Akt在非小细胞肺癌中作用的研究现状

Abstract

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，但其发病机制尚不完全清楚。Akt是一种重要的信号通路关键蛋白，广泛参与肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡及侵袭等过程。本文就Akt及其重要的上下游调节分子之——PDK1、Raf-1和p70S6K在非小细胞肺癌中的作用研究现状做一综述，以期为阐明非小细胞肺癌的发病机制提供新的依据。

肺癌是目前对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一，全球每年约有135万人被确诊为肺癌，120万人死于肺癌^[1]。虽然医学技术有了长足发展，但肺癌患者的5年生存率并未得到明显改善，仅为15%左右^[1]。其根本原因在于肺癌的发病机制尚不清楚、临床缺乏有效的早期诊断和治疗手段。病理学上，肺癌分为小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），后者约占80%-85%。20世纪90年代以来，信号传导通路逐渐成为肿瘤学研究领域的热点。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/Akt）因其处于多条信号通路的交叉点而受到广泛关注。

1. Akt的研究现状

Akt是存在于人类染色体基因组中鼠类胸腺淋巴瘤病毒（T-8 strain from AKR/J mouse, AKT8）致癌基因（v-Akt）的同源物，其编码的蛋白质Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因与蛋白激酶A、C高度同源，又名蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）^[2]。Akt经磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）活化后，磷酸化其下游多种底物，参与细胞生物学功能的调节，影响细胞生物学行为，主要表现为促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高细胞的乏氧耐受性、促进肿瘤细胞侵袭转移和组织血管生成等，从而参与多种肿瘤的发生^[3]。随着研究的深入，现已基本绘制了以Akt为中心的信号通路图（图 1）。

1.

Akt信号通路图

Signaling pathway of Akt

Akt家族包括Akt1、Akt2、Akt3三种亚型，其中Akt2是最重要的一种，不仅具有Akt的普遍特征，还有其独特的生物学功能，主要介导肿瘤细胞的粘附、运动、侵袭和转移^[4-6]。有学者研究发现，约10%-20%的原代胰腺癌细胞和胰腺癌细胞株存在Akt2的扩增或过表达。当用Akt2反义核苷酸转染胰腺癌细胞后，肿瘤生长明显受抑，且仅局限于管腔内；而导入正义核苷酸的对照组肿瘤细胞，其生长则无明显变化，并侵入管壁。此现象表明Akt2的过度表达促进了胰腺癌细胞的生长和侵袭^[7-10]。Rychahou等^[11]用qRT-PCR的方法检测了86例结肠癌患者肿瘤组织和正常结肠组织中Akt2 mRNA的水平，发现肿瘤组织中的Akt2 mRNA是正常组织的8倍-10倍；随后对36例有肝转移的结肠癌患者的正常组织、结肠癌原发灶及肝转移灶进行免疫组织化学染色，结果显示：超过80%的病例的原发灶和转移灶存在Akt2的高表达。为了进一步验证Akt2对细胞侵袭及转移能力的影响，他们用特异性的Akt2 siRNA载体感染已被荧光素标记的肿瘤细胞，并以空转肿瘤细胞为对照，将细胞注入裸鼠脾脏。4周后，实验组裸鼠均未出现肝脏转移，而对照组则出现明显的多发肝脏转移灶。该研究从不同的水平说明了Akt2在促进结肠癌形成和转移中的重要作用，与其在前列腺癌及脑胶质细胞瘤中的结果基本一致^{[12, 13]}。

关于Akt在NSCLC中的研究，有学者发现NSCLC组织中，Akt2基因的重要功能位点（激酶区）低突变，而Akt1与Akt3则未见突变，提示Akt2基因突变可能是促进肺癌发生的重要原因^[14]。Nishioka等^[15]用烟草的主要致癌物质之一亚硝胺吡啶基丁酮（NNK）处理小鼠支气管上皮细胞，1小时后即检测到细胞中的Akt被激活，形成磷酸化Akt（phosphorylated Akt, p-Akt）。Binaifer等^[16]利用免疫组织化学染色技术检测p-Akt在支气管上皮细胞中的表达，发现16例发育不良或化生的支气管上皮组织中p-Akt为阳性，9例增生组织呈弱阳性，而所有的正常组织则均为阴性。进一步对110例NSCLC组织进行分析，结果显示NSCLC中p-Akt的阳性率为51%（56/110），明显高于正常组织，且免疫组织化学染色提示56例肿瘤组织均表达p-Akt2。以上研究提示：Akt尤其是Akt2的活化可能是导致支气管上皮细胞恶变的重要早期事件。

Park等^[17]将细胞间粘附分子-3（intercellular adhesion molecule -3, ICAM-3）基因过表达载体导入NSCLC NCI-H1299细胞株，发现细胞中的Akt被激活，继而细胞的迁移和侵袭能力明显增加。我国学者^[18]也证实肺腺癌细胞的Akt的活化与细胞的侵袭能力呈正相关。另有动物试验^[16]显示，p-Akt不仅能在体外促进细胞的迁移，而且还能在体内增强气道上皮细胞对粘膜的侵蚀，促进气道肿瘤的生长。

关于Akt与NSCLC患者预后的关系，目前的研究结果尚不完全一致。Shah等^[19]分析了82例NSCLC患者病灶组织中p-Akt的表达与患者术后生存时间的关系，结果显示：p-Akt高表达组较低表达组生存时间更长，差异有统计学意义（P=0.007）；而另一项纳入335例NSCLC患者的研究^[20]结果则与之相反，单因素和多因素分析均提示：高水平的p-Akt是患者预后不良的独立危险因素。然而，Binaifer^[16]的研究发现，在110例NSCLC患者中，p-Akt阳性组与阴性组的中位生存时间差异无统计学意义（23个月vs 26个月，P=0.796 4）。

2. Akt上游信号通路蛋白分子——PDK1的研究现状

业已证明，Akt属酯类激酶家族，其活化依赖于上游信号分子的作用。当细胞受到胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子等胞外信号刺激时，PI3K的P110催化亚基被激活，磷酸化二磷酸酯酰肌醇[phosphtidylinositol (4, 5)-bisphosphate, PIP2]生成三磷酸酯酰肌醇[phos-phatidylinositol (3, 4, 5)- triphosphate, PIP3]，诱导无活性的Akt和PDK1从细胞质易位至细胞膜，同时使Akt的构象发生改变，暴露出Thr308和Ser473磷酸化位点。位于细胞膜的Akt与PDK1相互靠近，PDK1催化Akt磷酸化，使其活化^[21]，见图 2。由此可见，PDK1是Akt的重要上游调节分子。

2.

PDK1的作用机制

Mechanism of the action of PDK1

Liu等^[22]观察到EGF诱导细胞中PDK1和Akt共易位。当用PDK1 siRNA干扰乳腺癌细胞PDK1的表达时，Akt的磷酸化水平明显降低，且细胞的转移和趋化能力明显受损。在裸鼠体内，PDK1 siRNA干扰的乳腺癌细胞成瘤速度缓慢，且不能形成肺部转移病灶。Lee等^[23]用PDK1抑制剂OSU-03012处理恶性神经鞘瘤细胞，亦发现细胞的增殖减慢，凋亡增加，体内成瘤能力下降。

然而，目前鲜有关于PDK1在NSCLC中的作用及其对Akt的调节机制的报道。笔者所在课题组在前期研究中发现PDK1和Akt在NSCLC组织中的表达均增高，推测PDK1可能参与Akt的活化，进而影响NSCLC的发生。

3. Akt下游信号通路蛋白分子——Raf-1和p70S6K的研究现状

现已证实，Raf是一种原癌基因，其编码产物为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要参与Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的传导。Raf有3种同型异构体，分别为A-Raf、B-Raf和C-Raf（Raf-1）。B-Raf的作用机制目前已较清楚，而Raf-1的功能则了解较少，一般认为与细胞的抗凋亡作用有关^[24]。近年来，有学者研究发现，Raf-1除了通过Ras/Raf/MEK/ERK通路发挥作用外，还存在非MEK/ERK依赖机制。Raf-1被Akt磷酸化后，在调节细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要作用^[25]。p70S6K是Raf-1的作用底物之一，它是核糖体40s小亚基S6蛋白激酶，被Raf-1活化后，促进含5’-末端寡聚嘧啶（5’-terminal oligopolypyrimidine, 5’-TOP）mRNA的翻译，刺激细胞生长、增殖等^[26]。

Jilavean等^[27]检测了263例痣和523例恶性黑色素瘤组织中Raf-1的表达，发现肿瘤组织Raf-1的水平较痣明显增高（P < 0.000 1），且转移灶较原发灶更高（P=0.022 5）。用Raf-1 siRNA干扰恶性黑色素瘤细胞株Raf-1的表达，细胞凋亡增加。Lyustikman等^[28]的研究结果也显示：神经胶质瘤组织中Raf-1的表达增高；将Raf-1重组逆转录病毒导入小鼠神经胶质细胞，细胞恶变形成神经胶质瘤。目前尚未在NSCLC组织中检测到Raf-1的基因突变；Raf-1转基因小鼠的肺内腺瘤形成的发生率也较低，存在时间亦较短^[29]。然而，Cekanov等^[30]利用烟草致癌原NNK诱导仓鼠发生肺腺癌，并用NNK处理人气道上皮细胞。5周、10周和20周后，仓鼠肺微腺瘤及人气道上皮细胞均被检出有Raf-1的高表达，且呈时间依赖性增加。该实验提示Raf-1可能与肺腺癌的形成有关，是肺腺癌发生的早期标志物之一。实际上，早在20世纪90年代，就有学者利用反义寡核苷酸技术来特异性阻断NSCLC组织中Raf-1的表达，结果发现大部分细胞出现包括染色质浓缩、DNA断裂、annexin Ⅴ结合等在内的凋亡现象，最终细胞死亡^[31]。Kerkhoff等^[29]的分析进一步显示：肺癌细胞株中Raf-1蛋白激酶表达水平的升高可能导致细胞恶性转化。因此临床上出现了利用Raf激酶抑制剂BAY 43-9006治疗NSCLC的方法。2005年在美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）会议上，Adjei等^[32]首次报道了12例NSCLC患者的BAY43-9006 Ⅰ期临床试验结果：1例患者达部分缓解；8例（67%）患者处于疾病稳定期，其中2例长达24周。

p70S6K在乳腺癌及消化道肿瘤中的作用研究较多，而其与NSCLC的关系则报道相对较少。多项研究^[33-35]表明，p70S6K在乳腺癌、肝癌、食道癌、胆囊癌等肿瘤组织中高表达，且磷酸化水平与肿瘤转移、术后复发或死亡等明显正相关。p70S6K对NSCLC意义的研究中，Shen等^[36]用高通量免疫印迹、Western blot和免疫组织化学染色等方法检测肺腺癌和正常支气管上皮组织中p70S6K的表达水平，发现p70S6K在肺腺癌组织中增高，故其在肺腺癌的鉴别诊断中有一定价值。本课题组在前期研究中探讨了Raf-1和p70S6K在不同病理类型NSCLC中的表达，结果显示Raf-1在肺腺癌和鳞癌组织中均呈高表达；而p70S6K则在肺腺癌组织中表达增高，在鳞癌组织中阴性表达。因此，Akt/ Raf-1在肺腺癌和鳞癌组织中是否均通过作用于底物p70S6K而发挥作用尚需进一步的研究和分析。

4. 小结

综上所述，现有的研究已经提示PDK1、Akt、Raf-1和p70S6K四种蛋白质参与了包括NSCLC在内的多种肿瘤的发生。然而，以Akt为中心的PDK1/Akt/p70S6K信号通路在NSCLC中的作用机制尚有待于系统的深入研究，以期进一步明确NSCLC的发生机制，探寻NSCLC早期诊断的分子标志物和靶向治疗新靶点。

Funding Statement

本研究受成都市“十一五”科技规划重大专项（No.07YTYB9612020）资助

This study was supported by a grant from the "The Eleventh Five-Year" Development Planning of Major Projects Chengdu, China (to Weimin LI)(No.07YTYB961020)