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. 2014 Jul-Aug;40(4):421–424. doi: 10.1590/S1806-37132014000400010
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Lodenafil treatment in the monocrotaline model of pulmonary hypertension in rats*

Igor Bastos Polonio 1, Milena Marques Pagliareli Acencio 2, Rogério Pazetti 3, Francine Maria de Almeida 4, Bárbara Soares da Silva 5, Karina Aparecida Bonifácio Pereira 6, Rogério Souza 7
PMCID: PMC4201173  PMID: 25210965

Abstract

We assessed the effects of lodenafil on hemodynamics and inflammation in the rat model of monocrotaline-induced pulmonary hypertension (PH). Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: control; monocrotaline (experimental model); and lodenafil (experimental model followed by lodenafil treatment, p.o., 5 mg/kg daily for 28 days) Mean pulmonary artery pressure (mPAP) was obtained by right heart catheterization. We investigated right ventricular hypertrophy (RVH) and IL-1 levels in lung fragments. The number of cases of RVH was significantly higher in the monocrotaline group than in the lodenafil and control groups, as were mPAP and IL-1 levels. We conclude that lodenafil can prevent monocrotaline-induced PH, RVH, and inflammation.

Keywords: Hypertension, pulmonary; Monocrotaline; Interleukin-1

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a poor prognosis disease, which is characterized by endothelial cell proliferation, hypertrophy and proliferation of muscle cells of the media of the pulmonary arteries, reduction of the vascular lumen, and development of plexiform lesions. The reduction of the vascular lumen leads to an increase in pulmonary vascular resistance, causing right ventricle (RV) hypertrophy, cor pulmonale, and death. In addition, PAH is a public health problem, since schistosomiasis, which is one of its causes, reaches epidemic proportions in developing countries.( 1 , 2 )

The treatment of PAH is complex and costly, as well as requiring a multidisciplinary team. There are three major pathophysiological pathways, for which there are specific drugs available for treatment: the endothelin pathway; the nitric oxide pathway, and the prostaglandin pathway.( 1 ) These pathways have been discovered using experimental models of PAH, chief among which is the monocrotaline model. Many of the drugs available for the treatment of PAH have been tested using this model.( 3 )

The monocrotaline model is simple, inexpensive, and feasible, being routinely used in the initial analysis of drugs with potential effects on pulmonary circulation. Monocrotaline is an alkaloid derived from the seeds of the plant Crotalaria spectabilis; after undergoing oxidation in the liver, monocrotaline produces its toxic metabolite that will cause vasculitis and medial thickening of the pulmonary arteries and arterioles.( 4 ) Within 22 days after injection of monocrotaline, there is significant PAH.( 5 )

Lodenafil carbonate is a new phosphodiesterase-5 inhibitor consisting of two lodenafil molecules attached to a carbonate bridge that behaves as a pro-drug, releasing lodenafil as an active metabolite. Its safety in treating erectile dysfunction is well established in preclinical and clinical studies; however, it has never been tested in treating PAH.( 6 )

The objective of the present study was to assess the response to administration of lodenafil, in terms of hemodynamics and inflammation, in an experimental model of monocrotaline-induced PH.

All animals were handled humanely, in accordance with international standards for animal care.( 7 ) The study was approved by the Research Ethics Committee of the University of São Paulo School of Medicine, located in the city of São Paulo, Brazil.

Thirty male Sprague-Dawley rats (weight, 250-300 g) were randomly divided into three groups: control group, in which the animals were given a subcutaneous injection of saline (1 mL/kg) at the study outset (D0); monocrotaline group, in which the animals were given a subcutaneous injection of monocrotaline (60 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) on D0; and lodenafil group, in which the animals were given a subcutaneous injection of monocrotaline (60 mg/kg; Sigma-Aldrich) on D0 and were given lodenafil p.o. (5 mg/kg) once daily between D0 and day 28 of the study (D28).

On D28, after deep sedation with xylazine hydrochloride (i.p., 0.3 mg/kg; Rompun(r); Bayer, Leverkusen, Germany) and ketamine hydrochloride (i.p., 10 mg/kg; Ketalar(r); Pfizer, New York, NY, USA), the animals were weighed. Subsequently, hemodynamic measurements were performed, being followed by euthanasia (abdominal aortic bleeding) and removal of heart and lung tissue.

The hemodynamic measurements were performed by inserting an umbilical catheter into the external jugular vein, the catheter being connected to a pressure transducer (HP 1295C; Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA) coupled to a hemodynamic monitor (Monitox Dx 2020; Hewlett Packard), in accordance with a technique described in a previous study.( 8 ) Mean pulmonary artery pressure (mPAP) was thus measured.

The RV was dissected from the left ventricle (LV), the interventricular septum (S) having remained attached to the LV (LV+S). The ratio of RV weight to LV+S weight (i.e., RV/LV+S) was taken as the index of RV hypertrophy.( 8 )

To assess the degree of inflammation, IL-1 levels were determined with a capture ELISA using a commercial IL-1 kit (R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA).( 9 ) Peptide levels were measured in frozen lung fragments.

For the statistical analysis, ANOVA with post hoc Bonferroni correction was used to compare continuous variables among the groups. Values of p < 0.05 were considered significant.

Rats in the monocrotaline group developed PAH, as shown in Figures 1 and 2, as well as experiencing a significant increase in mPAP and RV hypertrophy.

Figure 1. Mean pulmonary artery pressure (mPAP) in the groups studied. *p = 0.001 (monocrotaline group vs. control and lodenafil groups).

Figure 1

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Figure 2. Right ventricle (RV) hypertrophy and IL-1 levels in the groups studied. In A, RV hypertrophy was determined by the ratio of RV weight to left ventricle + septum weight (LV+S). In B, IL-1 levels were determined by ELISA. *p < 0.001 (monocrotaline group vs. control and lodenafil groups for both graphs).

Figure 2

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Rats in the lodenafil group had significantly lower mPAP than did those in the monocrotaline group, and there was no significant difference between the former and those in the control group, i.e., lodenafil prevented the development of PAH (Figure 1). The same pattern was observed for the remodeling of the RV and for IL-1 levels (Figure 2).

To our knowledge, the present study is the first to demonstrate that lodenafil was able to prevent the development of PAH in an experimental model of monocrotaline-induced disease.

It is clear that experimental PAH models do not mimic human PAH cases closely enough. There are several factors that may be related to this limitation, among which are the speed of the onset of PAH, which occurs over years in humans but progresses rapidly in animal models, and specific characteristics of the methods used to induce PAH.( 5 ) Specifically in the monocrotaline-induced model of disease, there is a very significant inflammatory aspect, which is not observed in the major forms of human PAH.( 4 ) This explains why several drugs have a marked effect in various experimental models and do not produce the same results in humans, a finding that emphasizes the care that must be taken before extrapolating results derived from experimental models directly into clinical practice.

To specifically assess the inflammatory nature of the monocrotaline model, as well as the potential anti-inflammatory properties of lodenafil, we determined IL-1 levels in lung tissue. The finding of similar IL-1 levels in lodenafil-treated compared with control rats suggests that lodenafil inhibited the inflammatory cascade characteristic of the monocrotaline model. The direct mechanism of this inhibition was not the object of our study, which is a study limitation.

Survival in monocrotaline-treated rats is significantly lower, as reported in a previous study,( 8 ) and this happens in parallel with progressive vascular involvement and progressive involvement of the RV. The same can be observed in humans with PAH, who have decreased survival because of the development of pulmonary vascular remodeling associated with progressive failure of the RV, with this being the leading cause of death in patients with PAH.( 2 ) Our study demonstrated that lodenafil prevented the increase in mPAP, as well as the remodeling of the RV, in rats with monocrotaline-induced PAH. Although we did not investigate the role of lodenafil in reversing established PAH, our findings demonstrate the therapeutic potential of lodenafil in PAH, analogously to what has been shown for other phosphodiesterase inhibitors.( 3 )

In conclusion, lodenafil prevented the development of PAH and the remodeling of the RV in rats subjected to an experimental model of PAH. Our findings provide the first basis for the development of clinical studies to investigate the potential of lodenafil in the treatment of human PAH.

Footnotes

Financial support: This study received financial support in the form of a donation of lodenafil from Cristália Pharmaceutical Chemicals Ltd.

*

Study carried out at the University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Contributor Information

Igor Bastos Polonio, Department of Pulmonology, Santa Casa School of Medical Sciences in São Paulo, São Paulo, Brazil.

Milena Marques Pagliareli Acencio, Laboratory for Pleural Studies, Department of Pulmonology, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Rogério Pazetti, Laboratório de Investigação Médica 61 (LIM-61, Laboratory for Medical Research 61), Department of Thoracic Surgery, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Francine Maria de Almeida, Laboratório de Investigação Médica 61 (LIM-61, Laboratory for Medical Research 61), Department of Thoracic Surgery, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Bárbara Soares da Silva, Laboratory for Pleural Studies, Department of Pulmonology, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Karina Aparecida Bonifácio Pereira, Laboratory for Pleural Studies, Department of Pulmonology, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Rogério Souza, Department of Pulmonology, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil.

References

J Bras Pneumol. 2014 Jul-Aug;40(4):421–424. [Article in Portuguese]

Tratamento com lodenafila no modelo de hipertensão pulmonar induzida por monocrotalina em ratos*

Igor Bastos Polonio 1, Milena Marques Pagliareli Acencio 2, Rogério Pazetti 3, Francine Maria de Almeida 4, Bárbara Soares da Silva 5, Karina Aparecida Bonifácio Pereira 6, Rogério Souza 7

Abstract

Avaliamos os efeitos da lodenafila na hemodinâmica e inflamação no modelo experimental de hipertensão pulmonar (HP) induzida por monocrotalina em ratos. Trinta ratos Sprague-Dawley foram randomicamente distribuídos em três grupos: controle, monocrotalina (modelo experimental) e lodenafila (modelo experimental e tratado com 5 mg/kg lodenafila v.o. por 28 dias). A pressão média de artéria pulmonar (PAPm) foi obtida por cateterismo cardíaco direito. Foram determinados a hipertrofia ventricular direita (HVD) e os níveis de IL-1 em fragmentos de pulmão. O grupo monocrotalina apresentou valores significativamente maiores de PAPm, HVD e IL-1 em comparação aos grupos controle e lodenafila. Concluímos que a lodenafila pode prevenir o desenvolvimento de HP, HVD e inflamação.

Keywords: Hipertensão pulmonar, Monocrotalina, Interleucina-1

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença de prognóstico reservado, que se caracteriza por proliferação de células endoteliais, hipertrofia e proliferação de células musculares da camada média das artérias pulmonares, redução do lúmen vascular e desenvolvimento de lesões plexiformes. A redução do lúmen vascular leva ao aumento da resistência vascular pulmonar, causando hipertrofia de ventrículo direito (VD), cor pulmonale e morte. Além disso, a HAP é um problema de saúde pública, já que a esquistossomose, uma de suas causas, assume proporções epidêmicas em países em desenvolvimento.( 1 , 2 )

O tratamento da HAP é complexo e de alto custo, assim como exige uma equipe multidisciplinar. Existem três principais vias fisiopatológicas, para as quais fármacos específicos para o tratamento estão disponíveis: a via da endotelina, a via do óxido nítrico e a via da prostaglandina.(1) Essas vias foram descobertas através de modelos experimentais de HP, sendo o principal representante o modelo de monocrotalina. Através desse modelo, muitas das drogas disponíveis para o tratamento da HAP foram testadas.( 3 )

O modelo de monocrotalina é simples, barato e factível, sendo rotineiramente utilizado na análise inicial de fármacos com potencial ação na circulação pulmonar. A monocrotalina é um alcaloide derivado das sementes da planta Crotalaria spectabilis, que, após a oxidação hepática, gera seu metabólito tóxico que provocará vasculite e espessamento da camada média das artérias e arteríolas pulmonares.( 4 ) Após 22 dias da injeção da substância já temos uma HP importante.( 5 )

O carbonato de lodenafila é um novo inibidor da fosfodiesterase 5, constituído por duas moléculas de lodenafila ligadas por uma ponte de carbonato que se comporta como uma pró-droga, liberando a lodenafila como metabólito ativo. Sua segurança já está bem estabelecida para o tratamento da disfunção erétil em estudos pré-clínicos e clínicos; porém, nunca foi testada para a HAP.( 6 )

O objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta à administração de lodenafila, do ponto de vista hemodinâmico e inflamatório, no modelo experimental de HAP induzida por monocrotalina.

Todos os animais receberam tratamento digno em concordância com normas internacionais de cuidados com os animais.( 7 ) O estudo teve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, na cidade de São Paulo (SP).

Trinta ratos Sprague-Dawley machos, com peso entre 250 e 300 g, foram randomicamente distribuídos em três grupos: grupo controle - os animais receberam uma injeção subcutânea de salina (1 mL/kg) no dia de início do estudo (D0) - grupo monocrotalina - os animais receberam uma injeção subcutânea de monocrotalina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) no D0 do estudo (60 mg/kg) - e grupo lodenafila - os animais receberam uma injeção subcutânea de monocrotalina (Sigma-Aldrich) no D0 do estudo (60 mg/kg) e, entre o D0 e o dia 28 do estudo (D28), os animais receberam lodenafila v.o. (5 mg/kg) uma vez ao dia.

No D28, após sedação profunda - com cloridrato de xilazina i.p. (0,3 mg/kg; Rompun(r); Bayer, Leverkusen, Alemanha) e cloridrato de cetamina i.p. (10 mg/kg); Ketalar(r); Pfizer, New York, NY, EUA) - os animais foram inicialmente pesados para depois serem realizadas as medidas hemodinâmicas, seguidas do sacrifício dos animais através de sangria da aorta abdominal e, por fim, a coleta de tecidos cardíaco e pulmonar.

As medidas hemodinâmicas foram realizadas através da inserção pela veia jugular externa de um cateter umbilical conectado a um transdutor de pressão HP1295C (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EUA) ligado a um monitor hemodinâmico modelo Monitox Dx 2020 (Hewlett-Packard), seguindo a técnica descrita em um estudo anterior.( 8 ) A pressão média da artéria pulmonar (PAPm) foi obtida através desse sistema.

O VD foi dissecado do ventrículo esquerdo (VE), o qual, por sua vez, manteve o septo interventricular (VE+S). A razão entre o peso do VD e o peso do conjunto VE+S, ou seja, VD/(VE+S), foi utilizada como um marcador de hipertrofia de VD.( 8 )

Para a análise da inflamação, foi determinada a concentração de IL-1 por ELISA de captura utilizando-se o kit comercial de IL-1 (R&D System Inc., Minneapolis, MN, EUA).( 9 ) O peptídeo foi dosado a partir de fragmentos de pulmão congelados.

Quanto à análise estatística, as variáveis contínuas foram comparadas, entre os diferentes grupos, através de ANOVA e análise post hoc com correção de Bonferroni. Foram considerados significativos os valores de p < 0,05.

O grupo monocrotalina desenvolveu HAP, como mostram as Figuras 1 e 2, com aumento significativo da PAPm e hipertrofia de VD.

Figura 1. Pressão média da artéria pulmonar (PAPm) nos grupos estudados. *p = 0,001 (grupo monocrotalina vs. grupos controle e lodenafila).

Figura 1

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Figura 2. Hipertrofia de ventrículo direito (VD) e níveis de IL-1 nos grupos estudados. Em A, a hipertrofia do VD foi determinada pela razão entre o peso do VD e o peso do ventrículo esquerdo + septo (VE+S). Em B, níveis de IL-1 por ELISA. *p < 0,001 (grupo monocrotalina vs. grupos controle e lodenafila para ambos os gráficos).

Figura 2

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O grupo lodenafila apresentou PAPm significativamente menor do que o grupo monocrotalina, sem diferença significativa quando comparado ao grupo controle, ou seja, a lodenafila preveniu o desenvolvimento de HAP (Figura 1). O mesmo padrão foi observado em relação ao remodelamento do VD e aos níveis de IL-1 (Figura 2).

Até onde sabemos, o presente estudo é o primeiro a demonstrar que a lodenafila foi capaz de prevenir o desenvolvimento de HAP no modelo experimental induzido com monocrotalina.

É evidente que os modelos experimentais em HAP não mimetizam adequadamente a doença que ocorre em seres humanos. Vários são os motivos que podem estar relacionados a essa limitação, desde o tempo necessário para instalação da HAP, ao longo de anos nos seres humanos e de forma rapidamente progressiva nos modelos animais, assim como características específicas dos métodos utilizados para indução da HAP.( 5 ) Especificamente no modelo induzido por monocrotalina, há um aspecto inflamatório muito significativo, não observado nas principais formas de HAP em humanos.( 4 ) Isso explica o porquê de vários fármacos terem um efeito marcante em diversos modelos experimentais e não apresentarem os mesmos resultados em seres humanos, enfatizando o cuidado que deve ser tomado antes de se extrapolar resultados oriundos de modelos experimentais diretamente para a prática clínica.

Especificamente para avaliar o caráter inflamatório do modelo de monocrotalina, assim como as potenciais propriedades anti-inflamatórias da lodenafila, foram determinados os níveis de IL-1 no tecido pulmonar. O achado de níveis de IL-1 semelhantes aos do grupo controle nos ratos tratados com lodenafila sugere que a lodenafila tenha inibido a cascata inflamatória característica do modelo de monocrotalina. O mecanismo direto dessa inibição não foi objeto de nosso estudo, caracterizando uma limitação do mesmo.

A sobrevida de ratos tratados com monocrotalina é significativamente menor, conforme um estudo publicado anteriormente,( 8 ) de forma paralela ao progressivo acometimento vascular e do VD. O mesmo pode ser observado em relação a seres humanos com HAP, que apresentam sobrevida diminuída devido ao desenvolvimento de remodelamento vascular pulmonar associado à falência progressiva do VD, sendo essa a principal causa de morte em pacientes com HAP.( 2 ) Nosso estudo demonstrou que a lodenafila preveniu a elevação da PAPm, assim como o remodelamento do VD nos ratos com HAP em decorrência da monocrotalina. Embora não tenhamos avaliado o papel da lodenafila na reversão da HAP já estabelecida, nosso estudo evidencia o potencial terapêutico da lodenafila na HAP, de forma análoga ao já demonstrado para outros inibidores de fosfodiesterase.( 3 )

Em conclusão, a lodenafila preveniu o desenvolvimento de HAP e o remodelamento do VD em ratos submetidos a um modelo experimental de HAP. Nossos achados fornecem a primeira base para o desenvolvimento de estudos clínicos avaliando o potencial da lodenafila no tratamento da HAP em seres humanos.

Footnotes

Apoio financeiro: Este estudo recebeu apoio financeiro pelo fornecimento do sal da lodenafila da empresa Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda.

*

Trabalho realizado na Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo (SP) Brasil.

Articles from Jornal Brasileiro de Pneumologia are provided here courtesy of Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia (Brazilian Thoracic Society)

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