细胞外囊泡载药系统在膀胱癌原位灌注治疗中的效果评价

Abstract

To address the clinical challenges of limited therapeutic efficacy and pronounced toxicity associated with conventional intravesical chemotherapy due to the bladder mucosal barrier, this study constructs an extracellular vesicles (EVs)-based drug delivery system loaded with pirarubicin (THP), designated as EVs@THP. EVs derived from MB49 bladder tumor cells were extracted by ultracentrifugation and loaded with THP. Structural characterization confirmed that EVs@THP maintained stable vesicle structure. In vitro cell experiments showed that EVs@THP could be efficiently internalized by bladder cancer cells and presented stronger tumor killing ability compared with free THP. In vivo experiments using orthotopic bladder cancer mouse models further proved that EVs@THP possessed better tissue penetration and intravesical retention after perfusion, with significantly superior antitumor efficacy to free THP. MB49 cell-derived EVs are promising delivery carriers for THP. The EVs@THP system with good biocompatibility and targeting ability can effectively improve the outcome of bladder cancer intravesical chemotherapy, providing experimental evidence for the development and transformation of novel intravesical therapeutic regimens.

0. 引言

膀胱癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一，经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）联合术后膀胱内灌注化疗，是目前临床广泛采用的治疗方案^[1-2]。然而，受膀胱黏膜屏障及尿液冲刷的影响，传统灌注药物局部滞留时间短、组织穿透不足，导致患者术后5年复发率仍高达50%^[3-5]。因此，开发新型膀胱灌注给药体系已成为亟待解决的关键临床问题。

近年来，纳米药物递送系统在膀胱灌注化疗领域得到了广泛研究^[6-7]。例如，带正电多肽的水凝胶可紧密黏附于尿路上皮，延长药物滞留并增强组织穿透^[8]；巯基化二氧化硅纳米颗粒利用巯基与黏蛋白形成二硫键，亦能有效提升黏膜黏附性能^[9]。然而，这类依赖黏附作用的递送体系普遍合成工艺复杂，且存在脱落堵塞尿道的风险，限制了其临床转化^[10]。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由细胞主动分泌的天然脂质双层膜囊泡，可通过表面膜蛋白被靶细胞识别并内吞，在细胞间通讯中发挥重要作用^[11]。相较于脂质体、聚合物及二氧化硅纳米颗粒，EVs具有天然纳米尺寸、良好生物相容性及低免疫原性等优势，是更具前景的药物递送载体^[12-14]。其中，肿瘤来源的EVs（tumor-derived EVs，TDEVs）因保留亲本肿瘤细胞的膜蛋白特征，可与同源肿瘤细胞高效融合，具备优异的靶向能力^[15-16]。尽管EVs在抗肿瘤递送领域备受关注，但其在膀胱灌注化疗中的应用仍相对滞后^[17-18]。特别是如何利用EVs突破膀胱黏膜屏障，并在原位病灶实现高效富集与持久滞留，目前尚缺乏系统研究^[19]。为此，本研究构建了MB49膀胱肿瘤细胞来源EVs负载吡柔比星（pirarubicin，THP）的递送系统（EVs@THP），用于膀胱癌原位灌注治疗。本研究旨在利用TDEVs的同源靶向性与生物相容性，克服游离THP灌注中组织渗透不足、滞留时间短等问题，以提升药物的病灶富集效率与治疗效果，为膀胱癌局部灌注化疗提供一种新型递送策略。

1. 材料和方法

1.1. 材料与仪器

主要试剂：吡柔比星（货号：S80917）、人工尿液（货号：R23033）购自上海源叶生物科技有限公司；DAPI细胞核染料（货号：C1002）、DiO细胞膜绿色荧光探针（货号：C1038）、Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1065M）购自上海碧云天生物科技有限公司。主要仪器：透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（型号：JEM-2010，JEOL Ltd.，日本）；纳米颗粒跟踪分析仪（nanoparticle tracking analysis，NTA）（型号：NanoSight NS300，Malvern Panalytical，英国）；马尔文粒径仪（型号：Zetasizer Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，英国）；超高效液相色谱仪（型号：1290 Infinity II，Agilent Technologies，美国）；小动物超声成像系统（型号：VEVO 3100，FUJIFILM VisualSonics，加拿大）。

1.2. 方法

1.2.1. 细胞培养

MB49小鼠膀胱癌细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM完全培养基，置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。培养过程中每2天更换一次培养基，待细胞汇合度达到80%左右时，用胰酶消化进行传代培养。

1.2.2. EVs和EVs@THP的制备及表征

收集不含血清的MB49细胞培养上清液，经梯度离心（200 g，5 min；12 000 g，45 min；100 000 g，90 min）获得EVs沉淀，重悬于PBS中，于–80 ℃保存备用。参照超声载药法^[20]制备EVs@THP：将1 mL浓度为1×10¹¹ particles/mL的EVs 溶液，与不同质量梯度的THP混合，于冰浴下脉冲超声（100 W）处理，超速离心去除游离THP后得到EVs@THP。采用超高效液相色谱测定破膜后样品中THP含量，计算包封率（包载THP/投药总量）与载药量（THP质量/EVs@THP总质量）。采用TEM观察EVs及EVs@THP的形态，NTA测定平均粒径和颗粒浓度，电泳光散射法（electrophoretic light scattering，ELS）测定Zeta电位。将样品置于人工尿液中，37 ℃恒温振荡条件下定时监测粒径变化以评估物理稳定性；另以透析袋扩散法于相同条件下测定THP累积释放率，绘制体外释放曲线。

1.2.3. 细胞摄取实验

将MB49细胞接种于6孔板中贴壁过夜，分别加入含25 μg/mL THP或含等剂量THP的EVs@THP培养基孵育30 min，PBS洗涤3次后更换新鲜培养基继续孵育3 h。用4%多聚甲醛溶液固定细胞后，加入含5 μg/mL DiO（绿色荧光，标记细胞膜）、10 μg/mL DAPI（蓝色荧光，标记细胞核）的染色液，染色10 min；经PBS洗涤后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察细胞对游离THP和EVs@THP的摄取情况。

1.2.4. 细胞活力与凋亡检测

将MB49细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，过夜培养至细胞贴壁。弃去原有培养基，每孔加入100 μL含0～25 μg/mL梯度浓度THP或EVs@THP的DMEM溶液，孵育30 min；用PBS洗涤细胞3次，加入新鲜培养基继续孵育24 h。随后，采用MTT法检测细胞活力，并利用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术评估细胞凋亡率，分析EVs@THP对MB49细胞的体外杀伤效果。

1.2.5. 原位膀胱癌小鼠模型构建与THP体内分布实验

6～8周龄雌性C57BL/6小鼠（SPF级）购自广东省医学实验动物中心。实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2022-0002；质量合格证号：No.44007200147204。实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2025-0168。小鼠麻醉后轻压腹部排空膀胱，经石蜡油润滑的24G留置针，依次尿道灌注100 μL 0.1 mg/mL多聚赖氨酸溶液（滞留1 h）和100 μL含1×10⁵个MB49细胞的悬液（滞留30 min）构建原位膀胱癌模型。14天后，经小动物超声仪检测确认模型构建成功。随后将模型小鼠麻醉，经留置针灌注100 μL含0.5 mg/kg THP或等剂量EVs@THP的PBS溶液，滞留30 min后排空，并于给药后0、12、24 h采用Tanon多通道小动物成像系统进行荧光成像，观察THP在小鼠体内的分布情况。

1.2.6. 体内治疗效果与生物相容性评价

将原位膀胱癌小鼠随机分为PBS对照组、THP治疗组与EVs@THP治疗组（每组5只）。排空膀胱后经尿道插入24G留置针，分别灌注100 μL相应溶液（每2天1次，共5次，THP剂量为0.5 mg/kg），滞留30 min后排空。通过超声监测肿瘤生长，治疗结束后处死小鼠，剥离膀胱并称重观察。同时，收集心、肝、脾、肺、肾及膀胱组织进行H&E染色观察病理形态，并采集外周血检测血常规与血液生化指标：白细胞（white blood cell，WBC）、红细胞（red blood cell，RBC）、丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA），评价EVs@THP的体内生物相容性。

1.2.7. 统计学分析

所有实验至少重复3次，实验数据以均值±标准差示。采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验。检验水准α = 0.05。

2. 结果

2.1. EVs@THP的制备与表征

TEM（见图1a）与NTA（见图1b）检测显示，超声载药前后的EVs均呈典型双层膜结构，且粒径分布均匀。载药前EVs的粒径为（118.7±16.6）nm，载药后EVs@THP的粒径为（119.0±10.1）nm，表明载药过程未对囊泡的基本形态造成破坏。Western blot（见图1c）与Zeta电位（见图1d）分析证实，EVs@THP稳定表达特征性标志蛋白（CD9、CD63、TSG101）且表面电荷无显著改变，表明超声载药成功实现THP的有效负载，且未对囊泡的固有理化性质造成不良影响。载药测试（见图1e）结果表明，1 mg/mL为兼顾载药效率与药物利用度的最佳投药浓度，在此条件下载药量达（25.2±1.7）%，包封率为（33.7±0.9）%。在模拟膀胱尿液环境中，EVs@THP在72 h内粒径保持稳定，维持在110～130 nm范围内，且无明显聚集沉淀（详细数据参见附件1）；并展现出良好的缓释特征（详细数据参见附件2）：前24 h累计释放率为（68.5±2.9）%，随后释放速率减缓，72 h累计释放达（80.2±3.2）%，提示该载药系统可在膀胱局部实现长效、平稳的药物释放。

图 1.

Characterization of EVs@THP

EVs@THP的表征

a. TEM观察载药前后EVs形貌，标尺：100 nm；b. NTA检测载药前后EVs粒径；c. WB检测EVs特征性标志蛋白CD63、TSG101及CD9的表达情况；d. ELS测定载药前后EVs的Zeta电位变化；e. 不同投药浓度下EVs的载药量与包封率。ns，无显著差异；^*P < 0.05，^****P < 0.000 1

a. TEM observation of EVs morphology before and after drug loading, scale bar: 100 nm; b. particle size distribution of EVs before and after drug loading detected by NTA; c. expression of EVs characteristic marker proteins CD63, TSG101, and CD9 detected by WB; d. Zeta potential changes of EVs before and after drug loading determined by ELS; e. drug loading capacity and encapsulation efficiency of EVs at various THP concentrations. ns, not significant; ^*P < 0.05，^****P < 0.000 1

2.2. EVs@THP的体外抗肿瘤效果

基于THP的荧光特性，采用共聚焦显微镜检测游离THP与EVs@THP与MB49细胞共孵育后的细胞摄取情况。如图2a共聚焦显微镜观察结果所示，EVs@THP处理组MB49细胞的荧光强度显著高于游离THP组，这一差异得益于EVs与MB49细胞的同源特异性融合作用。MTT细胞活力检测结果（见图2b）显示，在0～25 μg/mL THP浓度范围内，EVs@THP对MB49细胞的杀伤作用显著强于游离THP。流式细胞凋亡分析（见图2c）进一步证实，EVs@THP诱导MB49细胞凋亡的效率达54.7%，显著优于游离THP组。上述结果表明，EVs@THP更容易被MB49细胞内吞，可在短时间内高效杀伤膀胱癌细胞，有望为膀胱癌的膀胱内治疗提供新的策略。

图 2.

Cytological experiments of EVs@THP

EVs@THP的细胞学实验

a. 共聚焦观察THP与EVs@THP的细胞摄取，标尺：25 μm；b. MTT检测THP与EVs@THP的细胞毒性；c. 流式细胞术检测THP与EVs@THP诱导的细胞凋亡。^***P < 0.001，^****P < 0.000 1

a. cellular uptake of free THP and EVs@THP observed by confocal microscopy, scale bar: 25 μm; b. cytotoxicity of free THP and EVs@THP detected by MTT assay; c. cell apoptosis induced by free THP and EVs@THP analyzed by flow cytometry. ^***P < 0.001，^****P < 0.000 1

2.3. EVs@THP的体内分布

基于体外实验的优异结果，进一步开展体内膀胱灌注效果研究。活体成像（见图3a）及荧光定量（见图3b）结果显示：游离THP灌注后24 h内荧光信号迅速衰减，而EVs@THP组小鼠膀胱部位荧光强度显著高于THP组，证实EVs@THP在膀胱内的滞留效果更优。同时，各组小鼠其他主要脏器均未检测到明显荧光，提示24 h内EVs@THP与THP不会从膀胱转运至全身脏器；这一现象得益于膀胱独特的器官位置及尿路上皮的屏障作用，表明EVs@THP经原位膀胱灌注具有良好的全身安全性。

图 3.

In vivo distribution of EVs@THP

EVs@THP的体内分布

a. 各组小鼠24 h内的活体成像荧光图像；b. 各组小鼠膀胱部位的荧光定量分析。ns，无显著差异；^****P < 0.000 1

a. in vivo fluorescence imaging of mice in each group within 24 h; b. quantitative fluorescence analysis of bladder tissues in each group. ns, not significant; ^****P < 0.000 1

2.4. EVs@THP的体内灌注治疗效果与生物相容性

为进一步评估EVs@THP的膀胱灌注治疗效果，将荷瘤小鼠随机分为3组进行治疗。超声检测结果（见图4a）显示，对照组荷瘤小鼠膀胱壁增厚粗糙且腔内可见明显突起生长的肿瘤；THP组膀胱充盈缺损有所改善，但腔内仍存在明显肿瘤突起；EVs@THP组膀胱腔内肿瘤显著消退，治疗效果明显优于其余两组。膀胱肿瘤组织H&E染色结果（见图4b）表明，对照组可见大量深染、异型性明显的肿瘤细胞；THP组与EVs@THP组肿瘤细胞数量均明显减少，其中EVs@THP组残留肿瘤细胞最少。解剖观察离体膀胱（见图4c）显示，对照组因肿瘤持续生长，膀胱较治疗组小鼠显著增大；相比之下，THP组与EVs@THP组膀胱体积、重量均显著降低，且EVs@THP组的改善效果更优（详细数据参见附件3）。以上结果充分证实，EVs@THP递送体系的体内治疗效果显著优于游离THP，其优势主要源于EVs介导的药物高效摄取作用。进一步通过组织学检查及血液学分析评估EVs@THP的体内生物相容性。治疗后，各组小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）H&E染色（见图4d）均未见明显病理损伤。血常规与血液生化检测结果表明，EVs@THP组小鼠WBC、AST、ALT、RBC、BUN、CREA等指标均处于正常范围（详细数据参见附件4）。上述结果证实，EVs@THP经膀胱灌注具有优异的体内生物相容性，具备良好的临床转化潜力。

图 4.

In vivo therapeutic effect of EVs@THP via intravesical perfusion

EVs@THP的体内灌注治疗效果

a. 超声观察各组膀胱肿瘤生长情况；b. 膀胱肿瘤组织H&E染色观察，标尺：20 μm；c. 治疗结束后各组离体膀胱；d. 主要脏器H&E染色，标尺：200 μm

a. growth of bladder tumors in each group observed by ultrasound; b. H&E staining observation of bladder tumor tissues, scale bar: 20 μm; c. isolated bladder tissues of each group after treatment; d. H&E staining of major organs, scale bar: 200 μm

3. 讨论

膀胱癌是全球十大常见恶性肿瘤之一，高复发率是其最显著的临床特征^[21-22]。膀胱癌患者需终身接受随访与反复治疗，医疗成本位居所有恶性肿瘤之首^[23]。规律膀胱灌注化疗虽可在一定程度上降低肿瘤复发风险，但膀胱腔内以糖胺聚糖层为主的黏膜屏障，结合肿瘤组织的致密排列，共同构成了药物渗透的主要障碍^[24-25]。同时，多数化疗药物对正常组织存在固有毒性，易引发严重毒副作用，且反复用药可诱导肿瘤耐药，这使得辅助性膀胱灌注治疗虽能杀伤残余肿瘤细胞，但复发率降幅不足5%^[26]。目前，多种黏液穿透型纳米粒已应用于肿瘤药物递送研究，但在原位膀胱癌动物模型中的实际治疗效果远未达预期^[27-29]。

EVs具有天然封装特性，可保护其内容物免受降解^[30-31]。EVs表面富含整合素、选择蛋白等多种膜蛋白，可通过与肿瘤细胞表面受体的特异性结合，实现对靶细胞的精准识别^[32-33]。利用EVs封装治疗药物并将其靶向转运至特定组织，有望在增强局部疗效的同时显著降低不良反应^[34]。本研究将化疗药物THP包载于膀胱癌MB49细胞来源的EVs中，成功构建EVs@THP药物递送体系，并将其应用于膀胱癌原位灌注治疗。研究结果显示，EVs@THP在MB49膀胱癌细胞中的摄取效率更高，肿瘤杀伤作用显著强于等剂量游离THP；在小鼠原位膀胱癌模型中，经膀胱灌注的EVs@THP展现出更优的肿瘤内渗透能力与滞留能力，可有效降低膀胱重量和体积、改善肿瘤浸润状态，治疗效果优于游离THP组。上述结果证实，MB49细胞来源的EVs可作为THP的有效递送载体，显著提升原位灌注化疗效果，为膀胱癌灌注治疗提供了新策略。

综上所述，EVs凭借其独特的生物学特性，展现出突破膀胱灌注治疗现有壁垒的巨大潜力。本研究不仅验证了EVs作为天然药物递送载体的可行性，更开辟了以EVs为载药平台开展膀胱灌注治疗的新方向。受限于动物模型特点^[35-37]，本研究尚未直接模拟TURBT术后的复发监测场景。未来临床转化需建立更贴近TURBT术后微小残留病灶及肿瘤再植过程的动物模型，以系统评价该递送体系在预防复发及改善远期预后方面的价值。此外，后续研究还应聚焦于多种化疗药物的负载优化及工程化EVs的长期开发，通过跨学科协作推动EVs从基础研究向临床应用转化，有望为膀胱癌患者提供兼具精准靶向性、高效穿透性和优异安全性的新一代灌注治疗方案。