PARP抑制剂对Lewis肺癌细胞及移植瘤放疗增敏作用及其机制

Abstract

背景与目的

受电离辐射的肿瘤细胞DNA损伤主要为单链断裂(single strand break, SSB)与双链断裂(double strand break, DSB)，其中SSBs发生的频率数十倍于DSBs，而SSBs多能通过聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly(ADP-Ribose) polymerase, PARP]等因子进行修复。相关新药Olaparib(PARP1/PARP2/PARP3抑制剂)靶向作用于细胞SSBs损伤修复，其联合化疗的临床研究取得令人鼓舞结果。本实验旨在研究Olaparib对Lewis肺癌细胞及移植瘤放疗增敏作用，初步探讨其可能机制。

方法

采用MTT法检测Olaparib对Lewis细胞10%抑制浓度(10% inhibitory concentration, IC₁₀)值，克隆形成实验验证Olaparib联合放疗的体外增敏作用；成瘤小鼠分为空白对照、Olaparib、放疗(radiotherapy, RT, 2 Gy×5 d)、Olaparib+RT组，动态测量各组移植瘤体积变化；流式细胞术比较各组细胞体外凋亡率，TUNEL法比较移植瘤细胞凋亡；Western blot检测各组DNA损伤相关蛋白γH2AX，凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表达。

结果

Olaparib对Lewis细胞IC₁₀值为4.4 μmol/L，克隆形成实验测得Olaparib放疗增敏比为1.211；移植瘤初体积(处理前)增长4倍所需天数，Olaparib+RT组显著高于单纯RT组(P < 0.001)；流式及TUNEL法检测Lewis细胞体内外凋亡率均Olaparib+RT组高于RT组(P < 0.05)；Olaparib+RT组细胞及移植瘤中γH2AX、Bax、Caspase-3显著高于RT组，Bcl-2显著低于RT组(均P < 0.05)。

结论

Olaparib对Lewis肺癌细胞及移植瘤起到显著放疗增敏作用，其机制可能与增加受照肿瘤细胞DNA双链断裂形成，上调Bax/Bcl-2促凋亡体系蛋白有关。

电离辐射所致的肿瘤细胞DNA损伤主要为链断裂：单链断裂(single strand breaks, SSBs)与双链断裂(double strand breaks, DSBs)；其中SSBs发生的频率是DSBs的10倍-20倍^[1]。在通常情况下，电离单击所致的SSBs多能通过细胞内聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADPrbose)polymerase, PARP]、DNA连接酶以及其他损伤修复相关因子的参与进行较完整的修复^[2]，而DSBs的修复则要困难很多，需通过激活同源重组(homologous recombination, HR)或非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)途径完成^{[1, 3]}。DSBs成为电离辐射在细胞染色体上最致命的损伤，DNA损伤修复与否则是影响受照细胞存活的关键因素^{[1, 4]}。基于PARP在细胞SSBs修复中的关键性作用，靶向抑制其修复的新思路成为近年来研究的热点之一，相关新药Olaparib(PARP1/PARP2/PARP3抑制剂，奥拉帕尼)于2014年12月美国FDA批准上市。临床研究^[5-7]结果表明，Olaparib联合紫杉醇、吉西他滨、铂类等化疗药物治疗可使得患者获益。目前，PARP抑制剂在联合放疗方面研究较少，已有的相关研究报告^{[8, 9]}显示，其在体外联合照射细胞可提高放疗生物效应。本实验在Lewis肺癌细胞及小鼠移植瘤模型上研究PARP抑制剂联合放疗时生物效应的变化，并探索其可能的机制。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 细胞株与实验小鼠

Lewis肺癌细胞株为本实验室保存。C57/BL小鼠：雌性，6周-8周龄，重15 g-20 g，饲养于无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级环境，购于北京华阜康生物科技公司，实验动物许可证编号：SCXK(京)2014-0004。实验获本院动物保护和应用委员会批准，动物实验人员资格证书编号：CQLA-2013-0734。

1.1.2. 主要试剂

MTT试剂盒购于北京康为世纪生物科技公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于Biosciences公司，Olaparib-AZD2281购于Selleck Chemicals公司，BCA蛋白浓度测定、Beyo ECL Plus发光试剂购于上海碧云天生物技术公司，A nt i-Phospho -Hi stone H2AX(Ser139)购于Upstate公司，Bax、caspase-3、Bcl-2兔抗鼠单克隆抗体购于Abcam公司，TUNEL试剂盒购自美国罗氏公司。

1.2. 细胞培养及移植瘤小鼠建模

Lewis肺癌细胞培养于DMEM/HIGHGLUCOSE培养基中(10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素-链霉素)，于37 ℃、5%CO₂、90%湿度孵箱中培养，细胞贴壁。取对数期生长细胞，消化计数，约1.5×10⁶个细胞/只接种于小鼠右侧肋部。

1.3. MTT检测Olaparib IC₁₀浓度

Lewis细胞以8.0×10³个/孔接种于96孔板，细胞贴壁，各孔加入Olaparib[浓度梯度(μmol/L)：0、3.125、6.25、12.5、25、50]，各浓度3个复孔。培养48 h后各孔中加入20 µL MT，避光4 h弃上清，加入150 µL二甲基亚砜，避光振荡5 min。酶标仪测各孔吸光度(density, D)值(570 nm波长处)。存活率=(实验组各孔D值/空白组D值) ×100%，通过BLISS法计算10%抑制浓度(10% inhibitory concentration, IC₁₀)与50%抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC₅₀)值。IC₁₀作为后续Olaparib体外用药浓度。

1.4. 克隆形成实验比较

实验分为放疗(radiotherapy, RT)组与Olaparib+RT组，两组照射均含0 Gy、0.5 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy剂量点。均使用Synergy直线加速器6 MV X射线(剂量率：1 Gy/min)等中心照射，射野10 cm×15 cm，源皮距=100 cm，瓶面放一1.5 cm厚等效有机玻璃。取对数期细胞，根据不同照射剂量点以100个-10, 000个细胞/孔(表 1)接种于6孔板，待细胞贴壁后，用药组照射前2 h加入Olaparib后行相应剂量点照射。受照细胞培养10 d后，经固定、染色、晾干处理，采用光镜计数各剂量点集落数目(≥50个细胞为一集落)。接种效率=0 Gy点平均集落数/100，存活分数(survival fraction, SF) =该剂量点平均集落数/(该点接种细胞数×接种效率)，根据经典单击多靶模型SF=1-[1-exp(-D/D₀)]^N拟合曲线，得到平均致死剂量D₀值，放疗增敏比(sensitivity enhancement ratio, SER) =D₀(RT组)/D₀(Olaparib+RT组)。

1.

各剂量点细胞存活分数

Cell survival fraction at each dose point

Dose (Gy)	Numbers (cells)	Average number of colony			SF
		RT	Olaparib		RT	Olaparib+RT
SF=Average number of colony/(number of cells inoculated×efficiency of inoculation). SF: survival fraction.
0	100	74.333	67.666		1.000	1.000
0.5	120	72.333	64.000		0.810	0.788
1	200	73.000	58.333		0.491	0.431
2	600	69.666	49.666		0.156	0.122
4	2, 000	125.000	35.666		0.084	0.026
6	10, 000	66.333	21.000		0.008	0.003

1.5. 流式细胞术检测体外细胞凋亡

实验分为空白对照、Olaparib、RT(2 Gy)、Olaparib+RT(2 Gy)组，细胞以3.5×10⁵个/孔密度接种于6孔板上培养24 h(用药组照射前2 h加入Olaparib)，接受2 Gy照射。培养24 h，消化、洗涤、离心收集细胞，加入200 µL缓冲液重悬，再加入5 µL Annexin V/FITC和10 µL碘化丙啶，避光孵育15 min后加入300 µL缓冲液待用。使用流式细胞仪分类计数。右上象限及右下象限分别代表晚期与早期凋亡细胞。

1.6. 小鼠移植瘤外照射

小鼠移植瘤体积平均长至250 mm³后，随机分为4组(n=5)：空白对照、Olaparib、RT(2 Gy×5 d)、Olaparib+RT组，0.9%Nacl或Olaparib (用法用量依据预实验结果及已有研究资料^[10]：50 mg/kg/d，灌胃，照射前30 min-60 min给药)。空白对照(0.9%Nacl, d1-d5)、Olaparib组(Olaparib, d1-d5)、RT组(移植瘤照射，2 Gy/d，d1-d5)、Olaparib+RT组(Olaparib，d1-d5；移植瘤照射，2 Gy/d，d1-d5)。每隔2天游标卡尺外部测量移植瘤最大径A及最小径B，瘤块体积V=π/6×[(A+B)/2]³，绘制肿瘤生长曲线，移植瘤长至4倍初体积(1, 000 mm³)后处死小鼠。比较各组小鼠移植瘤长至4倍初体积(1, 000 mm³)时所需天数。

1.7. Western blot检测γH2AX、Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达

收集目的细胞(2 Gy剂量点，受照后2 h)、瘤块组织(小鼠放疗结束后，即d6)，RIPA裂解液裂解细胞(组织)，调整样品蛋白浓度。8%SDS-PAGE分离样品蛋白60 µg，250 mA恒流电转膜至硝酸纤维滤膜，封闭2 h，置于一抗封闭液中，4 ℃孵育过夜。将膜置于含辣根过氧化物酶偶联的IgG二抗中，孵育2 h后采用ECL Plus发光试剂显色。以GAPDH为内参，采用Image Lab软件分析条带灰度值，以目的蛋白/GAPDH比值半定量反应蛋白相对表达水平。

1.8. TUNEL法检测瘤块细胞凋亡

采用凋亡细胞的原位末端转移酶标记法(TUNEL法)，TdT酶液和荧光标记液按1:9比例混合，配成TUNEL反应液(整个操作步骤按说明书进行)。正常细胞核染为蓝色，凋亡细胞核染为棕黄色，在×400高倍视野(high power, HP)光学显微镜下随机选取5个癌区，计数凋亡细胞数(个/HP)。

1.9. 统计学方法

使用IBM SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据以Mean±SD表示，两组数据间比较使用t检验，两组以上数据比较使用单因素方差分析(ANOVA)。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. Olaparib对Lewis细胞增殖抑制作用

MTT检测结果示，Lewis细胞在浓度梯度(μmol/L)为：0、3.125、6.25、12.5、25、50的Olaparib作用下存活百分比依次为：100%、97.33%、84.36%、59.67%、39.16%、24.56%，计算得出IC₁₀与IC₅₀值分别为：4.4 μmol/L、19.6 μmol/L。可见随Olaparib浓度增高，细胞存活率降低，即Olaparib体外对Lewis细胞存在剂量毒性，故选择低毒剂量IC₁₀值作为Olaparib体外用药浓度。

2.2. 细胞克隆形成情况

克隆形成实验得出，RT组与Olaparib+RT组细胞在0 Gy、0.5 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy各剂量点存活分数(表 1)。多靶单击模型SF=1-[1-exp(-D/D₀)]^N拟合曲线(图 1)得出放射生物学指标D₀值(Gy)在RT组与Olaparib+RT组中分别为：0.797、0.658。Olaparib联合放疗SER为1.211(0.797/0.658)。

1.

多靶单击模型拟合细胞存活曲线

Cell survival curves plotted by the "single-hit multi-target model". RT: Radiotherapy.

2.3. 不同处理组细胞体外凋亡差异

细胞接受2 Gy照射后24 h，行流式细胞术检测细胞凋亡率(图 2)。Olaparib+RT组、Olaparib组、RT组、空白组中Lewis细胞凋亡率依次为：(24.77±2.0) %、(3.89±1.1) %、(16.22±2.4) %、(0.53±0.1) %。可见Olaparib+RT组细胞凋亡率显著高于其余三组(均P < 0.05)。

2.

Lewis细胞体外凋亡率差异。流式细胞术检测各组细胞凋亡率，可见Olaparib+RT组细胞体外凋亡率显著高于其余三组（均P < 0.05）。

Differential cell apoptotic rate in vitro. Cell apoptotic rate was measured by flow cytometry analysis. The apoptotic cells in Olaparib+RT group were significantly higher than the other three groups in vitro (all P < 0.05).

2.4. 不同处理组移植瘤细胞体内凋亡差异

光镜下(× 400) Olaparib+RT组、Olaparib组、RT组、空白组移植瘤组织中TUNEL染色阳性(凋亡)细胞的细胞核呈棕黄色(图 3)，其平均凋亡细胞数(个/HP)依次为：(12.4±1.1)、(4.4±1.1)、(8.0±1.2)、(2.2±0.8)。统计得出，Olaparib+RT组细胞凋亡率显著高于其余三组(均P < 0.05)。

3.

Lewis细胞体内凋亡率差异。TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况（×400）。Olaparib+RT组细胞体内凋亡率显著高于其余三组（均P < 0.05）。

Differential cell apoptotic rate in vivo. Cell apoptotic rate in xenograft tissues was observed by TUNEL stain (×400). The apoptotic cells in Olaparib+RT group were significantly higher than the other three groups in vivo (all P < 0.05).

2.5. DNA损伤及凋亡相关蛋白表达差异

Lewis细胞在接受2 Gy照射后2 h与移植瘤照射(2 Gy×5 d)后1天，Western blot检测各处理组γH2AX(DNA双链断裂相关蛋白)，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，抗凋亡蛋白Bcl-2表达。结果显示，Olaparib+RT组与RT组相比，γH2AX、Bax、Caspase-3蛋白在体外实验中分别上调60.5%、40.0%、42.0%，在移植瘤中分别上调71.4%、37.7%、31.3%；Bcl-2体外实验中下调45.2%，移植瘤中下调61.0%(图 4)。

4.

Lewis细胞体内外DNA损伤及凋亡相关蛋白表达。A：Lewis细胞体外照射（2 Gy）后；B：Lewis移植瘤照射结束（2 Gy×5 d）后，Western blot检测γH2AX、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达。^*P < 0.05，^**P < 0.01相较于RT组。

DNA damage and apoptosis related protein expression of Lewis cells in vitro and in vivo. The ralative protein levels of γH2AX, Bax/Bcl-2, Caspase-3 were measured by Western blot. A: After Lewis cells were irradiated in vitro (2 Gy); B: After Lewis xenografts were irradiated (2 Gy×5 d). ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs RT group.

2.6. 移植瘤生长曲线比较

各处理组小鼠用药及放疗过程中精神饮食状态正常，无明显全身性不良反应，各组移植瘤体积平缓长至250 mm³左右，开始相关实验。各组移植瘤增长过程中均有出现1个-2个移植瘤中央部破溃。10 Gy剂量照射结束后同时剥取未破溃瘤块行前述组织相关指标检测(图 5A)。在Olaparib+RT组、Olaparib组、RT组、空白组中移植瘤增长至4倍初体积(1, 000 mm³)所需时间(d)依次为：(29.6±3.8)、(11.6±2.6)、(21.2±2.3)、(10.8±1.1)(图 5B)。可见，Olaparib+RT组移植瘤长至4倍初体积所需天数显著高于其余三组(均P < 0.05)。

5.

荷瘤小鼠与移植瘤生长延缓曲线。A1：Lewis移植瘤照射（2 Gy×5 d）后剥取瘤块用于相关指标检测；A2：荷瘤小鼠（未破溃）；A3：荷瘤小鼠（瘤块中心破溃）；B：移植瘤增长至4倍初体积（1, 000 mm³）生长延缓曲线。

Tumor-bearing mice and Lewis xenografts growth delay curves. A1: Xenografts were isolated for detecting at the next day after irradiated (2 Gy×5 d); A2: Tumor-bearing mice without xenograft rupture; A3: Tumor-bearing mice with xenograft rupture; B: Delay curves of Lewis xenografts increasing to quadruple size from the start.

3. 讨论

根据经典的"单击多靶"模型，电离辐射可致肿瘤细胞内产生大量的SSBs，同样的，作用于DNA化学结构的细胞毒类药物也可使肿瘤细胞产生较多SSBs。多数的SSBs能通过PARP等相关因子修复，当PARP活性被靶向抑制后，大量外源性的SSBs存在于细胞内，当进入下一个复制叉后，SSBs可转变为DSBs^[11]。修复DSB，必须通过激活HR或NHEJ信号通路来完成，若该通路中的关键分子(如BRCA1/2、ATM等)发生功能突变，即可对细胞产生所谓的"合成致死"效应，这就是Olaparib及其他PARP抑制剂在临床研究中单药或联合化疗治疗伴有BRCA1/2突变的恶性肿瘤的基础。

凋亡是肿瘤细胞受电离辐射后产生的主要生物效应之一，在线粒体介导的凋亡途径中，细胞在生存信号缺失、DNA严重受损(如DSB)、生长因子缺乏等情况下，可通过Bcl家族的促凋亡成员(如Bax等)与抗凋亡成员(如Bcl-2等)调控线粒体膜通透性，释放凋亡活性物质进入细胞质，引起Caspase级联反应，诱导细胞凋亡^[12]。与正常组织细胞相比，DNA损伤修复通路在肿瘤细胞中过度激活，并且在机体接受放化疗时，对其有着负性调控作用^[13]。本实验旨在研究Olaparib联合放疗时，是否可通过增加Lewis细胞DNA损伤及凋亡而起到放疗增敏作用。

本实验首先在体外细胞水平研究Olaparib联合放疗时的增敏效应。运用MTT技术检测Olaparib对Lewis细胞的增殖抑制作用，可见随药物浓度增加，抑制率上升，即Olaparib单药对Lewis细胞存在细胞毒作用，故选择低毒剂量IC₁₀值作为体外联合放疗时的药物浓度。通过放射生物学研究常用的克隆形成实验，比较了单纯放疗与Olaparib联合放疗在Lewis细胞层面的生物效应差异，得出Olaparib联合放疗组D₀值较RT组增加了21.1%，SER为1.211，证实了Olaparib体外的放疗增敏效应。为进一步探究其可能机制，检测不同处理组与受照细胞DSBs相关的敏感指标，即与DSBs量存在对应关系的磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)，其被认为是检测DNA双链断裂的"金标准"。通过蛋白印迹相对定量得出，γH2AX在空白及单药Olaparib组中未表达，而在RT与Olaparib+RT组中高表达，且联合组γH2AX表达量较RT组增加约60%。可见，体外Lewis细胞在低剂量Olaparib联合放疗时即可显著增加DSBs形成。

实验进一步通过流式细胞术检测不同处理组细胞的凋亡率得出，Olaparib联合放疗组较单放疗组细胞凋亡率显著提高。研究^[14-16]表明，Bax与Bcl-2蛋白可形成异源二聚体抑制凋亡，Bax间可形成同源二聚体促进凋亡，即在Bax/Bcl-2途径中Bax促进凋亡而Bcl-2抑制凋亡，并进一步通过细胞色素C及Caspase-9等因子激活下游Caspase-3蛋白，最终诱导细胞凋亡。本研究对这些凋亡相关蛋白检测发现，Lewis细胞在接受2 Gy照射后，Olaparib联合放疗组促凋亡蛋白Bax及Caspase-3较单纯放疗显著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2显著下降。Wesierska等^[17]研究PARP-1抑制剂AZD2261发现，其可显著抑制乳腺癌MCF-7与Skbr-3细胞克隆形成，并通过Caspase-3蛋白的激活诱导细胞凋亡。在本实验中，Olaparib单药组对Lewis细胞凋亡影响较小(约3.89%)，考虑与用药浓度较低相关(IC₁₀值浓度)。Tuli等^[18]研究PARP1/2抑制剂ABT-888联合放疗胰腺癌MiaPaCa-2细胞时发现，ABT-888单药(10 μmol/L)时对MiaPaCa-2细胞凋亡相关蛋白Caspase表达影响小，而当联合放疗时可显著提高促凋亡蛋白表达。这与本研究结果相一致。

在Lewis细胞移植瘤模型实验中，Olaparib单药给予5 d较空白对照组并未引起明显的肿瘤生长延缓，而当联合放疗(2 Gy×5 d)后，观察到移植瘤显著的生长延缓效应，与单纯放疗组相比，其增长至4倍初体积所需天数多出近10 d。同体外研究类似，实验检测了受照射后移植瘤组织中凋亡细胞、DNA损伤及凋亡相关蛋白的表达情况，获得了与体外研究一致的结果，即联合组较单纯放疗组移植瘤组织中凋亡细胞更多，DSBs相关γH2AX、促凋亡蛋白Bax与Caspase-3表达更高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，进一步验证了体内外Olaparib联合放疗时的增敏效应。

综上所述，本研究通过Lewis肺癌细胞及移植瘤模型证实了Olaparib的放疗增敏效应，其可通过增加受照Lewis细胞的DSBs形成，上调Bax/Bcl-2促凋亡体系蛋白表达而提高照射生物效应。为PARP抑制剂在联合放疗方面的应用提供了实验依据，为临床肺癌放疗提供一个新的优良的放疗增敏剂，值得进一步的体内及临床研究。