OGD组相比，OGD+Sch A组及OGD+PRGL493组中线粒体膜电位均升高（P<0.01）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组中线粒体膜电位进一步升高（P<0.01）。Fe²⁺荧光探针染色结果显示（图6D、E），与对照组相比，OGD 组神经元中铁离子水平升高（P<0.001）；与OGD组相比，OGD+Sch A组及OGD+PRGL493组中铁离子水平均降低（P<0.001）；与OGD+Sch A组相比，联合干预组中铁离子水平进一步降低（P<0.05）。

图6.

五味子醇甲对OGD诱导神经元活力、线粒体功能及铁积累的影响

Fig.6 Effects of Sch A on OGD induced neuronal viability, mitochondrial function, and iron accumulation. A: Neuronal viability detected by CCK-8 assay. B, C: Fluorescence staining of mitochondrial membrane potential detected by JC-1 staining. D, E: Neuronal iron ion levels detected by Fe²⁺ fluorescence staining. Scale bar=50 μm. ***P<0.001 vs Control group; ^# P<0.05, ^## P<0.01, ^### P<0.001 vs OGD group; ^& P<0.05, ^&& P<0.01 vs OGD+Sch A group (n=3).

3. 讨论

HIBD是新生儿期常见的神经系统急症，可导致严重的神经功能缺损甚至死亡^［20］。近年来，铁死亡作为一种新型的程序性细胞死亡方式，在HIBD的病理进程中受到广泛关注^［21］。铁死亡以铁离子依赖性脂质过氧化为主要特征，涉及多条信号通路的调控，其中ACSL4/TFRC/PTGS2轴被认为是铁死亡的关键执行通路之一^［22］。五味子醇甲（Sch A）是从五味子中提取的主要活性木脂素，具有抗氧化、抗炎及神经保护等多种药理活性^［23］。本研究通过体内外实验，系统探讨Sch A对HIBD后神经元铁死亡的抑制作用及其与ACSL4/TFRC/PTGS2信号通路的关系，为HIBD的治疗提供了新的潜在靶点和候选药物。

本研究首先通过体内实验观察到，HIBD后新生小鼠脑皮层缺血半暗带组织中铁死亡相关蛋白ACSL4、TFRC及PTGS2的表达显著上调，表明HIBD可激活脑组织铁死亡过程。ACSL4是长链脂酰辅酶A合成酶家族成员，可催化多不饱和脂肪酸（PUFAs）的酯化反应，促进含PUFAs的磷脂合成，从而为脂质过氧化提供底物，是铁死亡的关键启动因子^［24］。TFRC是转铁蛋白，介导细胞对铁离子的摄取，其表达上调可导致细胞内铁过载，进而通过芬顿反应促进ROS生成^［25］。PTGS2是铁死亡的重要标志基因，其表达水平与铁死亡敏感性密切相关^［26］。本研究显示，Sch A干预可呈剂量依赖性地抑制HIBD诱导的ACSL4、TFRC及PTGS2表达上调，其效应与铁死亡特异性抑制剂Fer-1相似。免疫荧光共定位结果进一步证实，Sch A可显著降低HIBD后神经元中ACSL4及脂质过氧化标志物4-HNE的荧光强度。这些结果提示，Sch A可能通过调控ACSL4/TFRC/PTGS2信号轴，从源头上抑制铁死亡的启动和进展。

铁死亡的发生与氧化应激和铁代谢紊乱密切相关^［27］。本研究发现，HIBD后脑组织中ROS水平显著升高，同时MDA含量增加、GSH含量降低，提示氧化与抗氧化系统失衡。MDA是脂质过氧化的终产物，其升高反映了细胞膜脂质过氧化损伤的加剧^［28］。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，其耗竭可削弱细胞清除ROS的能力^［29］。此外，HIBD后脑组织中Fe²⁺水平亦升高，表明铁离子稳态遭到破坏。铁离子过量蓄积可通过芬顿反应催化ROS生成，进一步放大氧化应激损伤^［30］。Sch A干预后，上述氧化应激及铁过载指标均呈剂量依赖性改善，表现为ROS和MDA水平下降、GSH含量回升、Fe²⁺蓄积减轻。该结果与Sch A已知的抗氧化活性相一致，同时提示Sch A可能通过调节铁代谢相关蛋白（如TFRC）的表达，直接或间接地减轻铁过载，从而打断铁死亡的正反馈循环。

为明确Sch A作用的分子机制，本研究进一步采用OGD/R模型模拟体外缺氧缺血损伤，并引入ACSL4特异性抑制剂PRGL493进行干预。结果显示，OGD/R处理后HT22神经元中ACSL4、TFRC及PTGS2蛋白表达显著升高，ACSL4与NeuN共定位增强，ROS生成、脂质过氧化、MDA及Fe²⁺蓄积明显增加，同时GSH水平、细胞活力及线粒体膜电位显著下降。Sch A或PRGL493单独干预均可显著逆转上述变化，而二者联合应用后保护效应进一步增强，表现为铁死亡相关蛋白表达进一步下调，氧化应激与脂质过氧化程度进一步减轻，细胞活力及线粒体功能恢复更佳，Fe²⁺水平进一步降低。这一协同作用强有力地证明了Sch A对OGD/R诱导神经元铁死亡的抑制作用确实是通过调控ACSL4通路实现的。值得注意的是，PRGL493单独即可有效抑制ACSL4表达，而Sch A联合PRGL493后效果更优，提示Sch A可能通过ACSL4依赖性和非依赖性双重机制发挥保护作用，或Sch A与PRGL493作用于ACSL4通路的不同环节，产生协同增效。

线粒体在铁死亡中扮演着核心角色，既是ROS的主要来源，也是铁代谢的重要场所^［31］。本研究发现，OGD/R处理后神经元线粒体膜电位显著下降，表明线粒体功能受损。线粒体膜电位的丧失可导致ATP合成障碍、氧化磷酸化解偶联，进一步加剧细胞能量危机和氧化应激^［32］。Sch A干预可显著恢复线粒体膜电位，联合PRGL493后效果更佳。该结果提示，Sch A可能通过稳定线粒体功能，减少线粒体源性ROS生成，从而抑制铁死亡的发生。此外，CCK-8结果显示Sch A可显著提高OGD/R后神经元活力，联合PRGL493后细胞存活率进一步提升，证实Sch A对神经元的保护作用与抑制铁死亡密切相关。

本研究系统阐明了Sch A通过调控ACSL4/TFRC/PTGS2信号通路抑制HIBD后神经元铁死亡的作用机制。体内外实验相互印证，并通过特异性抑制剂PRGL493验证了通路的特异性，全面评估了Sch A对氧化应激、脂质过氧化、铁代谢及线粒体功能的改善作用。然而，本研究也存在一定局限性：首先，体内实验仅观察了HIBD后3 d的时间点，未能动态观察Sch A对铁死亡不同时间窗的影响；其次，未采用ACSL4基因敲除小鼠进一步验证通路的特异性；再次，Sch A是否直接与ACSL4蛋白结合尚未明确；最后，临床前研究尚需在更大样本量及不同种属动物中验证其有效性和安全性。

总之，本研究证实五味子醇甲可通过抑制ACSL4/TFRC/PTGS2信号通路，减轻神经元铁死亡，从而对缺氧缺血性脑损伤发挥神经保护作用。该发现不仅为铁死亡在HIBD发病机制中的作用提供了新的证据，也为Sch A作为HIBD潜在治疗药物奠定了理论基础。未来研究可进一步探索Sch A与ACSL4的分子相互作用模式，评估其长期神经功能改善效果，并开展药物递送系统研究以提高其脑靶向性，推动其向临床转化。

基金资助

国家自然科学基金（32460218，31960194）；云南省科技厅基础研究计划基金（202401AY070001-069）；昆明医科大学博士研究生创新基金（J114150330296）；大学生创新训练计划基金（2024CYD038，S202410674118，S202510674161）

Supported by National Natural Science Foundation of China (32460218，31960194).