Limbal Kök Hücre Yetmezliğinde Kültüre Edilmiş Limbal Epitel Hücreleri ile Oküler Yüzey Rekonstrüksiyonunun Bir Yıllık Sonuçları

Özet

Amaç

Tek taraflı limbal kök hücre yetmezliğinin (LKHY) tedavisinde, kültüre edilmiş limbal epitel hücreleri (KLEH) ile oküler yüzey rekonstrüksiyonunun, bir yıllık sonuçlarının değerlendirilmesi.

Gereç ve Yöntem

Tek taraflı LKHY tedavisinde, KLEH ile oküler yüzey rekonstrüksiyonu uygulanan 5 hastanın bir yıllık sonuçları değerlendirildi. Bu değerlendirmede başlıca parametreler görme keskinliği, oküler yüzeyin flöressein ile boyanması, korneal vaskülarizasyon ve biyomikroskopta epitelin görünümü idi.

Biyopsi ve Laboratuvar tekniği

Unilateral LKHY hastalarının, sağlam gözlerinin üst limbuslarından 1,5 mm uzunluğunda limbal biyopsi alındıktan sonra iki eşit parçaya ayrılarak amniyotik membran ve insertlere ekildi. 14 günlük kültür sonrası yaklaşık 20 mm boyutlarına gelen epitel, amniyotik membran ile direkt, insertteki ise altındaki materyalden serbestleştirilerek kullanıldı.

Cerrahi teknik

LKHY olan gözlerde, semblefaron ve pannus dokuları temizlendi. Yüzeyel keratektomi yapıldıktan sonra KLEH içeren amniyotik membran epitel yukarıda olarak 10-0 monoflaman nylon sütür ile konjunktivaya 360 derece sütüre edildi. Üzerine insert üzerinde kültüre edilmiş ve ardından serbestleştirilmiş epitel tabakası yerleştirildi. En üste ise koruyucu amaçlı olarak tek katlı amniyotik membran konuldu ve konjunktivaya 360 derece sütüre edildi.

Sonuçlar

Hastaların yaş ortalaması 44,4 yıl (14–71) idi. Hastaların tümünde LKHY’nin nedeni alkali yanığıydı ve semptomların süresi ortalama 10 (2–18) yıldı. Ameliyat öncesi görme keskinliği 3 hastada ışık hissi, 1 hastada 50 cm’den parmak sayma, 1 hastada ise 0,3 düzeyindeydi. Ortalama 12,6 (12–12,5) aylık izlem sonunda tüm hastalarda görme düzeyleri arttı ve görmeler 3 metreden parmak sayma ile 0,6 arasındaydı. Postoperatif dönemde, bir hastada iki amniyotik membran tabakası arasında geçici hemoraji gözlendi. Üç hastada periferal korneal vaskülarizasyon gelişti, 1 hastada ise parasantrale kadar uzandı.

Tartışma

Unilateral LKHY tedavisinde, KLEH ile oküler yüzey rekonstrüksiyonu tedavisi orta-uzun dönemde güvenli ve etkili bir yöntemdir.

Giriş

Limbal kök hücre yetmezliği (LKHY) korneal epitelizasyon zorluğu, kalıcı epitel defekti, korneal vaskülarizasyon ve korneanın konjunktivalizasyonu ile karakterize karmaşık bir oküler patalojidir.¹ Bu hastalığın etyolojisinde kimyasal ve termal yanıklar, Stevens-Johnson sendromu, oküler skatrisyel pemphigoid, travma, aniridi, ektodermal displazi ve iatrojenik sebepler gibi birincil ve ikincil nedenler yer almaktadır.²

LKHY tedavisinde, amniyotik membran ile yüzey rekonstrüksiyonu, otolog veya allojenik limbal doku nakli ve keratoplasti gibi birçok tedavi yaklaşımı mevcuttur.³ Bu tedavi seçeneklerinden limbal doku nakli, hem akut hem de kronik LKHY tedavisinde, diğerleriyle karşılaştırıldığında daha başarılı klinik sonuçlara sahiptir.^4,5 Limbal doku naklinde, hastanın diğer gözünden veya akrabalarının bir gözünden 120 derece veya 180 derece (2 tane 90 derece) limbal doku alınması gerekmektedir. Bu kadar geniş limbal alanların nakledilmesi, uzun dönemde verici gözlerde LKHY oluşturması riskine sahiptir. Bu risk, özellikle tek taraflı vakalarda daha da önem taşımaktadır.⁶ Ayrıca limbal otogreft başarısız olursa hastanın sağlam gözünden veya aynı akrabanın aynı gözünden tekrar limbal doku alınması mümkün değildir. Allogreft nakillerinde, korneada bol miktarda mevcut olan Langerhans hücrelerinden kaynaklanan yüksek immunolojik uyarı, greft reddine ve LKHY’nin tekrar ortaya çıkmasına neden olabilmektedir.⁷ Ayrıca ister hasta yakınlarından isterse kadavradan alınsın, allogreft limbal nakil sonrası hastalar uzun süre ciddi immünsüpresif tedavi almak zorunda kalmaktadırlar.

Günümüzde ise LKHY tedavisinde, çok küçük bir limbal doku kullanılarak, hem verici gözde LKHY oluşma riskini çok azaltan hem de geretiğinde tekrarlama olasılığı bulunan ayrıca immunsupresyon gerektirmeyen kültüre edilmiş limbal epitel hücre (KLEH) nakli umut veren bir tedavi seçeneğidir. Bu yöntemde 1×1 mm limbal biyopsi dokusu in vitro koşullarda çoğaltılarak hasta göze nakledilmektedir.^8–11 Bu yöntemle limbal kök hücre yetmezliğinde başarı oldukça artmıştır. Schgwan ve ark başarı oranını %73 olarak bildirmişlerdir.¹²

Biz de bu çalışmada bildiğimize göre Türkiye’de ilk kez yapılan, alkali yanığa bağlı gelişen limbal kök hücre yetmezliğinde, KLEH transplantasyonu ile oküler yüzey rekonstrüksiyonunun 1 yıllık sonuçlarını değerlendirmeyi amaçlamaktayız.

Gereç ve Yöntem

Tek taraflı LKHY nedeniyle KLEH ile oküler yüzey rekonstrüksiyonu yapılan 5 hastanın medikal kayıtları değerlendirildi. LKHY tanısı, kornea üzerinde konjunktivalizasyon, inflamasyon, inatçı korneal epitel defekti, Vogt palizadları kaybı ve hasta hikayesine dayanarak klinik olarak konuldu. Hastalar yapılacak cerrahi işlem konusunda bilgilendirildi ve yazılı onam alındı. Tüm hastalara hem insan amniyotik membranı (İAM) hem de insert üzerinde büyütülen KLEH transplantasyonu uygulandı.

Steril koşullar altında, topikal anestezi eşliğinde, tek taraflı LKHY olan hastaların sağlam göz superior limbuslarından 1,5 mm uzunluğunda limbal biyopsi alındı (Resim 1). Limbal biyopsi alınan sağlam gözlerde, postoperatif olarak antibiyotik damla kullanıldı. Biyopsi sonrası sağlam gözler, birinci ve 15. günlerde donör dokunun iyileşmesini kayıt altına almak için fotoğraflandı.

Resim 1.

Sağlam göz superior limbuslarından 1,5 mm uzunluğunda alınan limbal biyopsiden 1. hafta sonraki görünümü

Laboratuvar Tekniği

HIV ve hepatit gibi bulaşıcı hastalıklar açısından seronegatif olan gönüllü sezeryan vakalarından alınan İAM, hastanemiz göz bankasında hazırlanarak saklandı ve taşıyıcı bir membran olarak kullanıldı. Kullanım öncesi %0,1 steril EDTA solüsyonu ile 60 dakika muamele edildikten sonra epiteli mekanik olarak kazılarak nazikçe uzaklaştırıldı.

Tek taraflı LKHY olan hastaların sağlam gözlerinden alınan limbal biyopsiler, Optisol-GS (Chiron Intraoptics, Irvine, CA) solüsyonu içerisinde kültür laboratuvarına taşındı.

Biyopsi dokuları iki eşit parçaya ayrılarak amniyotik membran ve 6 kuyulu hücre kültürü kabına uygun motilite insertlerine ekildi (Resim 2). İnsan zenginleştirilmiş epitel ortamı (DMEM/F12, 5 % FBS, 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü, %0,5 dimetil sülfksit, 10 ng/mL kolera toksini A) içerisinde, %5 CO2 inkübatoründe 37°’de 14 gün kültüre edildi. Bu süre boyunca KLEH’lerin kültür ortamları gün aşırı değiştirildi. Başlangıç hücre büyümeleri, inkübasyondan 48 saat sonra gözlendi ve kayıt altına alındı (Resim 3).

Resim 2.

Biyopsi dokularının ekimi için amniyotik membran hazırlanması

Resim 3.

İnkübasyondan 48 saat sonraki biyopsi dokusundan başlayan hücre proliferasyonu

Ameliyattan hemen önce, insert üzerinde büyüyen tek katlı KLEH tabakası dispaz ile insertten serbestleştirildi ve ameliyatta kullanılmak üzere Amniyotik membran üzerinde büyütülen KLEH ile beraber ameliyathaneye nakledildi.

Cerrahi Teknik

Genel anestezi altında, steril şartlarda, semblefaron ve pannus dokuları temizlendi ve yüzeyel keratektomi yapıldı. 20 mm çapındaki amniyotik membran üzerinde tek sıra halinde büyütülen KLEH, 10,0 monoflaman ile konjunktivaya, epitel tarafı yukarıda olacak şekilde 360° sütüre edildi (Resim 4). İnsert üzerinde büyüyen tek katlı KLEH tabakası ise dispaz ile insertten serbestleştirildi ve ikinci kat olarak kornea üzerine konuldu. Hepsinin üzerine ise, tek katlı amniyotik membran koruyucu amaçla konuldu ve konjunktivaya çepeçevre sütüre edildi (Şekil 1).

Resim 4.

1 numaralı hastanın operasyon sırasında amniyotik membran trans-plantasyonu

Şekil 1.

Kültüre edilmiş limbal epitel hücre nakli: Sağlam gözden limbal biyopsi alınır, kültür ortamında amniyotik membran üzerinde büyütülür ve hasta göze nakledilir

Postoperatif Takip

Postoperatif dönemde topikal antibiyotik, steroid, siklosporin, otolog serum ve yapay gözyaşı kullanıldı. Hastalar, operasyondan sonra ilk 5 gün günlük, ilk ay haftalık ve ilk aydan sonra iki ay boyunca iki haftada bir ve sonrasında aylık olarak değerlendirildi. Klinik olarak gerektiğinde izlem sayısı arttırıldı. Naylon sütürler gevşedikçe, topikal anestezi altında alındı. İzlem sırasında, kornea üzerine vaskülarizasyon gelişmeye başladığında subkonjunktival 2,5 mg (0,1 ml) ve/veya topikal bevacizumab 10 mg/ml (Altuzan-Roche) kullanıldı ve gerektiğinde tekrarlandı. Tüm hastalarda görme keskinliği ve oküler yüzeyin durumu değerlendirilerek kaydedildi. Oküler yüzeyin flöressein ile boyanması, korneal vaskülarizasyon ve biyomikroskopta epitelin görünümü değerlendirildi. Hastalar, ameliyat öncesi ve sonrası yanma, batma ve yabancı cisim hissi gibi oküler yüzey irritasyon bulguları açısından sorgulandı, tüm kontrol muayenelerinde fotoğrafları çekildi ve kaydedildi (Resim 5).

Resim 5.

1 numaralı hastaya ait operasyon öncesi ve operasyon sonrası 6. ay fotoğrafı. Bu hastaya daha sonra komplikasyonsuz fakoemülsifikasyon ve göziçi lens implantasyonu yapıldı

Bulgular

Tüm hastalarda, tek taraflı LKHY tanısı öykü ve klinik muayene ile konuldu. Hastaların yaş ortalaması 44,4 yıl (14–71) idi. Hastaların tümünde LKHY’nin nedeni alkali yanığıydı ve yanıklar ortalama 10 yıl (2–18) önce oluşmuştu. Üç hastada total semblefaron ve pannus dokusu mevcuttu. Bir hastada, tam merkezde olması nedeniyle görmeyi ciddi oranda azaltan yüzeyel kornea opasitesi bulunmaktaydı. Bir hastada ise, görme düzeyi iyi olmakla beraber hastanın belirgin korneal irritasyon yakınmaları bulunmaktaydı. Ameliyat öncesi görme keskinliği 3 hastada ışık hissi, 1 hastada 50 santimetreden parmak sayma, 1 hastada ise 0,3 düzeyindeydi.

İntraoperatif olarak herhangi bir komplikasyonla karşılaşılmadı. Postoperatif erken dönemde, bir hastada iki amniyotik membran arasında geçici hemoraji gözlendi. Hemoraji müdahale edilmeksizin rezorbe oldu.

Ortalama izlem süresi 12,6 (12–12,5) ay idi. Oküler stabilizasyon, tüm hastalarda 2 ay sonunda sağlandı ve hastaların hepsinde görme artışı gözlendi (Tablo 1).

Tablo 1.

Hastaların ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası görme keskinlikleri

Hasta	Ameliyat öncesi Görme Keskinliği	Ameliyat sonrası Görme Keskinliği
1	P+	0,1
2	P+	3 MPS
3	P+	0,2
4	50cmps	0,5
5	0,3	0,6

İzlemde 5 hastanın 3′ünde lokalize vaskülarizasyon ve konjunktivalizasyon gözlendi, bir hastada bu vaskülarizasyon parasantrale kadar ulaştı ve bu hastalara vaskülarizasyon gerileyinceye kadar subkonjunktival ve/veya topikal bevacizumab (Altuzan-Roche) uygulandı. Hastaların tümünde 10 mg/ml konsantrasyonunda hazırlanan bevacizumab topikal olarak önce 2 saatte bir damla daha sonra ise 4×1 olarak 2–3 ay kullanıldı. İki hastada ise ikişer kez subkonjuktival 1,25 mg (0,1 ml) bevacizumab yapıldı. Ayrıca bir hastada limbal kök hücre naklinden 8 ay sonra komplikasyonsuz fakoemülsifikasyon ve göz içi lens implantasyonu yapıldı.

Tartışma

LKHY tedavisi, halen oftalmolojinin tartışmalı konuları arasında yerini korumaktadır. LKHY tedavisinde, amniyotik membran ile yüzey rekonstrüksiyonu, otolog ve allojenik limbal doku nakli ve keratoplasti gibi birçok tedavi yaklaşımı tarif edilmesine rağmen, henüz üzerinde fikir birliğine varılan etkin ve kalıcı bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır.³ Son zamanlarda KLEH transplantasyonu, oftalmolojinin önemli araştırma konuları arasında yer almakta ve umut veren bir tedavi seçeneği olarak görülmektedir.^8–11

Pellegrini ve arkadaşları,⁹ ilk kez 1997 yılında, limbal kök hücrelerin ex vivo olarak çoğaltılabileceğini ve bu yöntemin LKHY tedavisinde kullanılabileceğini göstermişlerdir. Çalışmalarında, total kornea ve limbal epitel kaybı olan iki hastada, kültüre edilmiş otolog hücreler ile kornea yüzeyinin düzeldiğini göstermişlerdir. İki yılı geçen uzun dönem takiplerinde de, rejenere olan korneal epitelinin stabil kaldığını, hasta yakınmalarında ve görme keskinliğinde dramatik düzelme olduğunu bildirmişlerdir. Bu tarihten günümüze gelişen süreçte, limbal epitel hücre kültürlerinde birçok değişik yöntem denenmiştir. Bu yöntemler arasında, limbal epitel hücrelerin İAM üzerinde, amniyotik membranın epitel hücreleri korunarak veya deepitelize edilerek çoğaltılması, explant kültür uygulamaları, 3T3 fıbroblast besleyici tabakalarının kullanımı ve hava-yükseltme tekniklerinin kullanımı yer almaktadır.^13–19

Sangwan ve arkadaşlar¹² 2006 yılında, LKHY olan 86 hastanın 88 gözünde (81 hasta total LKHY) KLEH transplantasyonu yaptıkları ve ortalama 18,3 ay izledikleri çok geniş bir hasta serisinin klinik sonuçlarını yayınlamışlardır. Tekniğin başarısını, en az altı hafta takibi olanlarda, stabil bir oküler yüzey ve hasta semptomlarında subjektif iyileşme olarak tanımlamışlardır. Hastaların %64′ünde LKHY nedeninin alkali yanığı olduğunu belirtmişlerdir. Elliyedi hastada (%73,1) konjunktivalizasyon gelişmemiş ve stabil bir oküler yüzey elde edilmişken, 21 (%26,9) gözde sonuçlar başarısız olarak değerlendirilmiş ve 10 hasta ise takipten çıktığı için değerlendirilememiştir.

KLEH naklinin standardize edilmeye çalışılması da günümüz araştırma konularının başında gelmektedir. Bu amaçla Kolli ve arkadaşları²⁰ çalışmalarında, kültür esnasında insana ait olmayan tüm ürünlerden arındırılmış ürünler kullanmışlar ve bu teknikle 8 LKHY hastasında objektif ve subjektif kriterlere göre %100 klinik başarı tanımlamışlardır. Ayrıca ilk kez kültürün tüm aşamalarını iyi üretim pratiği (Good manufacturing practice) şartlarında yapmışlar ve bunun önemine dikkat çekmişlerdir.

Postoperatif klinik başarının arttırılmasında, otolog serum ve bevacizumab uygulamalarının etkinliği de araştırılmaktadır. Thanos ve arkadaşları,²¹ epidermolizis bülloza distrofika mutilans Hallopeau-Siemensa nedeniyle gelişen kısmi LKHY’lı bir hastada KLEH nakli yapmışlar ve bu olguda 3 kez subkonjunktival bevacizumab ve otolog serum tedavisi uygulamışlardır. Yirmisekiz aylık izlem sonucunda LKHY’nin tekrar gelişmediğini bildirmişlerdir.

KLEH nakli, LKHY tedavisinde görece yeni ve oldukça umut veren bir tedavi seçeneğidir. Bu tedavi yöntemi, dönor gözden minimal doku alınmasını sağlayarak LKHY gelişim riskini en aza indirmesi, tekrarlanabilir olması, stromal skar ve benzeri eşlik eden korneal patolojiler için gerekli keratoplasti operasyonunun başarısını arttırması gibi üstünlüklere sahiptir. Ayrıca gelecekte limbal kök hücrelerin moleküler biyolojisinin daha iyi tanımlanması ile daha iyi tedavi seçeneklerinin geliştirilmesi mümkün olabilecektir. Bununla birlikte, halen standardize olmuş bir yöntemin olmaması, hem cerrahi hem hücre kültürü açısından yetişmiş kalifiye insan gücüne ihtiyaç duyması, yüksek niteliklere sahip laboratuvar ve cerrahi donanım gerektirmesi gibi dezavantajları da mevcuttur.

Biz de çalışmamızda, Türkiye’de ilk kez KLEH nakli ile tedavisi yapılan beş LKHY hastasının sonuçları ile bu tedavinin etkinliğini değerlendirdik. Çalışmamızda literatürdekilerinden farklı olarak cerrahi yöntemde bazı modifikasyonlar yaptık. Kültüre edilmiş limbal kök hücreleri içeren amniyotik membrana ek olarak, ikinci kat olarak insert üzerinde tek kat halinde büyütülen KLEH’i de kullandık. Ayrıca iki kat KLEH üzerine koruyucu olarak amniyotik membran koyduk. Takiplerimizde otolog serum ve vaskülarizasyon aktivasyonuna göre gerektikçe subkonjunktival ve topikal bevacizumab tedavisi uyguladık. Hastaların en az 12 aylık izlemlerinde, bu tedavi yönteminin, tek taraflı alkali yanığına bağlı gelişen LKHY’da etkili ve başarılı bir yöntem olduğunu gözlemledik. Bu çalışmada, tekniğin 1 yıllık izlem dönemi için etkin ve güvenilir olduğunu, ancak daha uzun süreli izlemler ile araştırılması gerektiğini düşünüyoruz.