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. 2017 Jul 20;20(7):459–467. [Article in Chinese] doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2017.07.04

环状RNA CircHIPK3通过miR-379调控IGF1表达促进非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299与NCI-H2170的细胞增殖

Circular RNA CircHIPK3 Promotes NCI-H1299 and NCI-H2170 Cell Proliferation through miR-379 and its Target IGF1

田 芳 1,2,*, 王 云 1, 肖 哲 1, 朱 学军 2
PMCID: PMC5972943  PMID: 28738961

Abstract

背景与目的

已有的研究证明：环状RNA是一类在哺乳动物中普遍存在的具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子。环状RNA circHIPK3（circular RNA HIPK3, circHIPK3）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中表达水平较高，促进肝癌细胞生长。但是其在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的作用及其调控机制尚无文献报道。本研究拟探讨环状RNA circHIPK3对NSCLC细胞系NCI-H1299和NCI-H2170细胞增殖的影响，并进一步研究其调控的分子机制。

方法

Real-time PCR法检测circHIPK3在NSCLC各细胞系中的表达水平。CCK-8实验和克隆形成实验检测过量表达和干扰circHIPK3对细胞增殖的影响。双荧光素酶报告基因实验分别检验miR-379与circHIPK3及miR-379与IGF1 mRNA的结合情况。Western blot和ELISA检测细胞内外的IGF1蛋白表达水平。

结果

环状RNA circHIPK3在6株NSCLC细胞株中均有表达，其中H1299表达最低，H2170表达最高，通过转染过表达的circHIPK3可显著促进NCI-H1299细胞增殖，干扰circHIPK3可显著抑制NCI-H2170细胞增殖。miR-379可与circHIPK3及IGF1 mRNA直接结合。过表达circHIPK3导致IGF1表达量上调，干扰circHIPK3能够下调IGF1表达水平，转入miR-379 mimics恢复了circHIPK3稳转细胞株IGF1表达水平的上调及细胞增殖表型。

结论

环状RNA circHIPK3在NSCLC细胞系NCI-H1299及NCI-H2170中可通过miR-379调控IGF1表达促进细胞增殖，环状RNA circHIPK3可能成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。

Keywords: 肺肿瘤, 环状RNA, CircHIPK3, 增殖

肺癌是世界上发病率和死亡率较高的肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的发病人数约占肺癌的85%[1, 2]。虽然对NSCLC的相关治疗已经取得了一定程度的进展，但是肺癌的5年生存率依然低于15%[3, 4]。因此，研究其分子机制及发现新的治疗靶点对肺癌治疗至关重要。

环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类广泛存在于哺乳动物体内的非编码RNA，主要参与生物体内基因调控[5-7]。CircRNA大部分来源于基因的外显子区域，也有少部分由内含子剪接形成[8, 9]。与长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）及microRNA（miRNA）不同之处在于，它们不具备5’端和3’端结构，而是由共价闭合的环状结构形成[10]。CircRNA广泛地参与到人类的生理和病理调控的过程中。环状RNA可以通过：①作为miRNA“海绵体”（miRNA sponge）；②与蛋白结合互作；③和翻译成多肽等多种的方式发挥功能，在肿瘤研究中，环状RNA作为miRNA“海绵体”调控下游靶基因的机制已经被广泛报道[11-13]。目前发现多个环状RNA自身包含至少一个miRNA结合位点，因此，其可以作为RNA的“海绵体”吸附miRNA，从而通过竞争性内源RNAs（competing endogenous RNA, ceRNAs）的机制调控被miRNA抑制的下游靶基因的表达[11]。竞争性内源RNAs理论在2010年由Pandolfi等提出，研究发现在细胞中的长链非编码RNA、假基因RNA和环状RNA与编码蛋白的mRNA包含共同的可以被miRNA结合的位点，通过诱饵或“海绵”吸附的机制竞争性的结合miRNA，导致这些不同类型的RNA之间形成相互调控的网络，在细胞的各个生理过程中发挥重要的功能[14]。在现有研究[15]报道中，环状RNA ciRS-7和circFOXO3等都可以通过ceRNA的机制调控肿瘤细胞的发生与发展。环状RNA HIPK3（circular RNA HIPK3, circHIPK3）在肝、脑、肺中高表达，其主要起源于基因HIPK3的第二个外显子。HIPK3起源的环状RNA有3种剪接体，分别为circHIPK3、circHIPK3.1和circHIPK3.2。但是只有circHIPK3丰度较高，并且在细胞中具有显著的功能。研究发现circHIPK3可以结合多个miRNA，包括miR-124和miR-379等。在肝癌中，circHIPK3可以作为“海绵体”吸附miR-124，通过ceRNA机制上调miR-124下游靶基因IL6R和DXL2，从而促进肝癌细胞的增殖[16]。但NSCLC中环状RNA HIPK3的表达及调控机制尚未明晰。

此外，miR-379是抑制肿瘤细胞增殖的一类miRNA。在NSCLC中，miR-379可以增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂的杀伤能力[17]。研究表明在血管平滑肌细胞中，miR-379可以通过调控类胰岛素样生长因子（insulin like growth factor, IGF1）从而达到抑制了细胞增殖、侵袭与转移的作用。IGF1在前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤细胞的增殖[18]。本研究中，主要报道了circHIPK3在NSCLC细胞系NCI-H1299和NCI-H2170中的功能，并初步提出circHIPK3可以通过miR-379/IGF1促进NSCLC细胞系NCI-H1299和NCI-H2170细胞增殖的机制，希望能为NSCLC治疗提供了一个新的治疗靶点。

1. 材料与方法

1.1. 材料

NCI-H1299和NCI-H2170细胞株（购自ATCC细胞库）；BCA蛋白含量检测试剂盒（购自北京全式金有限责任公司）；RPMI-1640、高糖DMEM、胰酶（购自美国GIBCO公司）；荧光定量Real-Time PCR试剂盒、点突变试剂盒（购自南京诺唯赞公司）；RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒、Lipo2000、DMSO、DEPC水（购自美国Invitrogen公司）；引物（购于上海生物工程公司），IGF1多克隆兔抗（购于美国Abcam公司）；山羊抗兔β-actin单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、双萤光素酶报告基因检测试剂盒（购自南京碧云天公司）；PVDF膜（购自美国Bio-Rad公司）；ECL化学发光试剂盒（购自美国PS公司)；核质分离试剂盒（购于美国Ambion公司）；miR-379 mimics、miR-379 mimics control、miR-379 inhibitor和miR-379 inhibitor control（购自广州锐博公司）；CCK-8试剂（购自日本同仁化学研究所）；ModulusTM单管型多功能检测仪（购自美国Promega公司）；IGF1 ELISA检测试剂盒（购于美国Life公司）。

1.2. 方法

1.2.1. 细胞培养

NCI-H1299和NCI-H2170细胞系的培养液成份为10%胎牛血清和RPMI-1640培养基，培养液含青霉素/链霉素100 U/mL。细胞培养于37 ℃、含5%CO2培养箱中，0.25%的胰酶常规消化，选择生长较好的对数期进行实验。

1.2.2. 质粒构建及细胞转染

环状RNA过表达载体pLCDH-circRNA购广州自吉赛生物公司，序列circHIPK3（hsa_circ_0000284）来自数据库cirBase。用Fast pfu扩增circHIPK3序列，克隆构建过表达质粒pLCDH-circHIPK3。circHIPK3序列片段插入荧光素酶报告基因下游，构建包含circHIPK3的报告基因质粒pGL3-circHIPK3。采用点突变试剂盒突变circHIPK3与miR-379结合位点。pLCDH-circHIPK3慢病毒转染法感染细胞，48 h后以1 μg/mL浓度的嘌呤霉素筛选细胞株，鉴定稳转细胞系。实验组均设3个复孔。干扰siRNA购自锐博生物公司。除过表达外，其余质粒和siRNA通过脂质体法转入NCI-H1299或NCI-H2170细胞中，通过GFP荧光检测转染效率，所有质粒都通过测序鉴定。

1.2.3. 核质分离实验及RNase R消化线性RNA实验

将NCI-H1299和NCI-H2170细胞分别以2×105个/孔铺入6孔板各3个孔，当细胞处于80%融合度时用0.25%的胰酶消化细胞，2, 000 g离心2 min，根据核质分离试剂盒步骤，分别回收胞质和胞核RNA，nano 2000测定含量，储存待用。将RNA分为RNase消化组和非消化组两组，准备10×Reaction Buffer配制10 μL总反应体系，用于消化线性RNA，每1 μg RNA用1 U（1个单位）的RNase消化，37 ℃ 10 min。随后用苯酚/氯仿、乙醇沉淀法提取消化产物，逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR法检测circHIPK3在核质中的表达，实验共重复三次。

1.2.4. 实时荧光定量PCR检测RNA表达水平

抽提样品RNA，经浓度和纯度测定后，逆转录合成cDNA样品，以β-actin为内参。将SYBR Green预混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反应溶液，置于Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：95 ℃ 2 min预变性，然后按95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环，最后72 ℃ 7 min延伸。结果通过2-△△CT法分析基因相对表达量。PCR引物序列见表 1。

1.

PCR引物序列

The PCR primers sequence

Item Sequence
circHIPK3-F cggaattcTGAAATATGCTATCTTACagGTATGGCCTCACAAGTCTTG
circHIPK3-R cgggatccTCAAGAAAAAATATATTCacCTGTAGTACCGAGATTGTAG
circHIPK3 point mutation primer F GTCTTGGTGATGCCACCATATGTTTATCAAACTCAGTCAAG
circHIPK3 point mutation primer R ATATGGTGGCATCACCAAGACTTGTGAGGCCATAC
si-circHIP3-1 ACUACAGGUAUGGCCUCACAA
si-circHIP3-2 CUACAGGUAUGGCCUCACA
si-circHIP3-3 UACAGGUAUGGCCUCACAAGU
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1.2.5. CCK-8检测细胞增殖实验

NCI-H1299和NCI-H2170细胞增殖检测实验主要通过CCK-8试剂盒完成。实验分为对照组和处理（过表达和敲低）组，采用96孔板中，每个孔铺大约1×103个细胞，培养5 d。加入CCK-8后，37 ℃孵育2 h，检测OD450的值。

1.2.6. 平板克隆形成实验

实验分为对照组和NCI-H2170 circHIPK3沉默组，对照组和NCI-H1299 circHIPK3过表达组，每组按每孔接种约5×102个细胞于6孔板中，37 ℃培养两周后，用结晶紫染色计数，每个实验重复3个孔。

1.2.7. 双荧光素报告基因实验

实验分为6组：pGL-3空质粒组、pGL-3-circHIPK3组、circHIPK3突变组、circHIPK3 siRNA组、miR-379 inhibitor组及miR-379 inhibitor control组。每组中都转染海肾萤光素酶内参质粒和miR-379 mimics。转染24 h后吸尽细胞培养液，根据试剂盒要求加入适量裂解液充分裂解细胞。10, 000 g离心5 min后，取裂解液上清100 μL用于测定。以海肾萤光素酶为内参，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品目的报告基因的激活程度。

1.2.8. Western blot检测蛋白表达水平

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的蛋白上样缓冲液，100 ℃沸水浴加热3 min-5 min，以充分变性蛋白。经过跑胶、转膜、封闭、一抗、二抗及显影液孵育后，于Bio-Rad公司化学发光成像仪显影成像。

1.2.9. IGF1 ELISA检测

将NCI-H1299细胞分为转染miR-379 mimics control和过表达miR-379 mimics、miR-379 inhibitor control及miR-379 inhibitor两组，以1 mL培养基重悬2×105个细胞为一孔，加入24孔板，每组做3个复孔。细胞培养72 h后，采用无菌管收集上清于3, 000 g离心20 min。根据试剂盒说明，用纯化的IGF1抗体4 ℃包被96孔酶标板，并放置过夜。第2天封闭过后，往包被单抗的微孔中依次加入100 μL不同倍比稀释度的细胞上清，并加入用细胞培养基梯度稀释的对照样品，37 ℃孵育2 h。PBST洗涤5次，加入100 μL稀释后的HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST再次洗涤，显色剂显色20 min后终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人IGF1浓度，结果以差异倍数显示。

1.3. 统计学方法

数据通过Graphad Prism软件作图和统计，以均数±标准差（Mean±SD）表示。实验均采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 鉴定circHIPK3在NSCLC细胞系中的表达

首先分别以细胞NCI-H1299的基因组DNA（gDNA）和cDNA作为模板，通过PCR技术扩增circHIPK3包含成环位点（back spliced junction）的片段，结果表明模板为cDNA组的PCR产物出现约100 bp的目的条带，并且基因组DNA不能非特性扩增circHIPK3（图 1A）。Sanger测序结果验证了成环位点序列（图 1B）。利用RNase R消化细胞NCI-H1299的RNA，qRT-PCR结果显示RNase R处理前后，circHIPK3表达水平无明显变化，但是线性mHIPK3表达水平却显著降低（图 1C，P＜0.01）。进一步通过细胞核质分离实验证明circHIPK3主要存在于NCI-H1299和NCI-H2170的细胞质（图 1D）。

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CircHIPK3在NSCLC细胞系中的鉴定。A：分别以基因组DNA和cDNA为模板，PCR扩增circHIPK3成环位点附近100 bp序列，白色矩形框表示目的条带区域；B：circHIPK3成环示意图及测序结果，红色箭头表示divergent primers，竖短黑线示意成环位点；C：RNase R消化后的mHIPK3和circHIPK3的丰度检测；D：circHIPK3在细胞核中与细胞质中的含量比较。**：与对照组相比，P＜0.01。

Identification of circHIPK3 in NSCLC cell lines. A: CircHIPK3 sequence about 100 bp around back splied junction was analyzed by PCR, and the white rectangle indicated DNA bands; B: Schematic diagram of circular point. Red arrows represented divergent primers, and vertical short black line indicated circular point; C: The levels of circHIPK3 and mHIPK3 were analyzed after RNase R digestion; D: Expression of circHIPK3 in both nuclear and cytoplasmic fractions were measured by qRT-PCR. **: compared with the control, P < 0.01.

2.2. 过量表达circHIPK3促进NCI-H1299细胞的增殖

我们首先在NSCLC细胞系H1299、H827、H1975、H2170、H520、H1650中均检测到circHIPK3的表达，发现NCI-H2170表达量最高，NCI-H1299表达量最低（图 2A）。在NCI-H1299细胞系中稳定转染circHIPK3，circHIPK3表达水平显著上调，mHIPK3无明显变化（图 2B-图 2C）。CCK-8实验结果显示实验组circHIPK3稳定表达株的OD450明显高于对照组（图 2D，P＜0.01），且其在平板克隆形成实验中的克隆数目多于对照组（图 2E-图 2F，P＜0.01）。

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过量表达circHIPK3促进NCI-H1299细胞增殖。A：circHIPK3在6株NSCLC细胞系中的表达量；B：稳定转染对照空质粒pLDCH和circHIPK后，NCI-H1299细胞表达载体携带的绿色荧光蛋白标记；C：过表达circHIPK后，细胞中circHIPK3及mHIPK3表达水平检测；D：CCK-8试验检测细胞增殖；E：平板克隆形成实验检测细胞增殖；F：克隆形成数目统计；**：与对照组相比，P＜0.01。

Overexpression of circHIPK3 promoted NCI-H1299 cells proliferation. A: The expression level of circHIPK3 in 6 kinds of NSCLC cell lines; B: The green fluorescent protein (GFP) indicated the successful and stable establishment of pLDCH/p-circHIPK3 NCI-H1299 cell line; C: Detection of circHIPK3 and mHIPK3 expression levels in NCI-H1299; D: The cell growth rate was measured by CCK-8 assay; E: Cell proliferation was assessed by colony formation assay; F: Statistics analysis of colony formation assay; **: compared with the control, P < 0.01.

2.3. 沉默circHIPK3抑制NCI-H2170细胞系的增殖

我们订购了三条siRNA干扰circHIPK3的表达，其中si-circHIPK3-2有明显的干扰抑制效果（图 3A）。干扰circHIPK3实验组的OD450显著低于对照组（图 3B，P＜0.01）。克隆形成数目也明显低于对照组（图 3C-图 3D，P＜0.01）。

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沉默circHIPK3抑制NCI-H2170细胞系的增殖。A：cirHIPK3 siRNA敲降效果检测；B：CCK-8实验检测circHIPK3沉默后对细胞增殖的影响；C：平板克隆形成实验检测circHIPK3沉默后对细胞增殖的影响；D：克隆形成数目统计；**：与对照组相比，P＜0.01。

Silencing circHIPK3 inhibited NCI-H2170 cell proliferation. A: The knock-down efficiency of cirHIPK3 siRNAs; B: Cell proliferation was evaluated by CCK-8 assay; C: Cell proliferation was detected by colony formation assay; D: Statistics of colony formation assay; **:compared with the control, P < 0.01.

2.4. circHIPK3作为“海绵体”吸附miR-379

我们将circHIPK3的序列插入荧光素酶报告基因载体pGL3 promoter-luc单位的下游，与miR-379 mimics及内参质粒共转入293T和NCI-H1299细胞中后，相对于载体对照组（EV），实验组circHIPK3的荧光强度显著降低。突变circHIPK3与miR-379的结合位点，将突变质粒Luc-circHIPK3 mutant（mut-circ）与miR-379 mimics共转入293T和NCI-H1299中，荧光信号没有发生明显改变。此外，将si-circHIPK3（si-circ）、miR-inhibitor（miR-in）、Inhibitor control（IC）与miR-379 mimics共转入293T和NCI-H1299中，荧光强度也没有显著降低（图 4A-图 4B）。以上数据表明circHIPK3可以与miR-379结合，作为“海绵体”吸附miR-379。此外，我们同样验证了miR-379与IGF1 3’UTR的结合，双荧光素酶报告基因结果显示，miR-379可以与IGF1 3’UTR直接结合（图 4C-图 4D）。

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CircHIPK3作为“海绵体”吸附miR-379。A：荧光素酶报告基因实验检测miR-379分别和载体对照组EV、circHIPK3过表达组（circ）、circHIPK3敲低组（si-circ）、突变质粒Luc-circHIPK3组（mut-circ）、miR-inhibitor组（miR-in）及Inhibitor control组（IC）共转入293T细胞中的荧光素酶的相对荧光强度；B：荧光素酶报告基因实验检测miR-379分别和EV、circ、si-circ、mut-circ、miR-in及IC共转入NCI-H1299细胞中的荧光素酶的相对荧光强度；C：转入miR-379 mimics和IGF1 3’UTR后，293T细胞中荧光素酶的相对荧光强度检测；D：转入miR-379 mimics和IGF1 3’UTR后，NCI-H1299细胞中的荧光素酶相对荧光强度。*：与对照组相比，P＜0.05。**：与对照组相比，P＜0.01。

CircHIPK3 could sequester miR-379. A: Luciferase relative activity of miR-379 in EV, circ, si-circ, mut-circ, miR-in and IC treated 293T cells; B: Luciferase relative activity of miR-379 in EV, circ, si-circ, mut-circ, miR-in and IC treated NCI-H1299 cells; C: Luciferase relative activity of miR-379 with IGF1 3'UTR in 293T cells; D: Luciferase relative activity of miR-379 with IGF1 3'UTR in NCI-H1299 cells. *: compared with the control, P < 0.05. **: compared with the control, P < 0.01.

2.5. circHIPK3通过circHIPK3/miR-379促进细胞增殖

在NCI-H1299中转入miR-379 mimics后，IGF1表达水平降低，转入miR-379 inhibitor发现IGF1表达水平上调（图 5A-图 5B，图 5E，P＜0.05）。在NCI-H2170中干扰抑制circHIPK3，发现IGF1表达量明显下调（图 5C，图 5E，P＜0.05）。在过表达circHIPK3的NCI-H1299的细胞系中转入miR-379 mimics后，能部分下调IGF1的表达水平，同时能部分回复对细胞增殖的影响（图 5D，图 5F，P＜0.05）。因此，在NCI-H1299和NCI-H2170中，circHIPK3通过miR-379调控IGF1表达促进细胞增殖。

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CircHIPK3通过circHIPK3/ miR-379通路促进细胞增殖。A：转入miR-379 mimics后，Western blot检测NCI-H1299细胞内IGF1的表达水平；B：转入miR-379 inhibitor后，Western blot检测NCI-H1299细胞内IGF1的表达水平；C：敲低circHIPK3后，Western blot检测NCI-H2170细胞内IGF1的表达水平；D：分别转染：对照pLCDH、p-circHIPK3、p-circHIPK3+miR-379 mimics共同处理组质粒后，Western blot检测NCI-H1299细胞内IGF1的表达水平；E：细胞培养72 h后，ELISA法检测细胞上清IGF1的量；F：CCK-8实验检测空载质粒pLCDH、p-circHIPK3、p-circHIPK3+miR-379 mimics共同处理组三个组别对细胞增殖的影响。*：与对照组相比，P＜0.05。

CircHIPK3 promoted NSCLC cell proliferation through circHIPK3/miR-379 pathway. A: The effects of miR-379 mimics on the expression levels of IGF1 in NCI-H1299; B: The effects of miR-379 inhibitor on the expression levels of IGF1 in NCI-H1299; C: The effects of si-circHIPK3 on the expression levels of IGF1 in NCI-H2170; D: The effects of the pLCDH, p-circHIPK3, the group of circHIPK3 combined with miR-379 mimics on the expression levels of IGF1 in H1299; E: Detection of the expression levels of IGF1 by ELISA after culturing for 72 h; F: The cell growth effects of circHIPK3 and the group of circHIPK3 combined with miR-379 mimics on NCI-H1299. *: compared with the control, P < 0.05.

3. 讨论

越来越多的研究显示环状RNA在疾病的发生与发展中起着重要的作用。但是，目前只有CDR1as和circFOXO3研究的较为透彻。circHIPK3是另一个崭露头角的环状RNA，受到人们越来越多的重视。在正常细胞内，其表达丰度与其线性RNA相当，甚至更高。在肿瘤研究中发现，circHIPK3可以促进肝癌的增殖[16]。在本文中，我们主要报道了针对circHIPK3在NCI-H1299和NCI-H2170中的功能与初步的机制研究结果。过量表达的circHIPK3同样可以促进NSCLC细胞的增殖，此外，我们的研究更进一步发现，在NSCLC细胞系中，circHIPK3的促进增殖能力可以通过circHIPK3/miR-379发挥，目前研究发现circHIPK3可以与多种miRNA结合，起到miRNA“海绵体”的作用。在肝癌中，circHIPK3可以吸附miR-124，从而调节miR-124的靶基因IL6R和DLX2，促进细胞增殖[16]。但是在NSCLC中，circHIPK3同样可以通过吸附miR-379。文献[18]报道发现，miRNA-379能够抑制IGF1的表达水平，我们猜测在NSCLC细胞系circHIPK3可能通过吸附miRNA-379促进IGF1的表达，从而影响细胞增殖。Western blot和ELISA证实，过量表达miRNA-379，IGF1的蛋白水平下调。干扰抑制miRNA-379可以上调IGF1的蛋白表达水平。过量表达circHIPK3可以促进IGF1的表达，但是干扰抑制circHIPK3却可以抑制IGF1的蛋白水平。双荧光光素酶报告基因实验表明，miR-379分别可以和circHIPK3及IGF1 mRNA直接结合。在稳转circHIPK3的NCI-H1299细胞系转入miR-379可以挽救circHIPK3过量表达的表型。至此，我们提出circHIPK3在NSCLC细胞系H1299和H2170中促进增殖的机制是通过circHIPK3/miRNA-379实现的。

在细胞系中，我们发现circHIPK3在NCI-H2170高表达，在NCI-H1299低表达。所以，我们选择在NCI-H1299中稳定过表达circHIPK3，在NCI-H2170中干扰抑制circHIPK3。值得注意的是，环状RNA过表达的关键步骤在于成环，我们选用商业化的质粒去过表达circHIPK3，利用Real-time PCR的方法检验circHIPK3的表达量，希望能确定过表达的真实性。因为目前相关体外成环技术并不成熟，成环过程中会形成小部分错误成环的RNA，虽然本研究并没有检验错误成环的影响，但是通过干扰circHIPK3发现细胞的表型与过表达相反，证实细胞增殖的变化确实由circHIPK3的表达量变化引起。为了进一步研究circHIPK3调控NSCLC增殖的分子机制，本研究利用双荧光酶活性实验证明了circHIPK3和miR-379是直接结合，通过文献报道发现，miR-379可以直接结合靶基因IGF1的mRNA，抑制IGF1表达水平，从而抑制细胞增殖[18]。我们过表达miR-379后，IGF1的表达水平明显下调，说明miR-379在NSCLC细胞中同样可以结合IGF1的mRNA，抑制IGF1表达水平。过表达circHIPK3发现IGF1表达量上调，反之亦然，这就更加确定circHIPK3是可以调控IGF1的上游RNA。虽然文献报道，IGF1是一种重要的细胞生长和分化的调控因子，但是关于IGF1与细胞增殖的关系，本文主要参考相关文献报道，实验上并未做深入探讨，这也是本文的不足之处[19-21]。此外，本研究并未进一步证实circHIPK3的调控关系是否能在更多种的细胞系中重复，这一点也是今后研究的重要内容。

综上所述，本研究表明circHIPK3能够促进NSCLC细胞的增殖，circHIPK3通过miR-379调控IGF1表达是促进NSCLC细胞的增殖的机制。在后续的研究中，我们将更加深入地探讨机制，为NSCLC的治疗提供新的思路。

Funding Statement

本研究受国家自然科学基金项目（No.30670917）资助

This study was supported by the grant from the Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine (to Xuejun ZHU)(No.30670917)

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Articles from Chinese Journal of Lung Cancer are provided here courtesy of Editorial office of Chinese Journal of Lung Cancer

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