ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGFR基因突变

Abstract

背景与目的

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突变是决定表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）疗效最重要的预测因子，对EGFR基因突变进行检测，对指导患者个体化治疗具有重要意义。EGFR基因突变检测方法有很多，每种方法各有优缺点，本研究拟采用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）技术与Taqman探针相结合的方法，建立一种能快速、敏感及特异检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的方法。

方法

首先，应用Primer Premier 5.0软件在EGFR基因E746_A750和L858R处设计ARMS引物及Taqman水解探针。然后，以包含E746_A750缺失和L858R点突变的质粒为研究对象，进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性以及特异性。最后，用所建立的ARMS-Taqman法检测100例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）临床标本。

结果

在无背景DNA干扰的情况下，ARMS-Taqman法检测灵敏度可达10 copies。对于检测敏感性，在500 copies/μL野生型基因背景下，其敏感性达1%;在5, 000 copies/μl野生型基因背景下，其敏感性高达0.1%-0.5%。对于检测特异性，以正常人白细胞DNA为研究对象，21 L858R突变存在一定程度的非特异性扩增，但其最小ΔCt高达14.89，而19 Del未见非特异性扩增。对100份临床标本进行检测，19 Del 21例，21 L858R 18例，总突变率为39.0%。

结论

我们所构建的ARMS-Taqman法是一种快速、简便以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法，值得在临床上进一步推广和验证。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，该区域的激活对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的增殖、生长相关信号传递具有重要意义。大量研究^[1-3]表明，EGFR基因突变状态是决定EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）疗效最重要的预测因子，故在晚期NSCLC中检测EGFR基因突变状态至关重要，是决定患者能否一线应用EGFR-TKI的先决条件。EGFR基因突变检测方法有很多，其中Scorpions ARMS法具有检测灵敏度高、操作简便、结果容易判读、省时等诸多优点，在一些大型临床研究^[2]中被广泛采用，但其高昂的检测费用并不适合我国国情。为此，我们自主设计了EGFR基因常见突变的ARMS引物，并联合Taqman探针技术建立了一种快速、简便、经济以及灵敏的检测方法，并取得了满意效果，特此汇报。

1. 材料与方法

1.1. ARMS引物及Taqman探针的设计

在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI）数据库下载EGFR全基因序列。EGFR Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R突变信息分别为2235_2249 del 15和2573 T > G。应用Primer Premier 5.0软件在E746_A750和L858R处设计ARMS引物，其长度约22个碱基，GC含量为40%-60%，Tm值为58 ℃-60 ℃，扩增片段大小为80 bp-150 bp。Taqman探针长度为26个-30个碱基，GC含量为40%-60%，Tm值为68 ℃-70 ℃。另在EGFR Exon 2上设计引物和探针，作为内参。以携带Exon 19 E746_A750缺失突变和Exon 21 L858R点突变的质粒标准品（由中国科学院北京基因组研究所赠送）为研究对象，筛选和确立最佳引物和探针。

荧光定量PCR反应体系如下（20 μL反应体系）：2 ×Taqman Universal PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.5 μL，探针（10 μM）0.4 μL，DNA模板（2 ng/μL-20 ng/μL）2 μL，纯水定容至20 μL。PCR反应程序：50 ℃、5 min; 95 ℃预变性10 min; 40个循环：95 ℃、15 s、60 ℃、45 s（收集荧光）。

1.2. 灵敏性试验

将Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R质粒标准品按10⁰ copies/μL、1×10¹ copies/μL、1×10² copies/μL、1×10³ copies/μL、1×10⁴ copies/μL、1×10⁵ copies/μL进行梯度稀释，按1.1所建立的方法，进行灵敏性试验，每个梯度设3个重复孔。

1.3. 敏感性试验

1.3.1. 19外显子缺失突变敏感性试验

将Exon 19 E746_A750 del突变型质粒分别加入到500 copies/μL和5, 000 copies/μL的Exon 19野生型质粒（由中国科学院北京基因组研究所赠送）中，制成突变率（突变型基因与野生型基因拷贝数百分比）依次为10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的样本，按1.1所建立的方法进行检测，以确定其检测敏感性。

1.3.2. 21外显子点突变敏感性试验

将Exon 21 L858R突变型质粒分别加入到500 copies/μL和5, 000 copies/μL的Exon 21野生型质粒（由中国科学院北京基因组研究所赠送）中，制成突变率依次为10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的样本，按1.1所建立的方法进行检测，以确定其检测敏感性。

1.4. 特异性试验及cutoff值确定

以10份正常人白细胞DNA为研究对象，浓度范围1 ng/μL-50 ng/μL，进行6次重复性试验，统计每次出现的非特异性扩增Ct值及样本的内参Ct值，计算出ΔCt值（ΔCt=Ct_非特异-Ct_内参）。依据公式cutoff ΔCt=平均ΔCt-3×Sd-3，计算出cutoff ΔCt。

1.5. 100份NSCLC组织标本的检测

1.5.1. 标本收集、DNA提取

NSCLC标本来自2008年12月-2010年12月北京协和医院呼吸内科肺癌病房收治，且经临床、影像以及病理诊断为非小细胞肺癌患者，共100例，其中男性53例，女性47例; 腺癌71例（包括细支气管肺泡癌5例），鳞癌22例，其它7例（包括腺鳞癌1例，未定型6例）; 既往采用Scorpions ARMS法检测过的标本29例。每例患者提供石蜡切片5张。采用离心柱法提取石蜡切片DNA（使用商品化Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒）。最后，使用紫外分光光度计测定DNA浓度，调整DNA浓度于2 ng/μL-20 ng/μL之间，冻存于-20 ℃冰箱备用。

1.5.2. ARMS联合Taqman探针技术检测NSCLC组织EGFR基因突变

1.5.2.1. 阳性对照品制备

以提取的20 ng/μL正常人全基因组DNA为背景，加入Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R突变型质粒，制成1:1的突变阳性对照品。

1.5.2.2. 临床样本的检测

按照1.1所建立的ARMS-Taqman PCR反应体系及反应程序对所收集的临床样本进行检测，每一份样本均设立一个阴性对照样本（以纯水代替）和一个阳性对照样本。

计算出每个样本的ΔCt（ΔCt=Ct_突变反应-Ct_内参），依据1.4所建立的cutoff ΔCt值判断结果。若ΔCt值小于cutoff ΔCt值，则为阳性样本; 若ΔCt值大于cutoff ΔCt值，则为阴性样本或超出检测范围。

对ARMS-Taqman PCR检测阳性的标本均进行测序验证，测序由上海生工完成。

2. 结果

2.1. ARMS引物及Taqman探针

以2外显子为内参。表 1列出了2外显子内参引物，19外显子缺失突变ARMS引物、21外显子点突变ARMS引物，以及用于各自扩增产物检测的Taqman探针序列。

1.

检测EGFR基因Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R突变所设计的ARMS引物和Taqman探针序列

Sequences of ARMS primers and Taqman probes designed for the detection of Exon 19 E746_A750 del and Exon 21 L858R mutations in EGFR gene

	Primers (5’-3’)	Probes (5’-3’)
Exon 2 Internal control	F: TGCCAAGGCACGAGTAACAAG R: TCCAAATTCCCAAGGACCAC	FAM-TCTCAGCCTCCAGAGG ATGTTCAATAACT-BHQ1
Exon 19 E746_A750 del	F: AATTCCCGTCGCTATCAAAAC R: ACCCCCACACAGCAAAGC	FAM-CCAACAAGGAAATCCT CGATGTGAGTTTCTG-BHQ1
Exon 21 L858R	F: AAGATCACAGATTTTGTGCG R: CAGCCTGGTCCCTGGTGT	FAM-TTCTTTCTCTTCCGCAC CCAGCAGT-BHQ1

2.2. ARMS-Taqman PCR反应体系检测灵敏度结果

对EGFR基因突变检测的2个反应（19 Del和21 L858R），ARMS-Taqman PCR方法最低可检测至1×10¹ copies/μL。图 1、图 2分别显示19 Del和21 L858R检测反应。

1.

19 Del检测曲线，19 Del突变型质粒浓度梯度依次为：1×10⁵ copies/μL、1×10⁴ copies/μL、1×10³ copies/μL、1×10² copies/μL、1×10¹ copies/μL。

The amplification curves of 19 Del mutation (the concentrations of mutant plasmid was 1×10⁵ copies/μL, 1×10⁴ copies/μL, 1×10³ copies/μL, 1×10² copies/μL and 1×10¹ copies/μL, respectively).

2.

21 L858R检测曲线，21 L858R突变型质粒浓度梯度依次为：1×10⁵ copies/μL、1×10⁴ copies/μL、1×10³ copies/μL、1×10² copies/μL、1×10¹ copies/μL。

The amplification curves of 21 L858R mutation (the concentrations of mutant plasmid was 1×10⁵ copies/μL, 1×10⁴ copies/μL, 1×10³ copies/μL, 1×10² copies/μL and 1×10¹ copies/μL, respectively).

2.3. ARMS-Taqman PCR反应体系检测敏感性结果

对于19 Del突变，如图 3，在500 copies/μL的野生型质粒背景下，可检出突变率为1%;如图 4，在5, 000 copies/μL的野生型质粒背景下，可检出突变率为0.5%。对于21 L858R，如图 5，在500 copies/μL的野生型质粒背景下，可检出突变率为1%;如图 6，在5, 000 copies/μL的野生型质粒背景下，可检出突变率为0.1%。

3.

19 Del在500 copies/μL野生型质粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突变率，ARMS-Taqman PCR可检出含1%突变率样本。

The 19 Del mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 500 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 1%.

4.

19 Del，在5, 000 copies/μL野生型质粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突变率，ARMS-Taqman PCR可检出含0.5%突变率样本。

The 19 Del mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 5, 000 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 0.5%.

5.

21 L858R，在500 copies/μL野生型质粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突变率，ARMS-Taqman PCR可检出含1%突变率样本。

The 21 L858R mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 500 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 1%.

6.

21 L858R，在5, 000 copies/μL野生型质粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突变率，ARMS-Taqman PCR可检出含0.1%突变率样本。

The 21 L858R mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 5c000 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 0.1%.

2.4. ARMS-Taqman PCR反应体系cutoff ΔCt值

对于检测特异性，如表 2所示，19 Del未见非特异性扩增，cutoff ΔCt设定为10。而21 L858R突变存在一定程度的非特异性扩增（6/60），根据计算公式，cutoff ΔCt为10。

2.

Cutoff ΔCt值统计结果

The summary of cutoff ΔCt values

Mutation	Mean ΔCt±SD	Minimal ΔCt	Maximal ΔCt	The occurrence frequency of non-specific amplification	cutoff ΔCt
* means the non-specific amplification.
19 Del	\*	\	17.24	0	10
21 L858R	15.53±0.47	14.89	15.95	6/60	10

2.5. 100例NSCLC临床样本检测结果

100例NSCLC组织标本，采用ARMS-Taqman PCR检测EGFR基因突变，结果显示，19 Del 21例，21 L858R 18例，总突变率为39.0%（39/100）。从EGFR基因突变分布看，19 Del占51.2%（21/39），21 L858R占43.9%（18/39）。

对ARMS-Taqman检测阳性标本进行测序验证，结果显示，测序结果与ARMS-Taqman荧光检测结果完全一致。图 7、图 8分别显示19 Del和21 L858R ARMS-Taqman检测结果与测序结果。

7.

样本1 Exon 19 E746_A750 Deletion突变：荧光检测与测序结果

Exon 19 E746_A750 Deletion mutation (sample 1): the results of ARMS-Taqman and sequencing

8.

样本2 Exon 21 L858R突变：荧光检测与测序结果

Exon 21 L858R mutation (sample 2): the results of ARMS-Taqman and sequencing

100例NSCLC标本中，有29例标本既往曾采用Scorpions ARMS法进行过EGFR基因突变检测。在这29例标本中，Scorpions ARMS法检出19 Del 3例，占10.3%（3/29），21 L858R 6例，占20.7%（6/29），总突变率为31.0%（9/29）。对这29例标本，ARMS-Taqman法检出19 Del 3例，占10.3%（3/29），21 L858R 5例，占17.2%（5/29），总突变率为27.6%（8/29）。两种方法19 Del突变检出一致率为93.1%，Kappa=0.627;21 L858R突变检出一致率为96.6%，Kappa=0.890。

3. 讨论

多项临床研究^[1-6]表明：与标准化疗相比，具有EGFR基因突变的NSCLC患者使用EGFR-TKI，具有更高的客观缓解率和PFS，同时患者生活质量更佳。鉴于此，早在2011版NCCN NSCLC指南就明确指出，对于Ⅳ期非鳞NSCLC患者，应先行EGFR基因突变检测，如果存在EGFR基因突变，治疗上优先推荐EGFR-TKI。可见，EGFR基因突变的检测对指导患者个体化治疗方案的制定具有重要意义。

目前，已经报道的EGFR基因突变类型大约有60种^[7]，其中29种突变最为常见，包括19种19 Del、3种20 Ins、21 L858R、21 L861Q、20 T790M、20 S768I、18 G719A、18 G719S和18 G719C，它们约占EGFR基因突变类型的99%^[8]，其它EGFR基因突变类型罕见，而且和EGFR-TKI疗效之间的关系并不确切，因此并未在临床上指导EGFR-TKI的使用，故仅对这29种常见EGFR基因突变进行检测，足以满足临床所需。

关于EGFR基因突变检测的方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。已经报道的方法包括^[9]：直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、Taqman PCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法和Scorpions ARMS法。直接测序法检测能力有限，其检测敏感性约20%左右，而且步骤复杂、费时费力，但该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。Scorpions ARMS方法是英国QIAGEN公司开发的一种商业化试剂盒，其即是针对上述常见29种EGFR基因突变进行检测，该方法是将分子信标（Scorpions探针、蝎形探针）与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，引物5’端的探针部分自身双链解开并与扩增产物结合，而使分子信标两端的荧光基团和淬灭基团分离产生荧光。该方法敏感性高达1%，同时还具有操作简便、结果判读容易、省时等多种优点^[10]。但是，因其能在一次PCR反应中同时检测这29种EGFR基因突变，众多ARMS引物和Scorpions探针使得检测费用昂贵，约4, 000元/例，不适合我国NSCLC患者的常规检测和筛查。

本研究中所建立的Taqman-ARMS检测方法亦是针对这29种EGFR基因突变位点，通过自主设计的ARMS引物，同时使用普通的Taqman水解探针代替Scorpions探针，使得检测成本大大降低，约300元/例。出于对知识产权的保护，我们在此仅报道了针对19 Del和21 L858R位点设计的ARMS引物和Taqman探针。在无野生型基因以及背景DNA干扰的情况下，本研究所建立的ARMS-Taqman PCR方法检测灵敏度可达10 copies，敏感性达0.1%-1%，同时具有较高的特异性。在对100例NSCLC临床标本的检测中，本研究所创立的ARMS-Taqman方法检出EGFR基因突变率为39%（39/100），这与文献^[11-13]中报道的亚裔患者EGFR基因具有30%-50%左右的突变率的结果一致。从EGFR基因突变分布看，19 Del占53.85%（21/39），21 L858R占46.15%（18/39），这亦与文献^[8]中报道的EGFR基因突变分布情况较为吻合。在与Scorpions ARMS的比较研究中，两种方法具有较高的检测一致率。

综上，本研究所构建的ARMS-Taqman法是一种快速、简便以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法，价格低廉，值得在临床上进一步推广和验证。

Funding Statement

本研究受教育部博士点基金（20091106120014）资助

This study was supported by the grant from the Doctoral Fund of Ministry of Education of China (to Mengzhao WANG)(20091106120014)