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. 2015 Oct-Dec;13(4):574–579. doi: 10.1590/S1679-45082015AO3418
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Effects of physical exercise on the cartilage of ovariectomized rats submitted to immobilization

José Martim Marques Simas 1, Regina Inês Kunz 1, Rose Meire Costa Brancalhão 1, Lucinéia de Fátima Chasko Ribeiro 1, Gladson Ricardo Flor Bertolini 1
PMCID: PMC4878633  PMID: 26761556

ABSTRACT

Objective

To analyze the effects of physical exercise on cartilage histomorphometry in osteoporosis-induced rats subjected to immobilization.

Methods

We used 36 Wistar rats that were separated into six groups: G1, G2 and G3 submitted to pseudo-oophorectomy, and G4, G5 and G6 submitted to oophorectomy. After 60 days at rest, G2, G3, G5 and G6 had the right hind limbs immobilized for 15 days, followed by the same period in remobilization, being free in the box to G2 and G5, and climb ladder to G3 and G6. At the end of the experiment, the rats were euthanized, their tibias bilaterally removed and submitted to histological routine.

Results

There was significant increase in thickness of the articular cartilage (F(5;29)=13.88; p<0.0001) and epiphyseal plate (F(5;29)=14.72; p<0.0001) as the number of chondrocytes (F(5;29)=5.11; p=0.0021) in ovariectomized rats, immobilized and submitted to exercise. In the morphological analysis, degeneration of articular cartilage with subchondral bone exposure, loss of cellular organization, discontinuity of tidemark, presence of cracks and flocculation in ovariectomized, immobilized and free remobilization rats were found. In ovariectomized and immobilized remobilization ladder rats, signs of repair of the cartilaginous structures in the presence of clones, pannus, subcortical blood vessel invasion in the calcified zone, increasing the amount of isogenous groups and thickness of the calcified zone were observed.

Conclusion

Exercise climb ladder was effective in cartilaginous tissue recovery process damaged by immobilization, in model of osteoporosis by ovariectomy in rats.

Keywords: Osteoporosis; Immobilization; Exercise therapy; Physical therapy modalities; Rats, Wistar

INTRODUCTION

Menopause leads to a slow and gradual decrease of estrogen and progesterone, which increases bone resorption and decreases calcium absorption by bone tissue. This results in more fragile bones and increased predisposition to the onset of diseases, such as osteoporosis(1,2) and osteoarthritis.(3) Decreasing levels of estrogen shorten the half-life of cartilage and increase erosion of the cartilage surface,(4) and this animal model has been a useful tool in studies investigating cartilage damage after ovariectomy.(5)

Immobilization is frequently used in musculoskeletal injuries, and can cause serious damage to the musculoskeletal system, particularly to the articular cartilage, resulting in temporary or permanent disability of the subject and increasing health care costs.(6,7) Different treatments were proposed for rehabilitation after immobilization. However, exercise is preferred for improving muscle strength, preventing fractures and promoting tissue repair in the muscle, bone and cartilage.(7-11)

The rationale for this study considers the increased life expectancy of the population, the understanding that menopause can lead to some diseases, such as osteoporosis and osteoarthritis (very relevant public health issues), the disabilities and deleterious effects of immobilization on the tissue structure, and the need to gather scientific evidence for therapies commonly used in clinical practice.

OBJECTIVE

To assess the effects of exercise on cartilage histomorphometry in female rats with induced osteoporosis subjected to immobilization.

METHODS

Experimental groups

We used 36 female nulliparous adult (10±2 weeks) Wistar rats, with mean weight of 317.2±22.1g, kept in polypropylene cages, ad libitum water and feeding, 12 hour light/dark photocycle, at controlled room temperature (25±1°C). The study was conducted according to international ethical standards of animal experimentation and approved by the Animal Research Ethics Committee of Unioeste under number 4,112.

The rats were randomized into six groups:

– G1 (n=6): rats subjected to sham ovariectomy (pseudo-ovariectomy), followed by 60 days with no intervention.

– G2 (n=6): sham ovariectomy and 60 days with no intervention. Then, the right hind limb (RHL) was immobilized for 2 weeks. Later, the rats were put on free remobilization for the same period and only came into contact with a ladder in the last 10 days.

– G3 (n=6): sham ovariectomy and 60 days with no intervention. Then, the RHL was immobilized for 2 weeks, and the rats were subsequently subjected to ladder climb exercise for 10 days, with a 2-day interval after day 5. They performed 10 climbs on week one (five days) and 20 on week two (5 days), with a 1-minute interval between climbs.

– G4 (n=6): bilateral ovariectomy and 60 days with no intervention.

– G5 (n=6): bilateral ovariectomy and 60 days with no intervention. Later, immobilization and remobilization were performed similarly as for G2.

– G6 (n=6): bilateral ovariectomy and 60 days with no intervention. Then, immobilization and remobilization procedures were performed similarly as for G3.

Ovariectomy and sham ovariectomy protocol

For ovariectomy, sham ovariectomy, immobilization and euthanasia, the rats were weighed and subjected to an anesthesia protocol consisting of intraperitoneal injection of xylazine hydrochloride (12mg/kg) and ketamine hydrochloride (95mg/kg).

During the ovariectomy, after anesthesia, clipping was performed as well as antisepsis with iodinated alcohol in the lower abdomen, and then a longitudinal incision was made with a no. 11 surgical blade. At the peritoneal cavity, the adipose tissue was retracted until the surgeons could identify the fallopian tubes and ovaries. Suturing of the uterine horns was performed with a single 4.0 catgut suture, allowing for bilateral resection of the ovaries.

At the end of the procedure, internal and external sutures were placed using a single 4.0 catgut reabsorbable thread and 4.0 nylon, respectively. The pseudo- ovariectomy followed all surgical steps of the ovariectomy, except for removal of the ovaries. Following the surgery, the rats spent 60 days with no intervention, moving freely in the cage.

Immobilization protocol

Immobilization was carried out according to the model proposed by Booth and Kelso,(12) modified for just one limb, as proposed by Matheus et al.,(13) with adaptation of the material used for the static cast brace. Prior to immobilization, anesthesia was performed, and then the RHL was wrapped in a tubular mesh with cotton bandage, from hip to ankle. Then fast-dry plaster wrap was used to mold a 50g contention brace, with the RHL at full knee extension and full plantar flexion of the ankle for the rats in G2, G3, G5 and G6.

Remobilization protocol

After the immobilization was completed, the rats in G3 and G6 were subjected to the ladder climb exercise with 10 repetitions in the first week (five days) and 20 repetitions in the second week (5 days), with 1-minute intervals between climbs and 2-day intervals between weeks. The rats in G2 and G5 were allowed free remobilization in the cage, coming into contact with a ladder at 10cm from the dark box, only once, in the same period of the exercise performed with G3 and G6. The equipment used for the exercise consisted of a ladder with 67 steps separated by 1.5cm, 20.5cm wide, 118cm high and with a tilt angle of 80° (approximately). In the upper platform, there was a dark chamber of 28,5cm (length) x 18.5cm (height) x 15cm (width), available for the rats to rest between sets of climbs, and to attract them and stimulate them to perform the exercise.

Histomorphometric and histomorphological analyses

At the end of the experiment, the rats were weighed, anesthetized and euthanized with decapitation by guillotine. Then, the right and left tibias were removed and subjected to the laboratory routine, i.e. diaphonized and embedded in paraffin; a microtome was used to make 7μm cuts, and the slides were prepared with frontal plane cuts and hematoxylin and eosin (HE) stain. The slides were photomicrographed in an Olympus DP71® microscope at 3 points for assessment of articular cartilage, namely P1, P2 and P3, which correspond respectively to the lateral, intermediate and medial tibia. To analyze the epiphyseal plate, a photomicrograph was taken of the intermediate point. We used 200x magnification for thickness measurements of the articular cartilage and epiphyseal plate, and also for the chondrocyte count. The images were analyzed with the software Image Pro-Plus 6.0®. For the histomorphological analysis, in the articular cartilage, we observed the structure and cellular organization, such as changes in the articular surface.

Statistical analysis

The study data were evaluated by comparing the results obtained for the left hind limb (LHL - control) and the RHL (immobilized), between rats in the same group and among groups. For this end, we used the software BioEstat 5.0 with values presented as mean and standard deviation. The paired Student t-test was conducted for comparison between the right and left sides within the same group, and one-way analysis of variance (ANOVA) was used for comparison between experimental groups, for the right and left sides. The level of statistical significance was p ≤0.05.

RESULTS

Articular cartilage thickness

For the articular cartilage thickness, there was a significant decrease in the RHL compared to the LHL in G5 (p=0.0138). In the intergroup comparison, significant reduction in the RHL was found for G4 when compared to G1, G2, G3 and G6, and for G5 when compared to G1 and G6 (F(5;29)=13.88; p<0.0001). The LHL showed significant decrease in G4 when compared to the other groups (F(5;29)=10.72; p<0.0001) (Figure 1).

Figure 1. Thickness of the upper articular cartilage of the tibia, compared between rats in the different study groups (G1, G2, G3, G4, G5 and G6), and between the right (target) and left (control) hind limbs. The same letter represents similarities and different letters represent significant differences between experimental groups, for the same side.

Figure 1

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RHL: right hind limb; LHL: left hind limb.

Epiphyseal plate thickness

The analysis of the epiphyseal plate thickness showed a significant decrease in the RHL compared to the LHL in G5 (p = 0.0187). The intergroup comparison pointed to a significant reduction in G5 compared to the other groups, as well as higher values in G1 when compared to G4 (F(5;29)=14.72; p<0.0001) (Figure 2).

Figure 2. Thickness of the tibial epiphyseal plate e, compared between rats in the different study groups (G1, G2, G3, G4, G5 and G6), and between the right (target) and left (control) hind limbs. The same letter represents similarities and different letters represent significant differences between experimental groups, for the same side.

Figure 2

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RHL: right hind limb; LHL: left hind limb.

Chondrocyte count

As for the number of chondrocytes, G5 was the only group with a significant decrease in the RHL when compared to the LHL (p=0.0006). The comparison between experimental groups showed a significant decrease in G2, G4 and G5 compared to G6, as well as G1 and G3 compared to G5, when comparing the right hind limbs (F(5;29)=10.16; p<0.0001). When comparing the left hind limbs, G6 had higher values compared to G1, G2, G4, and G5 (F (5; 29)=5.11, p<0.0021) (Figure 3).

Figure 3. Chondrocyte count in the upper articular cartilage of the tibia (unit), compared between rats in the different study groups (G1, G2, G3, G4, G5 and G6), and between the right (target) and left (control) hind limbs. The same letter represents similarities and different letters represent significant differences between experimental groups, for the same side.

Figure 3

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RHL: right hind limb; LHL: left hind limb.

Histomorphology

In G1 (sham ovariectomy) and G4 (ovariectomy), no changes were observed in the thickness of the articular cartilage or the epiphyseal plate, and morphological aspects remained normal; however, in G4, there was significant reduction in the thickness and chondrocyte count, as shown in the histomorphometric analysis. In G2 (sham ovariectomy, immobilization and free remobilization), there were areas of articular cartilage degeneration, loss of cellular organization, flocculations, decreased chondrocyte count and some granulation tissue (pannus). In G3 (sham ovariectomy, immobilization and remobilization with ladder training), there were signs of repair of cartilaginous structures, with presence of cell clones and pannus. In G5 (ovariectomy, immobilization and free remobilization), there was evidence of degeneration of the articular cartilage, presence of cracks and flocculation, discontinuity of the tidemark, and exposure of subchondral bone. In G6 (ovariectomy, immobilization and remobilization with ladder training), there was pannus formation, subcortical blood vessel invasion into the calcified zone, as well as increase in the number of isogenous groups and the thickness of the calcified zone (Figure 4).

Figure 4. Photomicrographs of the upper articular cartilage from the right tibia of female rats, G1 (A), G2 (B), G3 (C), G4 (D), G5 (E and F) and G6 (G and H); frontal cut; hematoxylin and eosin stain. (A) Panoramic view of the articular cartilage (AC), with evidence of the tidemark (TM), and partial view of the subchondral bone (SB); (B) presence of cracks (C), flocculation (Fl) and tissue disorganization; (C) increased articular cartilage thickness, hypercellularity and increased number of isogenous groups (IG); (D) decreased articular cartilage thickness and normal cellular organization; (E) loss of articular cartilage (♦) with subchondral bone exposure; (F) presence of flocculation (Fl) on the cartilage surface; (G) restoration of the articular cartilage (♦) with pannus formation and presence of clones; (H) increased articular cartilage thickness, hypercellularity and increased isogenous groups.

Figure 4

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AC: articular cartilage; TM: tidemark; SB: subchondral bone; C: cracks; Fl: flocculation; IG: isogenous groups

DISCUSSION

The study results suggest that estrogen-deprivation induced by ovariectomy led to significant loss of articular cartilage. This hypoestrogenism changes the remodelation of cartilage tissue,(4) favoring the onset of osteoarthrosis.(1,5,6,14,15) This can be aggravated when immobilization is required, which may cause irreversible damage to the articular cartilage, i.e. the association of ovariectomy and immobilization may accelerate the onset of damage to the muscle and cartilage tissues.(16-18)

Immobilization leads to degeneration of the articular cartilage, with atrophic changes, decreased thickness, decreased synthesis of cartilage matrix proteoglycans, irregular cartilage surface, cartilage necrosis and ulceration, increased number of inflammatory cells, and lower total cartilage mass and volume.(7-9,16,19-24) Some of these characteristics were observed in the group subjected to sham ovariectomy and immobilization, indicating that immobilization may have aggressive effects as early as at 2 weeks. Also, estrogen deficiency causes morphological changes in cartilage, leading to its degeneration,(25) and this is supported by the observation of lower cartilage thickness in the left limb only in the ovariectomized group.

Exercise is indicated as a treatment for arthralgia resulting from post-menopausal osteoarthritis.(26) This option has been the most advocated for remobilization since articular motion is capable of promoting physical, biochemical and histological changes that favor restoration of macromolecular synthesis and at least partial reversibility of cartilage damage.(8,27,28) However, Portinho et al.(29) used free remobilization for 15 days associated with stretching of the soleus muscle for 30 seconds three times daily, and did not see any changes in the articular cartilage thickness resulting from immobilization and remobilization. Del Carlo et al.(9) found that immobilization for 45 days caused increase in the articular thickness and the number of chondrocytes, irregular articular surface and loss of cartilage matrix proteoglycans.

We did not find any studies investigating the cartilage-related effects on ovariectomized rats subjected to immobization with later remobilization with ladder climb training. However, some studies suggest this type of exercise can successfully promote improvement in bone mineral density and bone stiffness, and hypertrophy of the gastrocnemius, flexor digitorum longus, plantaris and triceps muscles.(30-33)

In the present study, the sham ovariectomized rats subjected to immobilization -either free remobilization (G2) or ladder training (G3) - were able to maintain the articular cartilage and growth plate thickness as well as the number of chondrocytes at levels comparable to those of the non-immobilized limb. This was also seen with the ovariectomized rats subjected to immobilization and remobilization with ladder training (G6). However, the same benefit was not seen in G5, which demonstrates that immobilization leads to significant losses of cartilage tissue in ovariectomized rats. Differently from the ladder training (G6), free remobilization was unable to reverse the deleterious effects on the cartilage tissue, probably because this would require weight-bearing on the joint. Remobilization with weight bearing on the joint promotes the secretion of proteoglycans in the matrix, allowing for restoration of the cartilage structure.(8) Treadmill exercise was shown to be useful in ovariectomized rats to protect the articular cartilage.(34)

Damage to the extracelular matrix and complete degradation of the articular cartilage may result from the increased activity of matrix metalloproteinases.(35) In the morphological analysis, we observed predominance of degraded areas, especially in G5 (ovariectomy, immobilization and free remobilization), and predominance of articular cartilage restoration in G2, G3 and G6, though more evident in the last two, due to the repairing effect of physical exercise. There was mainly the presence of pannus, increase in isogenic groups, and cell clones resulting from inflammation of joint tissues.(36) These reactions reflect the restoration of the damaged articular cartilage, due to the proliferative capacity of chondrocytes and repair of the subchondral bone, with increased nutritional support in the region promoted by remobilization programs.(9,36)

CONCLUSION

In short, ovariectomy associated with immobilization was observed to cause thinning of the articular cartilage and growth plate, decrease in the number of chondrocytes, articular cartilage degeneration, loss of cellular organization, flocculation and pannus. Free remobilization was not able to reverse the damage to the cartilage tissue of the tibia in ovariectomized and immobilized rats, but reversibility was achieved with ladder-based remobilization, evidenced by improvement of morphometric and morphological parameters with signs of repaired cartilaginous structures observed by the presence of cell clones and pannus, subcortical blood vessel invasion into the calcified zone, increased number of isogenous groups and increased thickness of the calcified zone.

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Einstein (Sao Paulo). 2015 Oct-Dec;13(4):574–579. [Article in Portuguese]

Efeitos do exercício físico sobre a cartilagem de ratas ooforectomizadas submetidas à imobilização

José Martim Marques Simas 1, Regina Inês Kunz 1, Rose Meire Costa Brancalhão 1, Lucinéia de Fátima Chasko Ribeiro 1, Gladson Ricardo Flor Bertolini 1

RESUMO

Objetivo

Analisar os efeitos do exercício físico sobre a histomorfometria da cartilagem de ratas induzidas à osteoporose e submetidas à imobilização.

Métodos

Foram utilizadas 36 ratas Wistar separadas em seis grupos: G1, G2 e G3 submetidas à pseudo-ooforectomia e G4, G5 e G6, à ooforectomia. Após 60 dias em repouso, G2, G3, G5 e G6 tiveram o membro posterior direito imobilizado por 15 dias, seguido pelo mesmo período em remobilização, sendo livres na caixa para G2 e G5, e de subida em escada para G3 e G6. Ao final do experimento, as ratas foram eutanasiadas, e suas tíbias foram retiradas bilateralmente e submetidas à rotina histológica.

Resultados

Houve aumento significativo de espessura da cartilagem articular (F(5;29)=13,88; p<0,0001) e da placa epifisária (F(5;29)=14,72; p<0,0001), bem como do número de condrócitos (F(5;29)=5,11; p<0,0021) em ratas ooforectomizadas, imobilizadas e submetidas ao exercício em escada. Nas análises morfológicas, verificaram-se degeneração da cartilagem articular com exposição de osso subcondral, perda da organização celular, descontinuidade da tidemark, presença de fissuras e floculações em ratas ooforectomizadas, imobilizadas e com remobilização livre. Nas ratas ooforectomizadas, imobilizadas e com remobilização em escada, observaram-se sinais de reparação das estruturas cartilaginosas com presença de clones, pannus, invasão de vasos sanguíneos subcorticais na zona calcificada, aumento da quantidade de grupos isógenos e espessura da zona calcificada.

Conclusão

O exercício físico de subida em escada mostrou-se efetivo no processo de recuperação do tecido cartilaginoso danificado pela imobilização, em modelo de osteoporose por ooforectomia em ratas.

Keywords: Osteoporose, Imobilização, Terapia por exercício, Modalidades de fisioterapia, Ratos Wistar

INTRODUÇÃO

A menopausa provoca a diminuição lenta e gradativa dos hormônios estrógeno e progesterona, produzindo aumento da reabsorção óssea e diminuição da absorção de cálcio pelo tecido ósseo. Dessa forma, os ossos ficam mais fragilizados e aumenta a predisposição ao aparecimento de doenças, como a osteoporose(1,2) e osteoartrite.(3) A diminuição dos níveis de estrógeno acelera a meia-vida da cartilagem e aumenta a erosão da superfície da cartilagem,(4) sendo que o modelo animal tem se apresentado como útil ferramenta para estudos relacionados à lesão da cartilagem pós-ovariectomia.(5)

A imobilização é amplamente utilizada em lesões musculoesqueléticas, e pode gerar graves prejuízos ao sistema musculoesquelético e, particularmente, à cartilagem articular, além de acarretar em incapacitação temporária ou permanente do indivíduo e em elevação dos custos de cuidados em saúde.(6,7) Vários tratamentos têm sido propostos para períodos de reabilitação pós-imobilização. No entanto, o exercício físico tem sido o mais preconizado, por melhorar a força muscular, prevenir fraturas e promover reparações na estrutura tecidual muscular, óssea e cartilaginosa.(7-11)

Assim justifica-se este estudo tendo em vista a elevação da expectativa de vida da população, o entendimento de que a menopausa pode levar a doenças como a osteoporose e osteoartrite (que são grandes problemas de saúde pública), as incapacitações e os efeitos deletérios nas estruturas teciduais decorrentes de uma imobilização, além da necessidade de tornar evidência científica recursos terapêuticos amplamente utilizados na prática clínica.

OBJETIVO

Analisar os efeitos do exercício físico sobre a histomorfometria da cartilagem de ratas induzidas à osteoporose e submetidas à imobilização.

MÉTODOS

Grupos experimentais

Foram utilizadas 36 ratas da linhagem Wistar, adultas (10±2 semanas), nulíparas, com peso médio de 317,2±22,1g, mantidas em gaiolas de polipropileno com livre acesso à água e à ração, fotoperíodo claro/escuro de 12 horas e temperatura ambiente controlada (25°±1°C). O estudo foi realizado conforme as normas éticas internacionais de experimentação animal, sendo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Unioeste, sob o parecer 4.112.

As ratas foram separadas aleatoriamente em seis grupos:

– G1 (n=6): as ratas foram submetidas à cirurgia simulada de ooforectomia (pseudo-ooforectomia) e permaneceram 60 dias sem intervenção.

– G2 (n=6): pseudo-ooforectomia e permaneceram 60 dias sem intervenção. Após, foi realizada imobilização do membro posterior direito (MPD) por 2 semanas. Posteriormente, ficaram em remobilização livre pelo mesmo período, sendo apenas colocadas em contato com uma escada nos últimos 10 dias.

– G3 (n=6): pseudo-ooforectomia e permaneceram 60 dias sem intervenção. Após, foi realizada imobilização do MPD por 2 semanas, sendo posteriormente submetidas ao exercício de subida em escada durante 10 dias, com intervalo de 2 dias após a quinta sessão. Foram realizadas 10 subidas na primeira semana (5 dias) e 20 na segunda semana (5 dias), com intervalo de 1 minuto entre as subidas.

– G4 (n=6): cirurgia de ooforectomia bilateral e permaneceram 60 dias sem intervenção.

– G5 (n=6): ooforectomia bilateral e permaneceram 60 dias sem intervenção. Após, foi realizado imobilização e remobilização semelhante ao G2.

– G6 (n=6): ooforectomia bilateral e permaneceram 60 dias sem intervenção. Após, foram realizados procedimentos de imobilização e de remobilização, semelhante ao G3.

Protocolo de ooforectomia e pseudo-ooforectomia

Para a realização da ooforectomia, pseudo-ooforectomia, imobilização e eutanásia, as ratas foram pesadas e submetidas a um protocolo de anestesia, que consistiu em injeção intraperitoneal de cloridrato de xilazina (12mg/kg) e cloridrato de cetamina (95mg/kg).

Na realização da ooforectomia, após realizada a anestesia, foram realizadas a tricotomia e a antissepsia com álcool iodado na região de baixo ventre, sendo, em seguida, feita a incisão cirúrgica longitudinal, com lâmina de bisturi número 11. Após acessar a cavidade peritoneal, foi afastado o tecido adiposo, até que se conseguissem identificar as tubas uterinas e ovários. Em seguida, realizou-se sutura com fio catgut 4.0 simples na área dos cornos uterinos, promovendo a ressecção dos ovários bilateralmente.

Ao final do procedimento, foram realizadas suturas internas com fio reabsorvível catgut 4.0 simples e as externas, com fio de nylon 4.0. A pseudo-ooforectomia consistiu na realização de todas as etapas cirúrgicas semelhantes à ooforectomia, com exceção da remoção dos ovários. Subsequente à cirurgia, as ratas permaneceram por 60 dias sem qualquer intervenção, livres na gaiola.

Protocolo de imobilização

Foi realizada imobilização conforme modelo proposto por Booth e Kelso,(12) sendo readequado para somente um dos membros, como proposto por Matheus et al.,(13)com adaptação do material utilizado para confecção de órtese estática gessada. Previamente à imobilização, realizou-se o procedimento anestésico, sendo, em seguida, realizada a MPD, desde o quadril até o tornozelo, envolvido por uma malha tubular juntamente de ataduras de algodão. Em seguida, foi moldada a órtese contensora, de aproximadamente 50g, utilizando-se atadura gessada de secagem rápida, com o MPD em extensão completa de joelho e tornozelo em flexão plantar máxima, nas ratas de G2, G3, G5 e G6.

Protocolo de remobilização

Após a retirada da imobilização, as ratas de G3 e G6 foram submetidas ao exercício de subida em escada, com 10 repetições na primeira semana (5 dias) e 20 repetições na segunda semana (5 dias), com intervalo de 1 minuto entre as subidas e de 2 dias entre as semanas. As ratas de G2 e G5 realizaram remobilização livre na gaiola, sendo colocadas em contato com uma escada a 10cm da caixa escura, uma vez apenas, no mesmo período em que era realizado o exercício com G3 e G6. O equipamento utilizado para a realização do exercício físico consistiu de uma escada com 67 degraus, com espaçamento de 1,5cm entre os degraus da grade, 20,5cm de largura, 118cm de altura e ângulo de inclinação de 80° (aproximadamente). Na região superior, havia uma câmara escura de 28,5cm de comprimento, 18,5cm de altura e 15cm de largura, que servia para que as ratas descansassem entre as séries de subidas, e para que se sentissem atraídas para um refúgio e estimuladas a realizarem o exercício.

Análise histomorfométrica e histomorfológica

Ao final do experimento, as ratas foram pesadas, anestesiadas e eutanasiadas por meio de decapitação em guilhotina. Após, foram retiradas as tíbias direitas e esquerdas, submetidas à rotina de laboratório, sendo diafanizadas e incluídas em parafina, com a realização de cortes de 7µm em micrótomo e a confecção das lâminas com cortes em plano frontal, que foram coradas em hematoxilina e eosina (HE). As lâminas foram fotomicrografadas em microscópio Olympus DP71® em três pontos para as análises da cartilagem articular, denominados P1, P2 e P3, que correspondem respectivamente às porções lateral, intermédia e medial da tíbia. Para a análise da placa epifisária, foi realizada fotomicrografia do ponto intermediário. Foi utilizado aumento de 200 vezes para a realização de mensurações da espessura da cartilagem articular e placa epifisária, e também para a contagem do número de condrócitos. As imagens foram submetidas à análise por meio do programa Image Pro-Plus 6.0®. Para a análise histomorfológica, foram observadas, na cartilagem articular, a estrutura e a organização celular, como presenças de alterações na superfície articular.

Análise estatística

Os dados da pesquisa foram avaliados por meio da comparação dos resultados obtidos no membro posterior esquerdo (MPE − controle) e MPD (imobilizado), entre as ratas do mesmo grupo e entre os grupos experimentais. Para isso, foi utilizado o programa BioEstat 5.0, com os valores apresentados em média e desvio padrão. Foi realizado o teste t de Student pareado para a comparação entre o lado direito e esquerdo, dentro do mesmo grupo, e Análise de Variância (ANOVA) unidirecional para comparação entre grupos experimentais para os lados direito e esquerdo. O nível de significância estatística considerado foi de p≤0,05.

RESULTADOS

Espessura da cartilagem articular

Para a espessura da cartilagem articular, observou-se diminuição significativa do MPD em relação ao MPE nas ratas do G5 (p=0,0138). Na comparação intergrupos, para o MPD, houve redução significativa do G4 em relação ao G1, G2, G3 e G6, como também do G5 em relação ao G1 e G6 (F(5;29)=13,88; p<0,0001). No MPE, notou-se diminuição significativa nas ratas de G4 em relação às outras (F(5;29)=10,72; p<0,0001) (Figura 1).

Figura 1. Espessura da cartilagem articular superior da tíbia, comparando-se as ratas distribuídas entre os grupos de estudo (G1, G2, G3, G4, G5 e G6) e os membros posteriores direito (alvo) e esquerdo (controle). Letras iguais significam semelhanças e letras diferentes significam diferenças significativas entre os grupos experimentais, para o mesmo lado.

Figura 1

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MPD: membro posterior direito; MPE: membro posterior esquerdo.

Espessura da placa epifisária

Na análise da espessura da placa epifisária, observou-se diminuição significativa do MPD em relação ao MPE em G5 (p=0,0187). Na comparação intergrupos para o MPD, notou-se redução significativa do G5 em relação aos outros grupos, além de maiores valores em G1 com relação ao G4 (F(5;29)=14,72; p<0,0001) (Figura 2).

Figura 2. Espessura da placa epifisária da tíbia, comparando-se as ratas distribuídas entre os grupos de estudo (G1, G2, G3, G4, G5 e G6) e os membros posteriores direito (alvo) e esquerdo (controle). Letras iguais significam semelhanças e letras diferentes significam diferenças significativas entre os grupos experimentais, para o mesmo lado.

Figura 2

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MPD: membro posterior direito; MPE: membro posterior esquerdo.

Número de condrócitos

Em relação ao número de condrócitos, somente em G5 houve diminuição significativa do MPD em comparação com o MPE (p=0,0006). Na comparação entre os grupos experimentais, observou-se diminuição significativa de G2, G4 e G5 em relação ao G6, e também de G1 e G3 com respeito ao G5, na comparação entre os membros posteriores direitos (F(5;29)=10,16; p<0,0001). Entre os esquerdos, houve valores maiores de G6 ao comparar com G1, G2, G4 e G5 (F(5;29)=5,11; p<0,0021) (Figura 3).

Figura 3. Números de condrócitos na cartilagem articular superior da tíbia (unidade), comparando-se as ratas distribuídas entre os grupos de estudo (G1, G2, G3, G4, G5 e G6) e os membros posteriores direito (alvo) e esquerdo (controle). Letras iguais significam semelhanças e letras diferentes significam diferenças significativas entre os grupos experimentais, para o mesmo lado.

Figura 3

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MPD: membro posterior direito; MPE: membro posterior esquerdo.

Histomorfologia

Em G1 (grupo pseudo-ooforectomizado) e G4 (grupo ooforectomizado), não foram verificadas mudanças na estrutura da cartilagem articular e nem da placa epifisária, demonstrando aspectos morfológicos normais, mas, em G4, visualizou-se considerável diminuição na espessura e no número de condrócitos, como já evidenciada na análise histomorfométrica. Nas ratas de G2 (grupo pseudo- -ooforectomizado, imobilizado e com remobilização livre), foram observadas regiões de degeneração da cartilagem articular, perda da organização celular, floculações, diminuição da quantidade de condrócitos e algumas regiões com tecido de granulação (pannus). Já no G3 (grupo pseudo-ooforectomizado, imobilizado e remobilização em escada), notaram-se sinais de reparação das estruturas cartilaginosas, com presença de clones celulares e de pannus. Em G5 (grupo ooforectomizado, imobilizado e remobilização livre), foram evidenciadas degeneração da cartilagem articular, presença de fissuras e floculações, descontinuidade da tidemark e exposição de osso subcondral. Em G6 (grupo ooforectomizado, imobilizado e remobilização em escada), foram visualizados formação de pannus, invasão de vasos sanguíneos subcorticais na zona calcificada, aumento da quantidade de grupos isógenos e da espessura da zona calcificada (Figura 4).

Figura 4. Fotomicrografias da cartilagem articular superior da tíbia direita de ratas, G1 (A), G2 (B), G3 (C), G4 (D), G5 (E e F) e G6 (G e H); corte frontal; coloração em hematoxilina e eosina. (A) Vista panorâmica da cartilagem articular (CA), com evidência para a tidemark (TM) e visualização de parte de osso subcondral (OS); (B) presença de fissuras (F), floculações (Fl) e desorganização tecidual; (C) aumento da espessura da cartilagem articular, hipercelularidade e aumento do número de grupos isógenos (GI); (D) diminuição da espessura da cartilagem articular e organização celular normal; (E) perda da cartilagem articular (♦) com exposição de osso subcondral; (F) presença de floculações na superfície da cartilagem (FI); (G) recuperação da cartilagem articular (♦) com formação de pannus e presença de clones; (H) aumento da espessura da cartilagem articular, hipercelularidade e aumento de grupos isógenos.

Figura 4

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CA: cartilagem articular; TM: tidemark; OS: osso subcondral; F: fissuras; Fl: floculações; GI: grupos isógenos.

DISCUSSÃO

Os resultados do estudo apontam que a privação hormonal estrogênica, provocada pela ooforectomia, ocasionou perda significativa de cartilagem articular. Esse hipoestrogenismo altera o processo de remodelação do tecido cartilaginoso,(4) favorecendo o aparecimento da osteoartrose.(1,5,6,14,15) Tal fato pode ser agravado quando há necessidade do uso de imobilização, podendo provocar lesões irreversíveis à cartilagem articular, ou seja, a associação entre a ooforectomia e imobilização pode levar mais rapidamente à instalação de prejuízos nos tecidos muscular e cartilaginoso.(16-18)

A imobilização provoca degeneração da cartilagem articular, com alterações atróficas, redução de sua espessura e da síntese de proteoglicanos da matriz da cartilagem, irregularidade da superfície articular, necrose e ulceração da cartilagem, aumento do número de células inflamatórias, redução da massa e volumes totais da cartilagem.(7-9,16,19-24) Algumas destas características foram observadas no grupo pseudo-ooforectomizado e imobilizado, indicando efeitos agressivos da imobilização em apenas 2 semanas. Ainda, a deficiência de estrogênio leva a alterações na morfologia da cartilagem, direcionando à degeneração da mesma,(25) conforme foi observado que apenas o grupo ooforectomizado apresentou valores menores, com relação à espessura da cartilagem, do membro esquerdo entre os grupos.

O exercício físico é indicado como forma de tratamento para a artralgia advinda da osteoartrite pós-menopáusica.(26) Esse recurso tem sido o mais preconizado para remobilização, pois, por meio do movimento articular, é possível promover mudanças físicas, bioquímicas e histológicas que favorecem o retorno à síntese de macromoléculas e proporcionam reversibilidade, pelo menos parcial, das lesões causadas na cartilagem.(8,27,28) No entanto, Portinho et al.,(29) utilizando remobilização livre por 15 dias, associado a três séries, de 30 segundos, diárias, de alongamento do músculo sóleo não observaram mudanças na espessura da cartilagem articular pela imobilização e remobilização. Já Del Carlo et al.(9) verificaram que a imobilização por 45 dias provocou aumento da espessura articular e do número de condrócitos, irregularidade da superfície articular e perda de proteoglicanos da matriz da cartilagem.

Não foram encontrados estudos que verificassem os efeitos sobre a cartilagem, em ratas ooforectomizadas e submetidas à imobilização, com posterior remobilização em treino de subida em escada. Porém alguns apontam sucesso desse tipo de exercício na promoção de melhora na densidade mineral óssea, na rigidez óssea e na hipertrofia dos músculos gastrocnêmio, flexor longo dos dedos, plantar e tríceps braquial.(30-33)

No presente estudo, foi verificado que, em ratas pseudo-ooforectomizadas e submetidas à imobilização − tanto a remobilização livre (G2) como em escada (G3) − foram capazes de manter a espessura da cartilagem articular e placa epifisária, como também o número de condrócitos, em níveis semelhantes aos do membro não imobilizado. Isso ocorreu também com as ratas ooforectomizadas, imobilizadas e em remobilização em escada (G6). No entanto, tal benefício não foi alcançado com as ratas de G5, demonstrando que a imobilização provoca perdas significativas no tecido cartilaginoso em ratas ooforectomizadas, e a remobilização livre não foi capaz de reverter os efeitos deletérios no tecido cartilaginoso, ao contrário da remobilização em escada (G6), provavelmente por requerer uma carga intensa sobre a articulação, visto que a remobilização, com descarga de peso sobre a articulação, promove a secreção de proteoglicanos na matriz celular, viabilizando a restauração da estrutura da cartilagem.(8) Já foi demonstrado que o exercício em esteira mostrou-se útil em ratas ooforectomizadas quanto à proteção da cartilagem articular.(34)

As lesões da matriz extracelular e degradação completa da cartilagem articular podem derivar de maior atividade das metaloproteinases da matriz.(35) Na análise morfológica, foi verificado predomínio de áreas degradadas, principalmente em G5, que realizou ooforectomia, imobilização e remobilização livre; e área com predomínio de recuperação da cartilagem articular, em G2, G3 e G6, sendo mais evidente nas duas últimas, apontando, assim, efeito reparador do exercício físico. Havia principalmente presença de pannus, aumento de grupos isogênicos e clones celulares, que decorrem da presença de inflamação dos tecidos articulares.(36) Essas reações refletem um processo de recuperação frente aos danos ocasionados na cartilagem articular, visto a capacidade proliferativa dos condrócitos e reparo do osso subcondral, com aumento do aporte nutricional na região, alcançadas por meio de programas de remobilização.(9,36)

CONCLUSÃO

Em suma, observou-se que a ooforectomia, associada à imobilização, provocou diminuição da espessura da cartilagem articular e placa epifisária, além de diminuição do número de condrócitos, degeneração da cartilagem articular, perda da organização celular, floculações e pannus. A remobilização livre não foi capaz de recuperar as lesões ocasionadas no tecido cartilaginoso da tíbia de ratas ooforectomizadas e imobilizadas, mas a reversibilidade foi alcançada com a remobilização em escada, com melhora dos parâmetros morfométricos e morfológicos, com sinais de reparação das estruturas cartilaginosas, observados pela presença de clones celulares e de pannus, invasão de vasos sanguíneos subcorticais na zona calcificada, aumento da quantidade de grupos isógenos e da espessura da zona calcificada.

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