A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in Wistar rats

Rodrigo de las Heras Kozma; Edson Marcelino Alves; Valter Abraão Barbosa-de-Oliveira; Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos Lopes; Renan Cenize Guardia; Henrique Vivi Buzo; Carolina Arruda de Faria; Camila Yamashita; Manzelio Cavazzana, Júnior; Fernando Frei; Maria José de Oliveira Ribeiro-Paes; João Tadeu Ribeiro-Paes

doi:10.1590/S1806-37132014000100007

. 2014 Jan-Feb;40(1):46–54. doi: 10.1590/S1806-37132014000100007

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A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in Wistar rats^{^*}^,^{^**}

Rodrigo de las Heras Kozma ¹, Edson Marcelino Alves ², Valter Abraão Barbosa-de-Oliveira ³, Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos Lopes ⁴, Renan Cenize Guardia ⁵, Henrique Vivi Buzo ⁶, Carolina Arruda de Faria ⁷, Camila Yamashita ⁸, Manzelio Cavazzana Júnior ⁹, Fernando Frei ¹⁰, Maria José de Oliveira Ribeiro-Paes ¹¹, João Tadeu Ribeiro-Paes ¹²

PMCID: PMC4075926 PMID: 24626269

Abstract

OBJECTIVE:

To describe a new murine model of cigarette smoke-induced emphysema.

METHODS:

Twenty-four male Wistar rats were divided into two groups: the cigarette smoke group, comprising 12 rats exposed to smoke from 12 commercial filter cigarettes three times a day (a total of 36 cigarettes per day) every day for 30 weeks; and the control group, comprising 12 rats exposed to room air three times a day every day for 30 weeks. Lung function was assessed by mechanical ventilation, and emphysema was morphometrically assessed by measurement of the mean linear intercept (Lm).

RESULTS:

The mean weight gain was significantly (approximately ten times) lower in the cigarette smoke group than in the control group. The Lm was 25.0% higher in the cigarette smoke group. There was a trend toward worsening of lung function parameters in the cigarette smoke group.

CONCLUSIONS:

The new murine model of cigarette smoke-induced emphysema and the methodology employed in the present study are effective and reproducible, representing a promising and economically viable option for use in studies investigating the pathophysiology of and therapeutic approaches to COPD.

Keywords: Tobacco smoke pollution; Emphysema; Disease models, animal; Equipment and supplies

Introduction

Worldwide, COPD is an important public health problem, having a high prevalence and carrying high socioeconomic costs. It is currently the fourth leading cause of death worldwide, and estimates indicate that it will be the third by 2020.⁽¹^,²⁾

Within the COPD spectrum, emphysema is defined as airspace enlargement distal to terminal bronchioles, accompanied by alveolar wall destruction, without significant fibrosis. Oxidative lung injury and inflammation in response to irritants (such as air pollution and cigarette smoke) speed up functional and morphological changes, gradually limiting gas exchange.⁽²^-⁴⁾

Given that treatment is limited to palliative care, animal models are central to studies investigating the pathophysiology of COPD and new therapeutic approaches to the disease. Emphysema can be experimentally induced by the use of proteases, by exposure to cigarette smoke, and by genetic manipulation.⁽³^-⁹⁾

Although animal models of enzyme-induced emphysema constitute an interesting methodological approach, they do not accurately reproduce the mechanisms of alveolar destruction resulting from smoke inhalation in human patients. Proteolytic activity leads to a significant increase in airspace size, not reproducing the sequence of pathological events characteristic of emphysema in humans.⁽⁶^,¹⁰⁾ Animal models of cigarette smoke-induced emphysema are used in an attempt to reproduce human disease, especially the pathophysiological mechanisms involved in the natural history of emphysema. ⁽⁶^,¹¹⁾ However, the duration of smoke exposure and the number of cigarettes used vary widely across models. In general, the most effective results are obtained with chronic exposure periods (> 6 months).⁽⁶^,¹²⁾

The objective of the present study was to describe a new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema. The model involves Wistar rats and an apparatus developed in the Laboratory of Genetics and Cell Therapy of the Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages, located in the city of Assis, Brazil. The model can contribute to a better understanding of the pathophysiological processes in COPD, as well as to the development of new treatment strategies.

Methods

A total of 24 male Wistar rats (age, 12 weeks; weight, 400-450 g) were divided into two groups: the cigarette smoke group, comprising 12 rats exposed to smoke from 12 commercial filter cigarettes (Derby Vibrante; Souza Cruz SA, Rio de Janeiro, Brazil)-containing 0.8 mg of nicotine, 10 mg of tar, and 10 mg of carbon monoxide (CO)-for three 1-h exposure periods (from 8:00 a.m. to 9:00 a.m., from 12:00 p.m. to 1:00 p.m., and from 6:00 p.m. to 7:00 p.m.) every day for 30 weeks; and the control group, comprising 12 rats exposed to room air for three 1-h exposure periods every day for 30 weeks. During each exposure period, the rats in the cigarette smoke group were exposed to smoke from 4 cigarettes for 15 min, followed by a 5-min rest period (during which room air was delivered to prevent hypoxia). During each 15-min period of exposure, the smoking apparatus was set to cycle with cigarette-suction periods of 10 s and rest periods of 15 s.

The apparatus consists of an animal containment system and a cigarette smoking device (Figure 1). The animal containment system comprises four metal cages (24 cm × 17 cm × 15 cm) closed at the top. The four cages are placed equidistant from each other inside a hermetically sealed acrylic box (70 cm × 70 cm × 20 cm). Four large rats or 16 mice can be placed in each cage. Two apparatuses were used in the present study: one for the animals in the cigarette smoke group and one for the animals in the control group. Each apparatus was placed in a separate room. The cigarette smoke delivery system consists of an external cigarette holder connected to a dynamic suction pump by a flexible hose. The pump can be programmed to alternate between periods of cigarette suction and periods of clean air suction, to prevent asphyxia. The pump generates negative pressure, which forces the air through a lit-up cigarette, generating cigarette smoke and pushing it toward the hose and into the acrylic box. The concentration of CO in the containment system was assessed by means of a CO meter (ToxiPro^(r) Single Gas Detector; Honeywell Analytics Distribution Inc., Lincolnshire, IL, USA) and was found to be 350-400 ppm during the exposure periods.

All animals were weighed weekly on an analytical scale. For standardization purposes, all animals were weighed on the same day of the week and at the same time of day.

Lung function was assessed by means of a ventilator for small animals (flexiVent^TM; SCIREQ, Montreal, QC, Canada). After 30 weeks of daily exposure to mainstream cigarette smoke or room air, the animals were anesthetized by intraperitoneal injection of 250 mg/kg of Thiopentax^(r) (Cristália - Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Itapira, Brazil) and tracheostomized with a 20-G catheter connected to the ventilator, which was set to a tidal volume of 10 mL/kg, an RR of 120 breaths/min, and a positive end-expiratory pressure of 3 cmH₂O. Muscle paralysis was induced by intraperitoneal injection of pancuronium bromide (1 mg/kg). Lung function was expressed as airway resistance (Raw), respiratory system resistance, respiratory system compliance (Crs), tissue damping, and tissue elastance.

After mechanical evaluation of the respiratory system, the animals were euthanized and the lungs were removed. The trachea was cannulated and attached to the perfusion apparatus, the lungs being incubated in 4% paraformaldehyde solution for 24 h and kept inflated with sustained positive pressure (20 cmH₂O). The lung tissue was cut into 5-µm sections and stained with H&E for histological evaluation.

Emphysema was assessed by measurement of the mean linear intercept (Lm), in µm, as proposed by Weibel.⁽¹³⁾ After fixation, each lung was cut into four sagittal sections. The sections were embedded in a single paraffin block, and each block was cut into three 5-µm sections, three slides being therefore prepared for each block. For each slide, ten randomly selected nonoverlapping fields were examined under light microscopy (magnification, ×400).

The results were analyzed by means of the Student's t-test and one-way ANOVA. In order to test the assumptions of normal distribution and homogeneity of variance, we performed the Shapiro-Wilk test and Levene's test. When the assumptions were not met, we used the Mann-Whitney test and Kruskal-Wallis ANOVA. For all tests, values of p < 0.05 were considered significant. The study project was approved by the Animal Research Ethics Committee of the Julio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages (Protocol no. 001/2011).

Results

As can be seen in Figure 2, there were no significant differences between the rats in the cigarette smoke group and those in the control group in terms of their initial weight. From the second week of exposure onward, the mean weight gain was lower in the cigarette smoke group than in the control group. There was a significant difference (p < 0.05) between the two groups regarding weight gain after the third week of exposure. After 30 weeks of exposure, the mean weight gain was 212.00 ± 83.40 g in the control group and 44.92 ± 43.40 g in the cigarette smoke group, the mean weight gain in the cigarette smoke group corresponding to 21.2% of that in the control group.

As can be seen in Table 1, the values of Raw, tissue damping, respiratory system resistance, Crs, and tissue elastance were higher in the cigarette smoke group than in the control group. However, there was no significant difference between the two groups in terms of the respiratory parameters analyzed, which is probably due to the high variation among subjects in the same group (as evidenced by the high SD values).

Table 1. Airway resistance, respiratory system resistance, tissue damping, tissue elastance, and respiratory system compliance in Wistar rats exposed to cigarette smoke (the cigarette smoke group) and in those exposed to room air (the control group).

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Figure 3A shows the Lm for the right and left lungs in combination (for each group), and Figure 3B shows the Lm for the right and left lungs in isolation (for each group). As can be seen in Figure 3, there was a statistically significant difference in the Lm between the cigarette smoke group and the control group. When we analyzed the right and left lungs in combination, we found that the Lm was 25.0% higher in the cigarette smoke group than in the control group (Figure 3A). When the right and left lungs were analyzed separately, the Lm for the left lung was found to be 15.8% higher in the cigarette smoke group than in the control group (Figure 3B). Similarly, the Lm for the right lung was found to be 32.3% higher in the cigarette smoke group than in the control group (Figure 3B). These results suggest a difference in the degree of airspace enlargement between the right and left lungs in the cigarette smoke group. Alveolar septal destruction was significantly greater in the cigarette smoke group than in the control group, showing airspace enlargement resulting from increased lung parenchymal destruction in the cigarette smoke group, as assessed qualitatively by H&E staining of histological sections (Figure 4).

Discussion

Cigarette smoke-induced emphysema has been studied under various experimental conditions. ⁽⁵^,⁶^,¹¹^,¹²^,¹⁴^,¹⁵⁾ Although some questions remain regarding the duration of exposure and the number of cigarettes used, animal models of cigarette smoke-induced emphysema are the experimental models that best mimic the clinical features of pulmonary emphysema in human patients and constitute an important tool in the study of the pathophysiological aspects of the disease.⁽⁶⁾

Although animal models of cigarette smoke-induced emphysema have been used in several studies, only a few smoke exposure systems are commercially available, including the Cigarette Smoke Generator^(r) (TSE Systems, Inc., Chesterfield, MO, USA), the TE-2 Smoking Machine^(r) (Teague Enterprises, Woodland, CA, USA), and the inExpose^TM (SCIREQ). All have similar characteristics, consisting of a cigarette smoke generator and an animal exposure chamber, where animals are confined and exposed to cigarette smoke (via whole-body or nose-only exposure).⁽¹¹^,¹²^,¹⁵^,¹⁶⁾ They all cost approximately US$ 75,000.00), which is approximately twenty times the final cost of our apparatus (i.e., US$ 3,000.00).

Several features of our apparatus are similar to those of commercially available systems used in previous studies.⁽¹¹^,¹²^,¹⁵^,¹⁶⁾ One interesting feature is that animals are exposed to cigarette smoke via whole-body exposure. Another feature is that the smoke that is pumped into the exposure chamber is generated by the puffing of a cigarette, as occurs during actual smoking. Like other systems on the market, our apparatus allows us to regulate the suction power and the time of cigarette suction, alternating with periods of air suction, by means of a timer. The main advantages of our apparatus over commercially available devices include its low cost, simple design, and ease of installation, as well as the fact that it can be assembled from commercially available parts, such as a suction pump and a timer (to regulate the cigarette-suction and air-suction times, as described in the Methods section). In addition, the cost of our apparatus is 20 times lower than is that of commercially available devices.

The 30-week period of exposure employed in our study was based on a search for a model that offers greater reproducibility with respect to time. Previous studies of cigarette smoke-induced emphysema (employing different apparatuses) have reported exposure periods of 8-36 weeks. Although exposure periods of 6 months are common in animal model studies,⁽¹²^,¹⁵^-¹⁸⁾ exposure periods of up to 9 months have also been used.⁽¹²^,¹⁹⁾

In some protocols, animals are exposed to cigarette smoke 3-5 days a week, which is not enough to simulate daily smoking.⁽¹⁰^,¹⁵^,¹⁸^-²⁰⁾ The duration of daily exposure varies widely across studies.⁽¹²^,²¹^,²²⁾ Li et al. adopted a two-step exposure protocol whereby animals were initially exposed to smoke from 8 cigarettes twice a day for 2 weeks (weeks 1 and 2) and subsequently exposed to smoke from 15 cigarettes three times a day for another 10 weeks (weeks 3-12).⁽²³⁾ The animal model used in the present study simulates the pathophysiological conditions of active smoking, animals having been exposed to mainstream cigarette smoke daily (7 days a week) for 30 weeks.

There are no studies involving a comparative morphometric analysis of alveolar damage in the right and left lungs. Comparative morphometric analysis is relevant because it allows the demonstration of the heterogeneity of parenchymal destruction in experimentally induced emphysema. Anatomical differences between the right and left lungs of rats provide a possible explanation for the results obtained. According to Cataneo and Reibscheid,⁽²⁴⁾ the rat trachea shows a deviation to the right, and the rat bronchi are similar to the human bronchi (i.e., short and large). The right bronchus appears to be a continuation of the trachea, whereas the left bronchus looks like a branch.⁽²⁴⁾ Therefore, it is possible that the right lung was more consistently exposed to cigarette smoke, which resulted in intense neutrophil and macrophage activation and increased secretion of proteases responsible for lung parenchymal destruction. These anatomical differences can explain why the Lm was higher in the right lung than in the left lung in the group of rats exposed to cigarette smoke.

Although functional testing is a valuable tool for assessing the development of emphysema in experimental models, it is less sensitive than morphometric analysis, which is more accurate in the assessment of parenchymal damage. Animals with moderate emphysema usually have normal functional values when compared with healthy animals, whereas animals with severe disease show significant changes in respiratory parameters.⁽⁶⁾ This has been reported by other research groups. Foronjy et al.⁽²⁵⁾ exposed two strains of C57 mice to cigarette smoke for 6 months or 12 months and observed a significant increase in the Lm in comparison with the respective control groups. Nevertheless, there were no significant differences between the exposed animals and the respective control groups regarding the respiratory parameters. According to Wright et al.,⁽⁶⁾ animals with moderate emphysema usually show borderline or normal functional values when compared with healthy animals; animals with advanced disease are the only ones that show significant changes in the respiratory parameters.

The results of the present study showed no significant differences in Raw or Crs between the animals in the cigarette smoke group and those in the control group. However, there was a trend toward increased Raw in the cigarette smoke group. The species under study plays a relevant role in the results of mechanical ventilation. Although Wistar rats allow researchers to perform a series of functional analyses, they are more resistant to the development of emphysema than are other rodent species.⁽⁶⁾ From a pathophysiological standpoint, the disease can be milder in rats; this can complicate the comparison of functional parameters between animals that were exposed and unexposed to cigarette smoke.⁽⁶⁾ This empirical finding can explain the results of the present study, which showed no statistically significant differences between the two groups of rats regarding the functional parameters assessed (Table 1), despite the morphometric evidence of emphysema (i.e., the Lm), as shown in Figure 3.

COPD can be considered a systemic disease, being characterized by skeletal changes, weakness, muscle dysfunction, and weight loss, which is due to oxidative stress and reduced caloric intake. ⁽²¹^,²⁶^,²⁷⁾ In smokers with COPD, nicotine increases satiety and reduces food intake,⁽²⁸⁾ smoking therefore contributing to weight loss, worsening emphysema, and generating a feedback circuit. Previous studies have shown that cigarette smoke can change hypothalamic appetite regulation in the central nervous system.⁽¹²^,²⁸^,²⁹⁾ Mineur et al.⁽²⁸⁾ demonstrated that nicotine decreases food intake and body weight.

The inflammatory process is a fundamental component of the pathophysiology of COPD. Inflammation and other systemic effects of emphysema were not assessed in the present study, given that our main objective was to evaluate the feasibility of a new murine model of cigarette smoke-induced pulmonary emphysema. Other studies are currently under way in our laboratory, involving analysis of the lung for the presence of metalloproteinases 9 and 12, which play an important role in the inflammatory process,⁽³⁾ and assessment of inflammatory cells in BAL fluid from animals exposed and unexposed to cigarette smoke.

The sharp weight loss observed in the present study was not due to the exposure period, given the statistically significant difference between the cigarette smoke group and the control group as of the third week of exposure (Figure 2). The animals in the control group showed a mean weight gain of 212.0 ± 83.40 g, whereas those in the cigarette smoke group showed a mean weight gain of 44.92 ± 43.40 g, which corresponded to 21.2% of that in the control group. Our results also showed a large standard deviation regarding the mean weight gain of the exposed animals after 30 weeks (44.92 ± 43.40 g). These results might be due to the intensity of exposure to cigarette smoke in the present study, which resulted in pulmonary changes and widespread pathophysiological changes. As noted above, COPD should be considered a systemic disease, as in a feedback circuit in which the side effects of smoke exposure determine morphological and functional changes in the lung. These changes reflect and are aggravated by the systemic effects of nicotine and the large number of toxic substances in cigarette smoke and other air pollutants.

The results of the present study indicate that mainstream cigarette smoke leads to decreased weight gain and development of emphysema in exposed animals, as assessed by morphometric analysis (i.e., the Lm). The methodology employed in the present study is feasible, and the new apparatus is effective for use in animal models of cigarette smoke-induced emphysema. This new murine model of cigarette smoke-induced emphysema is a promising and economically viable option for use in studies investigating the pathophysiology of and therapeutic approaches to COPD.

Acknowledgments

The authors thank José Ricardo Sousa at the Faculdades Integradas Padre Albino (FIPA, Padre Albino Integrated Colleges) for his technical support.

Footnotes

Study carried out at the Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages, Assis, Brazil.

^**

A versão completa em português deste artigo está disponível em www.jornaldepneumologia.com.br

Contributor Information

Rodrigo de las Heras Kozma, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.

Edson Marcelino Alves, Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages, Assis, Brazil.

Valter Abraão Barbosa-de-Oliveira, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.

Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos Lopes, Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University, Botucatu, Brazil.

Renan Cenize Guardia, Faculdades Integradas Padre Albino, Catanduva, Brazil.

Henrique Vivi Buzo, Faculdades Integradas Padre Albino, Catanduva, Brazil.

Carolina Arruda de Faria, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.

Camila Yamashita, Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages, Assis, Brazil.

Manzelio Cavazzana, Júnior, Faculdades Integradas Padre Albino, Catanduva, Brazil.

Fernando Frei, Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages, Assis, Brazil.

Maria José de Oliveira Ribeiro-Paes, Faculdades Integradas Padre Albino, Catanduva, Brazil.

João Tadeu Ribeiro-Paes, Júlio de Mesquita Filho São Paulo State University at Assis School of Sciences and Languages, Assis, Brazil.

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J Bras Pneumol. 2014 Jan-Feb;40(1):46–54. [Article in Portuguese]

Um novo modelo experimental murino de enfisema: enfisema induzido pela fumaça do cigarro em ratos Wistar^{^*}

Abstract

OBJETIVO:

Descrever um novo modelo murino de enfisema induzido pela fumaça de cigarro.

MÉTODOS:

Vinte e quatro ratos Wistar foram divididos em dois grupos: o grupo fumaça de cigarro, com 12 ratos expostos à fumaça de 12 cigarros comerciais com filtro três vezes ao dia (um total de 36 cigarros por dia), sete dias por semana, durante 30 semanas e o grupo controle, com 12 animais expostos ao ar ambiente três vezes ao dia, sete dias por semana, durante 30 semanas. A função pulmonar foi avaliada por meio de ventilação mecânica, e o enfisema foi morfometricamente avaliado por meio do diâmetro alveolar médio (Lm).

RESULTADOS:

A média de ganho de peso foi significativamente menor (aproximadamente dez vezes menor) no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle. O Lm foi 25.0% maior no grupo fumaça de cigarro. Os parâmetros de função pulmonar tenderam a ser piores no grupo fumaça de cigarro.

CONCLUSÕES:

O novo modelo murino de enfisema induzido pela fumaça de cigarro e a metodologia empregada neste estudo são eficazes e reproduzíveis; são, portanto, uma opção promissora e economicamente viável para estudos sobre a fisiopatologia e o tratamento da DPOC.

Keywords: Poluição por fumaça de tabaco, Enfisema, Modelos animais de doenças, Equipamentos e provisões

Introdução

A DPOC é um importante problema de saúde pública em todo o mundo; sua prevalência e custos socioeconômicos são elevados. É atualmente a quarta causa de morte em todo o mundo, e as estimativas indicam que, até 2020, será a terceira.⁽¹^,²⁾

Dentro do espectro da DPOC, o enfisema é definido como o aumento dos espaços aéreos distais aos bronquíolos terminais, acompanhado de destruição das paredes alveolares, sem fibrose significativa. A lesão pulmonar oxidativa e a inflamação em resposta a irritantes (tais como a poluição do ar e a fumaça do cigarro) aceleram alterações funcionais e morfológicas e gradualmente limitam as trocas gasosas.⁽²^-⁴⁾

Como o tratamento se resume a cuidados paliativos, os modelos animais são fundamentais para estudos sobre a fisiopatologia e novas formas de tratamento da DPOC. O enfisema pode ser induzido experimentalmente por proteases, por exposição à fumaça do cigarro e por manipulação genética.⁽³^-⁹⁾

Embora constituam um método interessante, os modelos animais de enfisema induzido por enzimas não reproduzem de forma precisa os mecanismos da destruição alveolar causada pela inalação de fumaça em seres humanos. A atividade proteolítica gera um aumento significativo do tamanho dos espaços aéreos, sem reproduzir a sequência de eventos patológicos característicos do enfisema em seres humanos.⁽⁶^,¹⁰⁾ Modelos animais de enfisema induzido pela fumaça do cigarro são usados na tentativa de reproduzir a doença humana, especialmente os mecanismos fisiopatológicos envolvidos na história natural do enfisema.⁽⁶^,¹¹⁾ No entanto, o tempo de exposição à fumaça e o número de cigarros usados variam muito de um modelo para outro. Em geral, os resultados mais eficazes são obtidos com períodos de exposição crônica (> 6 meses).⁽⁶^,¹²⁾

O objetivo do presente estudo foi descrever um novo modelo experimental de enfisema induzido pela fumaça do cigarro. O modelo envolve ratos Wistar e um aparelho criado no Laboratório de Genética e Terapia Celular da Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", em Assis (SP). O modelo pode nos ajudar a compreender os processos fisiopatológicos envolvidos na DPOC e a elaborar novas estratégias de tratamento.

Métodos

Vinte e quatro ratos Wistar machos (idade: 12 semanas; peso: 400-450 g) foram divididos em dois grupos: o grupo fumaça de cigarro, com 12 ratos expostos à fumaça de 12 cigarros comerciais com filtro (Derby Vibrante; Souza Cruz SA, Rio de Janeiro, Brasil) - contendo 0,8 mg de nicotina, 10 mg de alcatrão e 10 mg de monóxido de carbono (CO) - durante três períodos de 1 h de exposição (das 8h00 às 9h00, das 12h00 às 13h00 e das 18h00 às 19h00) todos os dias durante 30 semanas e o grupo controle, com 12 ratos expostos ao ar ambiente durante três períodos de 1 h de exposição todos os dias durante 30 semanas. Durante cada período de exposição, os ratos do grupo fumaça de cigarro eram expostos à fumaça de 4 cigarros durante 15 min, seguidos de um intervalo de 5 min (durante o qual os animais eram expostos ao ar ambiente para prevenir a hipóxia). Durante cada período de 15 minutos de exposição, o aparelho de fumar estava programado de modo que períodos de 10 s de sucção do cigarro se alternassem com períodos de 15 s de descanso.

O aparelho consiste em um sistema de contenção de animais e um dispositivo de fumar cigarros (Figura 1). O sistema de contenção de animais compreende quatro gaiolas de metal (24 cm × 17 cm × 15 cm) fechadas na parte superior. As quatro gaiolas encontram-se equidistantes dentro de uma caixa acrílica (70 cm × 70 cm × 20 cm) hermeticamente fechada. Quatro ratos grandes ou 16 camundongos podem ser colocados em cada gaiola. Dois aparelhos foram usados no presente estudo: um para os animais do grupo fumaça de cigarro e um para os animais do grupo controle. Cada aparelho foi colocado em uma sala separada. O sistema de liberação de fumaça de cigarro consiste em um suporte externo para o cigarro, conectado a uma bomba de sucção dinâmica por meio de uma mangueira flexível. A bomba pode ser programada de modo que períodos de sucção do cigarro se alternem com períodos de sucção de ar limpo, para prevenir a asfixia. A bomba gera pressão negativa, que força o ar através de um cigarro aceso, gerando fumaça e empurrando-a para dentro da caixa acrílica através da mangueira. A concentração de CO no sistema de contenção foi medida por meio de um medidor de CO (ToxiPro^(r) Single Gas Detector; Honeywell Analytics Distribution Inc., Lincolnshire, IL, EUA). Durante os períodos de exposição, a concentração de CO foi de 350-400 ppm.

Todos os animais foram pesados semanalmente em uma balança analítica. Para fins de padronização, todos os animais foram pesados no mesmo dia da semana e no mesmo horário.

A função pulmonar foi avaliada por meio de um ventilador para animais de pequeno porte (flexiVent^TM; SCIREQ, Montreal, QC, Canadá). Após 30 semanas de exposição diária à fumaça principal do cigarro ou ao ar ambiente, os animais foram anestesiados por meio de injeção intraperitoneal de 250 mg/kg de Thiopentax^(r) (Cristália - Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Itapira, Brasil) e traqueostomizados com um cateter 20 G ligado ao ventilador (volume corrente: 10 mL/kg; FR: 120 ciclos/min; pressão expiratória final positiva: 3 cmH₂O). A paralisia muscular foi induzida por meio de injeção intraperitoneal de brometo de pancurônio (1 mg/kg). A função pulmonar foi expressa em resistência das vias aéreas (Rva), resistência do sistema respiratório, complacência do sistema respiratório (Csr), resistência tecidual e elastância tecidual.

Após a avaliação mecânica do sistema respiratório, os animais foram sacrificados e os pulmões foram removidos. A traqueia foi canulada e ligada ao aparelho de perfusão; os pulmões foram incubados em solução de paraformaldeído a 4 % durante 24 h e mantidos inflados com pressão positiva contínua (20 cmH₂O). O tecido pulmonar foi cortado em seções de 5 µm e corado com H&E para a avaliação histológica.

O enfisema foi avaliado por meio do diâmetro alveolar médio (Lm), em µm, como proposto por Weibel.⁽¹³⁾ Após a fixação, cada pulmão foi cortado em quatro seções sagitais. As seções foram incluídas em um único bloco de parafina, e cada bloco foi cortado em três seções de 5 µm; foram preparadas portanto três lâminas para cada bloco. Para cada lâmina, dez campos não sobrepostos foram selecionados aleatoriamente e examinados por meio de microscopia de luz (aumento: 400×).

Os resultados foram analisados por meio do teste t de Student e de ANOVA de um fator. A fim de testar os pressupostos de distribuição normal e homogeneidade de variância, realizamos os testes de Shapiro-Wilk e Levene. Nos casos em que os pressupostos não se confirmaram, usamos o teste de Mann-Whitney e a ANOVA de Kruskal-Wallis. Para todos os testes, valores de p < 0,05 foram considerados significantes. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Ciências e Letras de Assis da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (Protocolo nº 001/2011).

Resultados

Como se pode observar na Figura 2, não houve diferenças significativas entre os ratos do grupo fumaça de cigarro e os do grupo controle no tocante ao peso inicial. Da segunda semana de exposição em diante, a média de ganho de peso foi menor no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle. Houve diferença significativa (p < 0,05) entre os dois grupos quanto ao ganho de peso após a terceira semana de exposição. Após 30 semanas de exposição, a média de ganho de peso foi de 212,00 ± 83,40 g no grupo controle e 44,92 ± 43,40 g no grupo fumaça de cigarro; a média de ganho de peso no grupo fumaça de cigarro correspondeu a 21,2% da média no grupo controle.

Como se pode observar na Tabela 1, os valores de Rva, resistência tecidual, resistência do sistema respiratório, Csr e elastância tecidual foram maiores no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle. No entanto, não houve diferença significativa entre os grupos no que tange aos parâmetros respiratórios analisados, provavelmente por causa da grande variação entre os sujeitos no mesmo grupo (evidenciada pelos valores elevados do dp).

Tabela 1. Resistência das vias aéreas, resistência do sistema respiratório, resistência tecidual, elastância tecidual e complacência do sistema respiratório em ratos Wistar expostos à fumaça do cigarro (o grupo fumaça de cigarro) e naqueles expostos ao ar ambiente (o grupo controle).

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A Figura 3A mostra o Lm para os pulmões direito e esquerdo conjuntamente (em cada grupo), e a Figura 3B mostra o Lm para os pulmões direito e esquerdo separadamente (em cada grupo). Como se pode observar na Figura 3, houve diferença estatisticamente significante entre o grupo fumaça de cigarro e o grupo controle no que tange ao Lm. Quando analisamos os pulmões direito e esquerdo conjuntamente, notamos que o Lm foi 25,0% maior no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle (Figura 3A). Quando os pulmões direito e esquerdo foram analisados separadamente, notou-se que o Lm para o pulmão esquerdo foi 15,8% maior no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle (Figura 3B). Da mesma forma, notou-se que o Lm para o pulmão direito foi 32,3% maior no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle (Figura 3B). Esses resultados sugerem uma diferença entre os pulmões direito e esquerdo no grupo fumaça de cigarro no que tange ao grau de aumento dos espaços aéreos. A destruição dos septos alveolares foi significativamente maior no grupo fumaça de cigarro do que no grupo controle, mostrando aumento dos espaços aéreos em virtude de maior destruição do parênquima pulmonar no grupo fumaça de cigarro, avaliada qualitativamente por meio de coloração de cortes histológicos com H&E (Figura 4).

Discussão

O enfisema induzido pela fumaça do cigarro já foi estudado em diversas condições experimentais. ⁽⁵^,⁶^,¹¹^,¹²^,¹⁴^,¹⁵⁾ Embora ainda haja algumas questões sobre o tempo de exposição e o número de cigarros usados, modelos animais de enfisema induzido pela fumaça do cigarro são os modelos experimentais que mais bem reproduzem as características clínicas do enfisema pulmonar em seres humanos e constituem uma ferramenta importante para o estudo dos aspectos fisiopatológicos da doença.⁽⁶⁾

Embora modelos animais de enfisema induzido pela fumaça do cigarro tenham sido usados em vários estudos, apenas alguns sistemas de exposição à fumaça do cigarro estão disponíveis comercialmente, incluindo o Cigarette Smoke Generator^(r) (TSE Systems, Inc., Chesterfield, MO, EUA), o TE-2 Smoking Machine^(r) (Teague Enterprises, Woodland, CA, EUA) e o inExpose^TM (SCIREQ). Todos têm características semelhantes e consistem em um gerador de fumaça de cigarro e uma câmara de exposição, onde os animais são confinados e expostos à fumaça (por intermédio do corpo inteiro ou do nariz apenas).⁽¹¹^,¹²^,¹⁵^,¹⁶⁾ Todos eles custam aproximadamente 75 mil dólares, cerca de vinte vezes o custo final de nosso aparelho (isto é, 3 mil dólares).

Diversas características de nosso aparelho são semelhantes às de sistemas comercialmente disponíveis usados em estudos anteriores. ⁽¹¹^,¹²^,¹⁵^,¹⁶⁾ Uma característica interessante é que os animais são expostos à fumaça do cigarro por intermédio do corpo inteiro. Outra característica é que a fumaça que é bombeada para dentro da câmara de exposição é gerada pela sucção de um cigarro, como de fato ocorre durante o ato de fumar. Assim como outros sistemas no mercado, nosso aparelho permite que se regule a força e o tempo de sucção do cigarro, que pode se alternar com períodos de sucção de ar por meio de um dispositivo de tempo (timer). Dentre as principais vantagens de nosso aparelho sobre os dispositivos disponíveis comercialmente estão o custo baixo, o design simples, a facilidade de instalação e o fato de que pode ser montado a partir de peças disponíveis comercialmente, tais como uma bomba de sucção e um timer (para regular o tempo de sucção do cigarro e do ar, conforme descrito na seção Métodos). Além disso, nosso aparelho custa 20 vezes menos que os dispositivos disponíveis comercialmente.

O período de 30 semanas de exposição empregado em nosso estudo foi escolhido na tentativa de estabelecer um padrão para o tempo de exposição em modelos animais. Estudos anteriores sobre o enfisema induzido pela fumaça do cigarro (empregando diferentes aparelhos) relataram períodos de exposição de 8-36 semanas. Embora períodos de 6 meses de exposição sejam comuns em modelos animais,⁽¹²^,¹⁵^-¹⁸⁾ períodos de até 9 meses de exposição também têm sido usados.⁽¹²^,¹⁹⁾

Em alguns protocolos, os animais são expostos à fumaça do cigarro 3-5 dias por semana, o que não é suficiente para simular o tabagismo diário.⁽¹⁰^,¹⁵^,¹⁸^-²⁰⁾ O tempo de exposição diária varia muito de um estudo para outro.⁽¹²^,²¹^,²²⁾ Li et al. adotaram um protocolo de exposição dividido em duas etapas: primeiramente, os animais foram expostos à fumaça de 8 cigarros duas vezes por dia durante 2 semanas (semanas 1 e 2) e, em seguida, foram expostos à fumaça de 15 cigarros três vezes por dia durante 10 semanas (semanas 3-12).⁽²³⁾ O modelo animal usado no presente estudo simula as condições fisiopatológicas do tabagismo ativo; os animais foram expostos à fumaça principal do cigarro diariamente (7 dias por semana) durante 30 semanas.

Não há estudos que envolvam uma análise morfométrica comparativa do dano alveolar nos pulmões direito e esquerdo. A análise morfométrica comparativa é relevante porque permite que se demonstre a heterogeneidade da destruição do parênquima no enfisema induzido experimentalmente. Diferenças anatômicas entre os pulmões direito e esquerdo de ratos oferecem uma possível explicação para os resultados obtidos. Segundo Cataneo e Reibscheid,⁽²⁴⁾ a traqueia dos ratos apresenta um desvio para a direita, e os brônquios dos ratos são semelhantes aos brônquios humanos (isto é, curtos e largos). O brônquio direito parece ser uma continuação da traqueia, ao passo que o brônquio esquerdo se parece com um ramo.⁽²⁴⁾ Portanto, é possível que o pulmão direito tenha sido mais constantemente exposto à fumaça do cigarro, o que resultou em ativação intensa de neutrófilos e macrófagos e aumento da secreção de proteases responsáveis pela destruição do parênquima pulmonar. Essas diferenças anatômicas podem explicar por que o Lm foi maior no pulmão direito do que no pulmão esquerdo no grupo de ratos expostos à fumaça do cigarro.

Embora seja uma ferramenta valiosa para avaliar o enfisema em modelos experimentais, o teste funcional é menos sensível que a análise morfométrica, que é mais precisa na avaliação do dano ao parênquima. Animais com enfisema moderado geralmente apresentam valores funcionais normais quando comparados com animais saudáveis, ao passo que animais com doença grave apresentam alterações significativas nos parâmetros respiratórios.⁽⁶⁾ Isso já foi relatado por outros grupos de pesquisa. Foronjy et al.⁽²⁵⁾ expuseram duas linhagens de camundongos C57 à fumaça do cigarro durante 6 ou 12 meses e observaram um aumento significativo do Lm em comparação com os respectivos grupos de controle. Não obstante, não houve diferenças significativas entre os animais expostos e os respectivos grupos de controle no tocante aos parâmetros respiratórios. Segundo Wright et al.,⁽⁶⁾ animais com enfisema moderado geralmente apresentam valores funcionais limítrofes ou normais quando comparados com animais saudáveis; animais com doença avançada são os únicos que apresentam alterações significativas nos parâmetros respiratórios.

Os resultados do presente estudo não mostraram diferenças significativas entre os animais do grupo fumaça de cigarro e os do grupo controle no que tange à Rva e à Csr. No entanto, a Rva tendeu a ser maior no grupo fumaça de cigarro. A espécie em estudo desempenha um papel relevante nos resultados da ventilação mecânica. Embora ratos Wistar possibilitem uma série de análises funcionais, são mais resistentes ao enfisema do que outras espécies de roedores.⁽⁶⁾ Do ponto de vista fisiopatológico, a doença pode ser mais branda em ratos, o que pode dificultar a comparação de animais expostos e não expostos à fumaça do cigarro no que tange a parâmetros funcionais.⁽⁶⁾ Esse achado empírico pode explicar os resultados do presente estudo, que mostraram não haver diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos de ratos no que tange aos parâmetros funcionais avaliados (Tabela 1), não obstante as evidências morfométricas de enfisema (isto é, o Lm), como se pode observar na Figura 3.

A DPOC pode ser considerada uma doença sistêmica, caracterizada por alterações esqueléticas, fraqueza, disfunção muscular e perda de peso, a qual ocorre em virtude de estresse oxidativo e ingestão calórica reduzida.⁽²¹^,²⁶^,²⁷⁾ Em fumantes com DPOC, a nicotina aumenta a saciedade e reduz a ingestão de alimentos.⁽²⁸⁾ O tabagismo portanto contribui para a perda de peso, agrava o enfisema e gera um circuito de retroalimentação. Estudos anteriores mostraram que a fumaça do cigarro pode alterar a regulação hipotalâmica do apetite no sistema nervoso central.⁽¹²^,²⁸^,²⁹⁾ Mineur et al.⁽²⁸⁾ demonstraram que a nicotina reduz a ingestão de alimentos e o peso corporal.

O processo inflamatório é um componente fundamental da fisiopatologia da DPOC. A inflamação e outros efeitos sistêmicos do enfisema não foram avaliados no presente estudo, já que nosso objetivo principal era avaliar a viabilidade de um novo modelo murino de enfisema pulmonar induzido pela fumaça do cigarro. Outros estudos estão em andamento em nosso laboratório e envolvem a análise do pulmão em busca das metaloproteinases 9 e 12, que desempenham um papel importante no processo inflamatório,⁽³⁾ e a avaliação de células inflamatórias no lavado broncoalveolar de animais expostos e não expostos à fumaça do cigarro.

A acentuada perda de peso observada no presente estudo não ocorreu em virtude do tempo de exposição, haja vista a diferença estatisticamente significativa entre o grupo fumaça de cigarro e o grupo controle a partir da terceira semana de exposição (Figura 2). Os animais do grupo controle apresentaram média de ganho de peso de 212,0 ± 83,40 g, ao passo que os do grupo fumaça de cigarro apresentaram média de ganho de peso de 44,92 ± 43,40 g, que correspondeu a 21,2% da média no grupo controle. Nossos resultados também mostraram um grande dp no que tange à média de ganho de peso dos animais expostos após 30 semanas (44,92 ± 43,40 g). É possível que esses resultados se devam à intensidade da exposição à fumaça do cigarro no presente estudo, a qual resultou em alterações pulmonares e em alterações fisiopatológicas generalizadas. Como mencionado acima, a DPOC deveria ser considerada uma doença sistêmica, como em um circuito de retroalimentação no qual os efeitos da exposição à fumaça do cigarro determinam alterações morfológicas e funcionais no pulmão. Essas alterações refletem os efeitos sistêmicos da nicotina e do grande número de substâncias tóxicas na fumaça do cigarro e em outros poluentes atmosféricos e são agravadas por esses efeitos.

Os resultados do presente estudo indicam que, em animais expostos, a fumaça principal do cigarro resulta em diminuição do ganho de peso e em enfisema, avaliado por meio de análise morfométrica (Lm). A metodologia empregada no presente estudo é viável, e o novo aparelho é eficaz em modelos animais de enfisema induzido pela fumaça do cigarro. Esse novo modelo murino de enfisema induzido pela fumaça do cigarro é uma opção promissora e economicamente viável para estudos sobre a fisiopatologia e o tratamento da DPOC.

Acknowledgments

Os autores agradecem a José Ricardo Sousa das Faculdades Integradas Padre Albino (FIPA) a assistência técnica.

Footnotes

Trabalho realizado na Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Assis (SP) Brasil.

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PERMALINK

A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in Wistar rats*, **

Rodrigo de las Heras Kozma

Edson Marcelino Alves

Valter Abraão Barbosa-de-Oliveira

Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos Lopes

Renan Cenize Guardia

Henrique Vivi Buzo

Carolina Arruda de Faria

Camila Yamashita

Manzelio Cavazzana Júnior

Fernando Frei

Maria José de Oliveira Ribeiro-Paes

João Tadeu Ribeiro-Paes

Roles

Abstract

OBJECTIVE:

METHODS:

RESULTS:

CONCLUSIONS:

Introduction

Methods

Figure 1. In A, schematic illustration of the smoking apparatus. In B, upper view of the smoking apparatus.

Results

Figure 2. Mean weight gain in the Wistar rats in the cigarette smoke (CS) group and in those in the control group. *p < 0.05.

Table 1. Airway resistance, respiratory system resistance, tissue damping, tissue elastance, and respiratory system compliance in Wistar rats exposed to cigarette smoke (the cigarette smoke group) and in those exposed to room air (the control group).

Discussion

Acknowledgments

Footnotes

Contributor Information

References

Um novo modelo experimental murino de enfisema: enfisema induzido pela fumaça do cigarro em ratos Wistar*

Rodrigo de las Heras Kozma

Edson Marcelino Alves

Valter Abraão Barbosa-de-Oliveira

Fernanda Degobbi Tenorio Quirino dos Santos Lopes

Renan Cenize Guardia

Henrique Vivi Buzo

Carolina Arruda de Faria

Camila Yamashita

Manzelio Cavazzana Júnior

Fernando Frei

Maria José de Oliveira Ribeiro-Paes

João Tadeu Ribeiro-Paes

Roles

Abstract

OBJETIVO:

MÉTODOS:

RESULTADOS:

CONCLUSÕES:

Introdução

Métodos

Figura 1. Em A, esquema do aparelho de fumar. Em B, vista superior do aparelho de fumar.

Resultados

Figura 2. Média de ganho de peso nos ratos Wistar do grupo fumaça de cigarro (FC) e naqueles do grupo controle. *p < 0,05.

Tabela 1. Resistência das vias aéreas, resistência do sistema respiratório, resistência tecidual, elastância tecidual e complacência do sistema respiratório em ratos Wistar expostos à fumaça do cigarro (o grupo fumaça de cigarro) e naqueles expostos ao ar ambiente (o grupo controle).

Discussão

Acknowledgments

Footnotes

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A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in Wistar rats^{^*}^,^{^**}

Um novo modelo experimental murino de enfisema: enfisema induzido pela fumaça do cigarro em ratos Wistar^{^*}