Abstract
目的
明确4F-ABUTINACA的Δ9-四氢大麻酚（THC）样辨别刺激效应，并探讨4F-ABUTINACA慢性给药诱发类焦虑行为的潜在作用机制。
方法
取6只成年Sprague-Dawley雄性大鼠，通过药物辨别实验测定4F-ABUTINACA的THC样辨别刺激效应，并观察大麻素受体1（CB1受体）拮抗剂利莫那班对其辨别刺激效应的影响。另取48只大鼠适应性饲养5 d，随机分为溶剂对照组、4F-ABUTINACA小剂量组（0.3 mg/kg）和大剂量组（2.0 mg/kg），每组16只。连续腹腔注射溶剂或4F-ABUTINACA 15 d，分别在第21天（短期）或第40天（长期）通过旷场实验和高架十字迷宫实验评估大鼠类焦虑行为；通过免疫荧光法观察海马胶质细胞激活情况及抑制性突触标志物的表达变化；采用蛋白质印迹法检测海马突触可塑性相关蛋白质表达。
结果
大鼠形成稳定的THC（2.0 mg/kg）辨别反应，4F-ABUTINACA（2.0 mg/kg）能完全替代THC，且该辨别刺激效应可被利莫那班部分抑制。停药后短期，4F-ABUTINACA小剂量组在旷场实验中表现出类焦虑行为，大剂量组在旷场实验和高架十字迷宫实验中均出现类焦虑行为；停药后长期仅4F-ABUTINACA大剂量组在高架十字迷宫实验中表现出类焦虑行为。停药后短期4F-ABUTINACA小剂量和大剂量暴露均可引起海马神经炎症反应［离子钙结合适配分子1（IBA-1）阳性细胞数及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加］、突触受体表达改变［N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）2A、NMDAR2B水平降低，离子型谷氨酸受体AMPA亚型1（GluA1）水平升高，小剂量组突触小体相关蛋白25（SNAP25）水平亦降低］及抑制性突触损伤［桥尾蛋白水平降低，大剂量组囊泡γ氨基丁酸转运体（VGAT）水平亦降低］，且大剂量组部分改变更为显著；停药后长期4F-ABUTINACA小剂量组的神经炎症指标基本恢复，而大剂量组神经炎症反应持续存在（IBA-1阳性细胞数及GFAP表达仍增多），并伴有更广泛的突触损伤（NMDAR2A、NMDAR2B及SNAP25水平降低）和抑制性突触损伤。
结论
4F-ABUTINACA能通过激活CB1受体产生THC样辨别刺激效应，其慢性给药致大鼠产生类焦虑行为机制可能与海马小胶质细胞和星形胶质细胞标志物持续高表达及突触可塑性损伤有关。
Keywords: 合成大麻素, 4F-ABUTINACA, 类焦虑行为, 胶质细胞, 突触可塑性, Sprague-Dawley大鼠
Abstract
Objective
To elucidate the Δ9-tetrahydrocannabinol (THC)-like discrimina-tive stimulus effects of 4F-ABUTINACA and to investigate the potential mechanisms underlying anxiety-like behaviors induced by chronic 4F-ABUTINACA administration.
Methods
A THC drug discrimination procedure was employed in six adult male Sprague-Dawley rats to assess the THC-like discriminative stimulus effects of 4F-ABUTINACA and to observe the effects of the cannabinoid receptor type 1 (CB1 receptor) antagonist rimonabant on these effects. A separate cohort of 48 rats underwent 5 days of adaptive feeding and was randomly divided into three groups (n=16 per group): vehicle control group, 4F-ABUTINACA low-dose group (0.3 mg/kg), and 4F-ABUTINACA high-dose group (2.0 mg/kg). All rats received intraperitoneal injections of vehicle or 4F-ABUTINACA for 15 consecutive days. Anxiety-like behaviors were assessed using the open field test (OFT) and elevated plus maze (EPM) test on day 21 (short-term withdrawal) and day 40 (long-term withdrawal). Immunofluorescence staining was used to examine glial cell activation and changes in inhibitory synaptic markers in the hippocampus. Western blotting was performed to detect the expression of synaptic plasticity-related proteins in the rat hippocampus.
Results
After stable THC (2.0 mg/kg) discrimination was established, 4F-ABUTINACA (2.0 mg/kg) produced full substitution for THC, and this discriminative stimulus effect was partially inhibited by rimonabant. At short-term withdrawal, the low-dose 4F-ABUTINACA group exhibited anxiety-like behaviors in the OFT, whereas the high-dose group showed such behaviors in both the OFT and the EPM test; at long-term withdrawal, only the high-dose 4F-ABUTINACA group exhibited anxiety-like behaviors in the EPM test. At short-term withdrawal, both low-dose and high-dose 4F-ABUTINACA exposure induced hippocampal neuroinflammation [increased ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (IBA-1)-positive cell counts and glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression], altered synaptic receptors expression [decreased N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) 2A and NMDAR2B levels, increased glutamate receptor ionotropic AMPA type subunit 1 (GluA1) levels in both groups, as well as decreased synaptosome-associated protein 25 (SNAP25) levels in the low-dose group], and inhibitory synaptic damage [decreased gephyrin levels, with decreased vesicular GABA transporter (VGAT) levels also observed in the high-dose group], with some changes being more pronounced in the high-dose group. At long-term withdrawal, the neuroinflammatory indicators in the low-dose 4F-ABUTINACA group had largely recovered, whereas neuroinflammation persisted in the high-dose group (IBA-1-positive cell counts and GFAP expression remained elevated), accompanied by more extensive synaptic damage (decreased NMDAR2A, NMDAR2B, and SNAP25 levels) and inhibitory synaptic damage.
Conclusions
4F-ABUTINACA produces THC-like discriminative stimulus effects via CB1 receptor activation, suggesting that it has abuse liability. Chronic 4F-ABUTINACA administration induces anxiety-like behaviors in rats, and the underlying mechanism may involve sustained upregulation of microglial and astrocytic markers and impaired synaptic plasticity in the hippocampus.
Keywords: Synthetic cannabinoid, 4F-ABUTINACA, Anxiety-like behavior, Glial cells, Synaptic plasticity, Sprague-Dawley rats
合成大麻素是目前较为常见的新精神活性物质之一，具有获取易、成本低和常规尿检识别难等特点，在非法市场快速蔓延，其中毒及相关死亡事件频发，严重威胁公共卫生安全。我国查处涉嫌合成大麻素违法人员数量呈上升趋势［1］。深入探究合成大麻素滥用风险及可能作用机制，已成为当前禁毒科学研究领域的重要课题。
合成大麻素的精神活性主要由CB1受体和/或CB2受体介导。与天然大麻中的主要精神活性成分THC比较，多数合成大麻素对CB1受体表现出更高的亲和力和更强的激动效能，能引发更强烈的欣快感［2-3］。动物研究显示，合成大麻素JWH-018能使大鼠建立稳定的自身给药行为，在药物辨别实验中能完全替代THC，且这两种效应均能被CB1受体拮抗剂抑制［4-8］，提示合成大麻素具有THC样奖赏效应及辨别刺激效应，且这些效应主要由CB1受体介导。
合成大麻素滥用除可能导致成瘾行为外，亦常导致滥用者神经精神症状［9］。合成大麻素滥用者可出现急性焦虑、幻觉和认知功能障碍等精神症状，长期滥用更可增加精神分裂症等重性精神障碍的患病风险［10-11］。作为神经系统实现信息编码和储存的核心机制，神经突触可塑性的异常改变是焦虑、认知缺陷等精神疾病发生的关键环节［12］。研究显示，合成大麻素可直接影响突触可塑性［13］，还可能通过激活小胶质细胞引发神经炎症反应，进而破坏神经元-胶质细胞稳态，间接导致突触结构损伤和功能紊乱［14］。上述过程可能是合成大麻素滥用最终导致精神疾病发生的潜在病理学机制。
4F-ABUTINACA属于第四代合成大麻素，在我国多地查获的草本烟混合物及电子烟中检出［15］。有文献报道了4F-ABUTINACA与另一种合成大麻素MDMB-4en-PINACA联合使用导致死亡的案例［16］，提示4F-ABUTINACA滥用的危害。Luo等［17］发现，4F-ABUTINACA对CB1受体的亲和力高于JWH-018。前期研究发现，小剂量4F-ABUTINACA可使大鼠建立稳定自身给药行为［18］。然而，目前对4F-ABUTINACA是否具有THC样辨别刺激效应，能否诱发类焦虑行为及对突触可塑性的影响等尚未知。本研究通过药物辨别实验验证4F-ABUTINACA是否具有THC样辨别刺激效应，并探究CB1受体在此效应中的作用；通过慢性给予大鼠不同剂量的4F-ABUTINACA，结合旷场实验和高架十字迷宫实验评估4F-ABUTINACA致焦虑作用；最后，通过蛋白质印迹法和免疫荧光法检测关键脑区突触可塑性相关蛋白质表达变化及胶质细胞激活状态，旨在从行为、分子和细胞多层面系统揭示4F-ABUTINACA的滥用风险及潜在作用机制，为其临床干预提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1. 药物、试剂及仪器
4F-ABUTINACA、THC由公安部禁毒情报技术中心提供；利莫那班（rimonabant，HY-14136）为美国MedChemExpress公司产品。以上药物均溶解在含有1.5%乙醇和1.5%吐温-80的生理盐水中。蔗糖颗粒（253692）为美国Bio-Serv公司产品；SDS裂解液（P0013G）、双色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5×（P0015）、苯甲基磺酰氟（ST506）为中国上海碧云天生物技术有限公司产品；二甲苯（10023418）为中国上海沃凯生物技术有限公司产品；柠檬酸钠-EDTA抗原修复液（40×，BL637A）为中国北京兰杰柯科技有限公司产品；曲拉通X-100（T8200）、10×PBS缓冲液（G4202）、吐温-20（T8220）为中国北京索莱宝科技有限公司产品；牛血清白蛋白（abs9157）为中国上海爱必信生物科技有限公司产品；抗GFAP一抗（DF6040）为美国Affinity Biosciences公司产品；Alexa FluorTM 594偶联山羊抗兔IgG（H+L）（A-2534079）、Alexa FluorTM 488偶联山羊抗鼠IgG（H+L）（A-2534069）为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；含DAPI防淬灭封片剂（ab104139）、抗IBA-1一抗（ab178846）为英国Abcam公司产品；GluA1（13185）、GluA2（13607）、PSD95（3450）、NMDAR2A（4205）、NMDAR2B（4212）、β肌动蛋白（4967）为美国Cell Signaling Technology公司产品；VGAT（131 002）、桥尾蛋白（147 011）为德国Synaptic Systems公司产品；SNAP25（A2234）为中国武汉爱博泰克生物科技有限公司产品。
辨别训练笼为中国宁波安来科学仪器公司产品；徕卡冰冻切片机（CM1950S）为德国Wetzlar Leica Microsystems公司产品；奥林巴斯BX41荧光正置显微镜为日本Olympus株式会社产品。
1.2. 实验动物及分组干预
54只无特定病原体级Sprague-Dawley雄性大鼠购自浙江省实验动物中心，单笼饲养在温度［（23±1）℃］和湿度［（55±5）%］可控的房间中，光照/黑暗周期为12 h，所有行为研究都在光照期间进行。随机取6只大鼠进行药物辨别实验，实验周期内大鼠自由摄取水，每次实验结束后每天给予食物10~15 g。其余48只大鼠自由摄取水和食物，适应性饲养5 d后随机分为三组：溶剂对照组、4F-ABUTINACA小剂量组（0.3 mg/kg）和4F-ABUTINACA大剂量组（2.0 mg/kg），每组16只。三组每天腹腔注射1次，溶剂对照组注射等体积1.5%乙醇+1.5%吐温-80+生理盐水混合溶液（以下简称溶剂），另两组注射相应剂量4F-ABUTINACA，连续注射15 d。每组分别于第21、40 d各选取8只大鼠进行类焦虑行为测试，测试结束后立即处死并采集脑组织。每组随机选取3只大鼠脑组织进行蛋白质印迹法检测，另取3只大鼠脑组织进行免疫荧光法检测。实验流程见图1。
图1. 4F-ABUTINACA致大鼠类焦虑行为及作用机制实验流程图.
1.3. 药物辨别实验评估实验鼠辨别替代反应
6只大鼠置于隔音的辨别训练笼内，训练笼一侧操作面板设有左、右两个鼻触，对侧设置一个蔗糖颗粒投放口。箱内提示灯亮起表示训练开始，大鼠每次触碰任一鼻触（FR1）即可获得一颗蔗糖（45 mg）。以接受1 h训练或得到100次蔗糖奖赏为一个实验期，每天进行一个实验期的行为训练。在同一程序下连续2 d在30 min内获得100次蔗糖奖赏，FR值可增加1，训练程序由FR1逐渐递增至FR10（即大鼠连续触碰10次鼻触获得1颗蔗糖）。大鼠在FR10程序下能够稳定获取蔗糖颗粒时进行辨别训练。辨别训练中，设置一侧鼻触为THC相关有效鼻触，另一侧鼻触为溶剂相关有效鼻触。大鼠腹腔注射THC（2.0 mg/kg）或溶剂15 min后进入辨别笼训练，大鼠触碰给药相关的有效鼻触才能获得蔗糖颗粒奖赏。采用重复交替训练法，即药物/药物/溶剂/溶剂/药物/药物/溶剂/溶剂……，以四个实验期为一个训练周期。以大鼠在一个训练周期内辨别反应正确率80%及以上为合格，FR值依次递增至FR10，记录辨别反应正确率和辨别反应速率，其中辨别反应正确率为药物相关鼻触的反应数除以两个鼻触的总反应数，辨别反应速率为总反应数除以程序进行总时间，排除未在规定时间内获得100次奖励大鼠的数据。在FR10程序下，大鼠连续两个训练周期辨别反应正确率80%及以上，能够稳定辨别THC与溶剂后进入药物替代测试阶段。
依次腹腔注射THC（0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg）、4F-ABUTINACA（0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg）和溶剂15 min后进行替代测试。一个剂量测试完成后，大鼠重新进行FR10训练，待恢复基础值后进行下一个剂量测试，测试剂量由小剂量向大剂量依次递增。该测试中两侧鼻触均为有效鼻触，计算机自动记录大鼠两侧鼻触反应次数及测试完成时间。药物相关鼻触的辨别反应正确率80%及以上、>20%~<80%和20%及以下分别定义为完全、部分和无辨别刺激效应。
在THC（2.0 mg/kg）、4F-ABUTINACA（2.0 mg/kg）或溶剂注射前20 min，腹腔注射选择性CB1受体拮抗剂利莫那班（3.0 mg/kg）［5］，观察利莫那班预处理对大鼠识别THC和4F-ABUTINACA辨别刺激反应的影响。
1.4. 旷场实验和高架十字迷宫实验评估实验鼠类焦虑行为
旷场实验在一个长×宽×高为100 cm×100 cm×40 cm的实验箱中进行，由正上方红外摄像机监测大鼠运动。实验开始时，将一只大鼠轻柔置于实验箱中央，使其自由探索10 min，并全程录像记录。旷场区域被划分为25个等距的小格，中央的九个小格被指定为中央区域。通过ANY-maze软件自动追踪和定量分析大鼠在实验箱中的总运动距离、中央区域停留时间占总时间的百分比以及在中央区域运动距离占总距离的百分比。
高架十字迷宫由两个开放臂（长50 cm，宽10 cm）、两个闭合臂（长50 cm，宽10 cm，高30 cm）及中央区域（长10 cm，宽10 cm）组成，迷宫装置距离地面70 cm。将大鼠置于行为测试房间中适应30 min后再将其放在迷宫中央区域，头朝向开放臂方向，由正上方红外摄像机记录大鼠5 min内的运动轨迹。通过ANY-maze软件自动追踪和定量分析大鼠在迷宫中的总运动距离、开放臂停留时间占总时间的百分比以及开放臂运动距离占总距离的百分比。
1.5. 免疫荧光法观察实验鼠海马胶质细胞表达及抑制性突触相关蛋白质表达
使用注射用盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮混合物麻醉大鼠，暴露胸腔，经心脏灌注250 mL生理盐水后继续灌注200 mL 4%多聚甲醛，快速剥离全脑，将全脑在多聚甲醛中固定24 h，随后将全脑换到30%蔗糖溶液中脱水。待脑组织沉底后使用冰冻切片机将脑组织冠状切成20 μm的切片。将切片在含有0.3% Triton X-100和5%牛血清白蛋白的PBS中透化和封闭1 h。加入一抗抗GFAP抗体（1∶800）、抗IBA-1抗体（1∶1000）、抗VGAT抗体（1∶250）、抗桥尾蛋白抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜。第二天用PBS洗去一抗，在黑暗环境下用荧光二抗（1∶500）孵育1 h，然后用含DAPI的封片剂封片并用显微镜采集图像。
1.6. 蛋白质印迹法检测实验鼠海马突触可塑性相关蛋白质表达
采用注射用盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮混合物麻醉大鼠，快速断头分离海马，使用裂解缓冲液进行裂解，并在4 ℃下13 000×g离心20 min，收集上清液。用SDS-PAGE分离等量蛋白质，随后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与5%牛血清白蛋白溶液在室温下孵育1 h以阻断非特异性结合。将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜，所用一抗包括抗β肌动蛋白抗体（1∶10000）、抗NMDAR2A抗体（1∶1000）、抗NMDAR2B抗体（1∶1000）、抗GluA1抗体（1∶1000）、抗GluA2抗体（1∶1000）、抗PSD95抗体（1∶1000），以及抗SNAP25抗体（1∶1000）。一抗孵育结束后，用0.1% TBST洗涤膜15 min，然后与二抗（1∶1000）在室温下孵育1 h。最后使用Image J软件分析条带灰度值，以β肌动蛋白为内参，计算目的蛋白相对表达量。
1.7. 统计学方法
使用GraphPad Prism 9进行统计分析并作图，所有数据均以均数±标准误（
±
）表示。采用非配对t检验或双因素方差分析评估大鼠对不同药物的辨别反应正确率、辨别反应速率以及利莫那班对其的影响，并在交互作用具有统计学意义时采用Š
d
k检验进行组间多重比较；通过非线性回归拟合剂量-反应曲线计算ED50值。类焦虑行为检测、蛋白质印迹法及免疫荧光法数据采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey多重比较检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 实验鼠药物辨别实验结果
4F-ABUTINACA（2.0 mg/kg）、THC（2.0 mg/kg）处理后大鼠的辨别反应正确率均大于80%，表明4F-ABUTINACA能完全替代THC。4F-ABUTINACA和THC药物辨别反应曲线的ED50值分别为0.32 mg/kg（95%置信区间：0.21~0.48）和0.46 mg/kg（95%置信区间：0.31~0.68），两者差异无统计学意义（P>0.05）。与溶剂比较，4F-ABUTINACA和THC均未影响大鼠的辨别反应速率（均P>0.05）。见图2。
图2. 药物辨别反应正确率和辨别反应速率曲线（N=6）.
溶剂：1.5%乙醇+1.5%吐温-80+生理盐水混合溶液. THC：Δ9-四氢大麻酚.
在给予利莫那班预处理的条件下，溶剂处理后大鼠辨别反应正确率有升高趋势，THC和4F-ABUTINACA处理后大鼠辨别反应正确率均降低（均P<0.05），辨别反应速率差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表1。
表1.
有无利莫那班预处理实验鼠药物辨别实验结果比较（N=6）
| 测试药物 | 辨别反应正确率（%） | 辨别反应速率（次/s） | ||
|---|---|---|---|---|
| 无预处理 | 有预处理 | 无预处理 | 有预处理 | |
| 溶剂 | 2.223±0.981 | 19.560±15.570 | 0.683±0.069 | 0.620±0.038 |
| THC | 98.290±0.607* | 51.920±20.690# | 0.759±0.076 | 0.617±0.040 |
| 4F-ABUTINACA | 99.390±0.466* | 37.780±19.590# | 0.752±0.063 | 0.636±0.039 |
与溶剂比较，* P<0.05；与无预处理比较，# P<0.05. 溶剂：1.5%乙醇+1.5%吐温-80+生理盐水混合溶液. THC：Δ9-四氢大麻酚.
±
以上结果提示，4F-ABUTINACA具有THC样辨别刺激效应，且可能由CB1受体介导。
2.2. 大剂量4F-ABUTINACA慢性给药可诱导实验鼠类焦虑行为
停药后短期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组在旷场实验中总运动距离、中央区域停留时间占比和运动距离占比均下降（均P<0.05），而在高架十字迷宫实验中总运动距离、开放臂停留时间占比和运动距离占比差异无统计学意义（均P>0.05）；4F-ABUTINACA大剂量组在旷场实验和高架十字迷宫实验中各项指标均较溶剂对照组下降（均P<0.05）；与4F-ABUTINACA小剂量组比较，4F-ABUTINACA大剂量组旷场中央区域运动距离占比及高架十字迷宫实验中各项指标均下降（均P<0.05）。停药后长期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组仅高架十字迷宫实验总运动距离减少（P<0.05），4F-ABUTINACA大剂量组仅高架十字迷宫实验总运动距离和开放臂运动距离占比下降（均P<0.05）；与4F-ABUTINACA小剂量组比较，4F-ABUTINACA大剂量组开放臂运动距离占比下降（P<0.05）。见表2。上述结果提示，停药后短期内小剂量4F-ABUTINACA暴露即可诱导运动抑制及部分类焦虑行为；而大剂量4F-ABUTINACA暴露后，其对类焦虑行为的影响可能更为持久。
表2.
各组停药后短期和长期旷场实验和高架十字迷宫实验结果比较
| 组 别 | 短 期 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
|
旷场总运动 距离（m） |
中央区域停留 时间占比（%） |
中央区域运动 距离占比（%） |
迷宫总运动 距离（m） |
开放臂停留时 间占比（%） |
开放臂运动距 离占比（%） |
|
| 溶剂对照组 | 52.8±4.8 | 13.3±1.7 | 20.8±1.7 | 21.4±1.1 | 43.2±3.6 | 35.0±3.2 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 40.2±2.4* | 5.6±1.0* | 11.9±1.6* | 22.3±1.5 | 42.3±2.9 | 29.8±3.1 |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 34.5±2.5* | 2.2±0.4* | 4.5±1.2*# | 16.3±1.3*# | 16.6±4.3*# | 9.7±3.0*# |
| 组 别 | 长 期 | |||||
|
旷场总运动 距离（m） |
中央区域停留 时间占比（%） |
中央区域运动 距离占比（%） |
迷宫总运动 距离（m） |
开放臂停留时 间占比（%） |
开放臂运动距 离占比（%） |
|
| 溶剂对照组 | 43.6±2.6 | 14.3±4.9 | 17.6±3.3 | 23.6±2.3 | 41.5±4.1 | 33.5±3.8 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 36.8±2.7 | 4.9±0.7 | 11.7±1.2 | 13.4±1.4* | 37.5±6.4 | 29.4±5.6 |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 46.8±5.1 | 4.9±1.4 | 10.1±2.8 | 13.3±0.8* | 25.4±4.4 | 12.8±2.6*# |
与溶剂对照组比较，* P<0.05；与4F-ABUTINACA小剂量组比较，# P<0.05.
± ，n=8
2.3. 4F-ABUTINACA慢性给药导致实验鼠海马神经炎症反应
停药后短期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组和大剂量组海马齿状回、CA1区和CA3区的小胶质细胞标志物IBA-1阳性细胞数增多，星形胶质细胞标志物GFAP表达增加（均P<0.05）。值得注意的是，4F-ABUTINACA大剂量组齿状回GFAP表达水平高于4F-ABUTINACA小剂量组（P<0.05），说明大剂量药物诱导了更强烈的星形胶质细胞增生。停药后长期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组海马齿状回、CA1区及CA3区的IBA-1阳性细胞数和GFAP表达差异无统计学意义（均P>0.05）；4F-ABUTINACA大剂量组海马齿状回及CA3区IBA-1阳性细胞数均增多（均P<0.05），CA1区、CA3区GFAP表达均增加（均P<0.05）。且4F-ABUTINACA大剂量组在齿状回、CA1区及CA3区IBA-1阳性细胞数均多于4F-ABUTINACA小剂量组（均P<0.05）。见图3和表3。提示4F-ABUTINACA暴露短期内即可引发中枢神经系统的神经炎症反应，而大剂量长期暴露会持续触发中枢神经系统的神经炎症反应。
图3. 各组停药后短期和长期海马IBA-1阳性细胞和GFAP表达结果（免疫荧光法）.
停药后短期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小、大剂量组海马齿状回、CA1区、CA3区三个亚区IBA-1阳性细胞数增多，GFAP表达增加. 停药后长期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组三个亚区IBA-1阳性细胞数和GFAP表达相近；4F-ABUTINACA大剂量组齿状回、CA3区IBA-1阳性细胞数增多，CA1区、CA3区GFAP表达增加. 蓝色荧光指示细胞核，红色荧光指示GFAP，绿色荧光指示IBA-1. 标尺=100 μm. IBA-1：离子钙结合适配分子1；GFAP：胶质纤维酸性蛋白.
表3.
各组停药后短期和长期海马IBA-1阳性细胞数和GFAP表达比较
| 组 别 | 短期IBA-1阳性细胞数 | 短期GFAP（×10⁶） | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 齿状回 | CA1区 | CA3区 | 齿状回 | CA1区 | CA3区 | |
| 溶剂对照组 | 109.7±2.0 | 65.0±0.6 | 118.0±6.0 | 16.90±0.49 | 14.58±1.61 | 12.20±1.88 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 131.7±2.2* | 80.7±3.8* | 144.7±8.6* | 22.04±0.94* | 23.20±0.79* | 19.62±2.18* |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 144.7±0.3* | 91.3±3.4* | 148.0±1.2* | 25.89±1.27*# | 27.43±1.65* | 25.93±0.45* |
| 组 别 | 长期IBA-1阳性细胞数 | 长期GFAP（×10⁶） | ||||
| 齿状回 | CA1区 | CA3区 | 齿状回 | CA1区 | CA3区 | |
| 溶剂对照组 | 106.0±6.2 | 70.7±2.2 | 106.7±5.4 | 17.98±2.96 | 12.46±1.18 | 12.94±0.06 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 100.7±6.9 | 61.0±6.4 | 99.3±11.8 | 17.44±2.05 | 19.60±4.09 | 17.57±1.02 |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 131.7±2.9*# | 83.7±4.8# | 140.0±2.1*# | 23.77±1.58 | 26.67±0.91* | 23.22±2.09* |
与溶剂对照组比较，* P<0.05；与4F-ABUTINACA小剂量组比较，# P<0.05. IBA-1：离子钙结合适配分子1；GFAP：胶质纤维酸性蛋白.
± ，n=3
2.4. 4F-ABUTINACA慢性给药导致实验鼠海马突触损伤
停药后短期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组和大剂量组NMDAR2A、NMDAR2B表达水平均降低（均P<0.05），而GluA1表达水平均升高（均P<0.05）；4F-ABUTINACA小剂量组SNAP25表达水平降低（P<0.05）。停药后长期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组GluA2表达水平升高（P<0.05）；4F-ABUTINACA大剂量组NMDAR2A、NMDAR2B及SNAP25表达水平均降低（均P<0.05）。见图4和表4。结果提示，4F-ABUTINACA暴露短期内可能使突触受体快速代偿性重组，且大剂量4F-ABUTINACA暴露可能诱发长期突触损伤和海马突触功能障碍。
图4. 各组停药后短期和长期海马突触可塑性相关蛋白质表达电泳图.
NMDAR：N-甲基-D-天冬氨酸受体；GluA：离子型谷氨酸受体AMPA亚型；PSD95：突触后致密蛋白95；SNAP25：突触小体相关蛋白25；β-actin：β肌动蛋白.
表4.
各组停药后短期和长期海马突触可塑性相关蛋白质表达水平比较
| 组 别 | 短 期 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| NMDAR2A | NMDAR2B | GluA1 | GluA2 | PSD95 | SNAP25 | |
| 溶剂对照组 | 0.965±0.035 | 0.798±0.008 | 0.483±0.027 | 0.939±0.067 | 0.994±0.055 | 1.063±0.067 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 0.504±0.019* | 0.582±0.023* | 0.820±0.110* | 1.072±0.020 | 0.999±0.014 | 0.740±0.069* |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 0.371±0.059* | 0.530±0.070* | 0.806±0.040* | 0.914±0.005 | 0.854±0.030 | 0.998±0.052 |
| 组 别 | 长 期 | |||||
| NMDAR2A | NMDAR2B | GluA1 | GluA2 | PSD95 | SNAP25 | |
| 溶剂对照组 | 0.728±0.040 | 0.780±0.036 | 0.675±0.069 | 0.410±0.110 | 0.826±0.019 | 1.014±0.051 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 0.844±0.080 | 0.714±0.053 | 0.861±0.069 | 0.850±0.030* | 0.982±0.031 | 0.903±0.029 |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 0.280±0.066*# | 0.356±0.034*# | 0.803±0.089 | 0.661±0.094 | 0.572±0.101# | 0.658±0.067*# |
与溶剂对照组比较，* P<0.05；与4F-ABUTINACA小剂量组比较，# P<0.05. NMDAR：N-甲基-D-天冬氨酸受体；GluA：离子型谷氨酸受体AMPA亚型；PSD95：突触后致密蛋白95；SNAP25：突触小体相关蛋白25.
± ，n=3
2.5. 4F-ABUTINACA慢性给药导致实验鼠海马抑制性突触损伤
停药后短期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组海马齿状回、CA1区和CA3区三个亚区VGAT表达水平差异均无统计学意义（均P>0.05），齿状回和CA3区桥尾蛋白表达水平降低（均P<0.05）；4F-ABUTINACA大剂量组海马三个亚区VGAT和桥尾蛋白表达水平均降低（均P<0.05）。停药后长期，与溶剂对照组比较，4F-ABUTINACA小剂量组齿状回VGAT表达水平降低（P<0.05），三个亚区桥尾蛋白表达水平均降低（均P<0.05）；4F-ABUTINACA大剂量组齿状回和CA3区VGAT表达水平均降低（均P<0.05），三个亚区桥尾蛋白表达水平均降低（均P<0.05）。见图5和表5。结果提示，4F-ABUTINACA暴露可破坏海马的抑制性突触，可能引发长期广泛性海马抑制性突触损伤，且大剂量暴露的影响更为广泛。
图5. 各组停药后短期和长期海马抑制性突触相关蛋白质表达结果（免疫荧光法）.
停药后短期，4F-ABUTINACA小剂量组海马齿状回、CA1区和CA3三个亚区VGAT表达与溶剂对照组相近，齿状回、CA3区桥尾蛋白表达减弱，4F-ABUTINACA大剂量组三个亚区VGAT和桥尾蛋白表达均减弱；停药后长期，4F-ABUTINACA小剂量组齿状回VGAT及三个亚区桥尾蛋白表达减弱，4F-ABUTINACA大剂量组齿状回、CA3区VGAT及三个亚区桥尾蛋白表达均减弱. 蓝色荧光指示细胞核，红色荧光指示桥尾蛋白，绿色荧光指示VGAT. 标尺=20 μm. VGAT：囊泡γ氨基丁酸转运体.
表5.
各组停药后短期和长期海马抑制性突触相关蛋白质表达比较
| 组 别 | 短期VGAT | 短期桥尾蛋白 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 齿状回 | CA1区 | CA3区 | 齿状回 | CA1区 | CA3区 | |
| 溶剂对照组 | 37.47±0.56 | 25.40±0.40 | 26.05±0.52 | 28.69±2.01 | 26.05±1.40 | 30.69±0.40 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 30.02±3.09 | 23.47±1.21 | 24.26±1.49 | 21.65±0.27* | 22.51±1.15 | 23.70±1.31* |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 22.02±1.43* | 15.79±0.32*# | 19.07±0.85*# | 21.80±0.99* | 15.57±1.13*# | 24.37±0.56* |
| 组 别 | 长期VGAT | 长期桥尾蛋白 | ||||
| 齿状回 | CA1区 | CA3区 | 齿状回 | CA1区 | CA3区 | |
| 溶剂对照组 | 34.51±0.89 | 23.21±0.50 | 23.35±0.84 | 35.55±0.81 | 27.71±0.18 | 33.44±0.56 |
| 4F-ABUTINACA小剂量组 | 27.10±1.22* | 19.69±0.90 | 18.93±1.05 | 27.81±1.17* | 21.82±0.90* | 28.60±0.70* |
| 4F-ABUTINACA大剂量组 | 22.51±1.67* | 18.53±3.33 | 18.65±1.27* | 20.01±1.27*# | 21.76±1.97* | 25.07±0.59*# |
与溶剂对照组比较，* P<0.05；与4F-ABUTINACA小剂量组比较，# P<0.05. VGAT：囊泡γ氨基丁酸转运体.
×10⁶， ± ，n=3
3. 讨论
药物辨别实验的核心原理在于检验受试药物能否引发与训练药物（如已知滥用药物）相似的辨别刺激效应。本文资料显示，4F-ABUTINACA通过激活中枢CB1受体可完全替代THC，且两者ED50值相当，提示4F-ABUTINACA可能具有THC类似的滥用风险。Gatch等［19］发现4-CN-CUMYL-BUTINACA、4F-MDMB-BINACA、5F-CUMYL-P7AICA和EMB-FUBINACA等合成大麻素均能完全替代THC，但此效应可被利莫那班抑制［5］。这些证据共同表明，尽管不同的合成大麻素化学结构存在差异，但其通过激活CB1受体都能产生相似的辨别刺激效应。
基于Luo等［17］报道的4F-ABUTINACA在条件性位置偏爱实验中所呈现的“小剂量奖赏-大剂量厌恶”这一双相剂量效应，本研究选取不同剂量4F-ABUTINACA进行慢性给药，发现不同剂量4F-ABUTINACA诱导类焦虑作用的效应存在差异，这一结果与其他合成大麻素的研究一致，如合成大麻素MAM-2201、AB-FUBINACA和AB-CHMINACA同样仅在大剂量下诱导类焦虑行为［20-21］。这可能与大剂量合成大麻素诱发特定神经突触发生持久的适应性改变有关。
胶质细胞的异常活化及其介导的神经炎症是焦虑障碍的重要病理学机制之一［22-24］。其中小胶质细胞和星形胶质细胞之间可能通过Wnt信号通路等途径共同协调突触重塑过程［25］，提示胶质细胞异常活化是神经炎症和突触功能障碍的关键结点。胶质细胞持续活化是合成大麻素神经毒性的突出特征［26-27］。本文资料中4F-ABUTINACA暴露致大鼠海马胶质细胞表达增加，与JWH-018和AB-CHMINACA等合成大麻素诱发胶质细胞增生及炎症反应的研究结果一致［26-27］。
本文资料显示，4F-ABUTINACA慢性给药后大鼠海马兴奋性突触关键蛋白表达改变，这与其他合成大麻素（如JWH-018、AB-FUBINACA）损害NMDAR功能及突触完整性的报道一致［28-29］。在抑制性突触方面，囊泡GABA转运体VGAT和支架蛋白桥尾蛋白表达也减少，提示GABA能传递的前后环节可能同时受损。这种兴奋性和抑制性突触系统同步损伤很可能共同导致海马局部神经环路的兴奋-抑制失衡，而兴奋-抑制失衡也常被认为是焦虑等情绪障碍的核心病理生理学机制［30］。
综上，4F-ABUTINACA可通过激活CB1受体产生THC样辨别刺激效应，其慢性给药致大鼠类焦虑行为的机制可能与海马胶质细胞持续激活及突触可塑性损伤有关。本文资料为认识4F-ABUTINACA的滥用危害及深入理解合成大麻素的神经毒性机制提供了理论依据。但本研究仍存在局限性：仅使用成年雄性大鼠，未能考察药物效应的性别差异，也未探讨青春期这一易感窗口期4F-ABUTINACA暴露可能产生的影响；此外，胶质细胞活化与特定突触损伤之间的因果关系，以及由此导致的兴奋-抑制平衡改变在电生理和行为学层面的直接证据仍有待进一步验证。
Supplementary information
本文附加文件见电子版。
［缩略语］
大麻素受体（cannabinoid receptor，CB受体）；Δ9-四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，THC）；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）；胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）；4 ，6-二脒基-2-苯基吲哚（4 ，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）；离子钙结合适配分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA-1）；离子型谷氨酸受体AMPA亚型（glutamate receptor ionotropic AMPA type，GluA）；突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）；N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）；囊泡γ氨基丁酸转运体（vesicular GABA transporter，VGAT）；突触小体相关蛋白25（synaptosome-associated protein 25，SNAP25）；固定比例（fixed ratio，FR）；含吐温-20的Tris缓冲液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）；半数有效量（median effective dose，ED50）
志谢
本研究得到国家自然科学基金（82471516）、宁波市公益性科技计划（2024S025）和宁波市医疗卫生高端团队重大攻坚项目（2022030410）支持
Acknowledgements
This study was supported by National Natural Science Foundation of China (82471516), Ningbo Public Welfare Science and Technology Program (2024S025), and Ningbo Top Medical and Health Research Program (2022 030410)
作者贡献
史宝宝、王海涛、周文华和赖苗军参与论文选题和设计或参与资料获取、分析或解释，起草研究论文或修改重要智力性内容. 所有作者均已阅读并认可最终稿件，并对数据的完整性和安全性负责. 具体见电子版
数据可用性
本研究的相关数据可根据合理请求从通信作者（E-mail：micklai80@163.com）处获得
Data Availability
All relevant data supporting the findings of this study can be accessed upon reasonable request from the corresponding author at micklai80@163.com
医学伦理
本研究遵循国家和宁波大学附属康宁医院有关实验动物管理和使用的规定，通过宁波大学附属康宁医院实验动物伦理委员会审查（KY-2024-08）
Ethical Approval
All applicable national guidelines and Affiliated Kangning Hospital of Ningbo University regulations for the care and use of animals were followed, and the research protocol of animal experiments was approved by the Animal Ethics Committee of Affiliated Kangning Hospital of Ningbo University (KY-2024-08)
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突. 本文由至少两名编委以外的同行专家评审，最终决定由与作者无利益冲突的其他编委作出
Conflict of Interests
The authors declare that there is no conflict of interests. The manuscript was assigned to at least two independent outside reviewers, and the decision was made by other Editorial Board Members who do not have conflicts of interests with the authors
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