CD8⁺NKT细胞表面活化性受体NKG2D在肺癌患者外周血中的表达及临床意义

Abstract

背景与目的

NKT细胞活化性受体NKG2D及sMICA是近来肿瘤免疫研究领域的热点之一。本研究旨在观察肺癌患者外周血中CD8⁺NKT细胞受体NKG2D表达水平的变化，并对NKG2D及sMICA进行相关性分析，探讨它们在肺癌免疫监视中的作用及临床意义。

方法

选择82例初发未治疗的肺癌患者，采用流式细胞术检测外周血CD8⁺NKT细胞活化性受体NKG2D的表达，并以45例健康人作对照，采用酶联免疫吸附法检测肺癌患者血清中sMICA的表达，分析NKG2D与肺癌临床生物学特征的关系。

结果

肺癌患者外周血中CD8⁺NKT细胞表面活化性受体NKG2D水平均低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.001）。随TNM分期的增加，NKG2D的表达率逐渐降低。其中Ⅳ期肺癌患者NKG2D的表达明显低于Ⅰ期-Ⅱ期及Ⅲ期患者该受体的表达，差异有统计学意义（P < 0.001）。肺Ca患者中吸烟人群外周血中CD8⁺NKT细胞受体NKG2D的表达较非吸烟者低，差异有统计学意义（P < 0.05）。CD8⁺NKT细胞受体NKG2D与sMICA呈负相关（r=-0.598, P < 0.001）。

结论

肺癌患者CD8⁺NKT细胞表面受体NKG2D在外周血中低表达，且与肺癌的分期有关；该受体的下调通过血清中sMICA上调的机制参与了肺癌以肿瘤为中心抑制免疫网络的形成；监测NKG2D及sMICA有助于了解患者的免疫功能，可为临床肿瘤的综合治疗提供依据。

肿瘤免疫编辑学说^{[1, 2]}认为机体的免疫系统和肿瘤细胞之间存在着相互作用：免疫系统重塑肿瘤细胞的抗原性；肿瘤细胞改变免疫效应细胞的抗肿瘤效应。其中在抗肿瘤免疫中，活化性受体NKG2D为近几年来研究的热点之一。它在所有的NK细胞、大多数NKT细胞、巨噬细胞和γδ⁺T细胞表面均有表达，另外NKG2D也存在于CD8⁺T细胞表面^[3]。其配体之一是主要组织相容性复合体Ⅰ类相关分子A（major histocompatibility complex class Ⅰ chainrelated A, MICA）。靶细胞表面NKG2D的配体与淋巴细胞表面NKG2D的结合可以激活淋巴细胞杀伤表达NKG2D配体的肿瘤细胞^[4]。因此，NKG2D在肿瘤免疫中发挥重要作用。CD3⁺CD56⁺NKT细胞作为一类新的细胞毒性效应细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性广谱杀瘤作用。但是人们对活化受体NKG2D的认识仅局限于NK细胞及T细胞，该受体在NKT细胞表面的表达情况及其与肺癌临床生物学关系尚不明了。本研究旨在对CD8⁺NKT细胞表面活化性受体NKG2D在肺癌患者外周血中的表达水平及其临床意义进行初步探索。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 研究对象

实验组选取2009年11月-2010年5月山西省肿瘤医院呼吸内科收治的初治肺癌患者82例，年龄43岁-69岁，中位年龄54岁。入选标准为具有完整临床、病理资料、经病理或细胞学、影像学检查确诊的肺癌患者，所有患者均无免疫相关性疾病和其它肿瘤病史，且无使用激素类药物及免疫抑制剂史。根据UICC国际TNM标准2009分类，Ⅰa期-Ⅱb期肺癌患者22例，Ⅲa期-Ⅲb期肺癌患者28例，Ⅳ期肺癌患者32例。根据病理分型分类，鳞癌45例，腺癌37例（不研究小细胞癌）。对照组来自体检职工部分志愿者45例，其中男25例，女20例，年龄40岁-67岁，中位年龄52岁。

1.1.2. 实验试剂与仪器

抗CD3-PerCP、抗CD8-PE、抗CD56-FITC、抗NKG2D-APC四种荧光素直接标记的抗体购自美国BD公司；sMICA酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒为德国IMMATRICS Biotechnologies产品；裂解液购自美国Becton Dickinson公司；PBS磷酸盐缓冲液（pH=7.2-7.4）；Sunrise全自动酶标仪购自奥地利Tacan公司；FACSAria流式细胞仪购自美国BD公司；KDC-1044低速离心机购自科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.2. 方法

采用四色免疫荧光染色（CD3-PerCP/CD8PE/CD56-FITC/NKG2D-APC）方法检测受体NKG2D在CD8⁺NKT细胞表面的表达水平。治疗前抽取患者空腹静脉血2 mL于EDTA钾盐抗凝的真空采血管中，轻轻摇匀后备用。取荧光标记的单克隆抗体20 μL加入EP管中，设相应的同型对照，加入EDTA钾盐抗凝全血100 μL，充分混匀，室温避光孵育20 min；同时加入1 mL红细胞裂解液，混匀后避光孵育10 min，离心7 min（1 500 rpm），弃去上清；加入2 mL PBS洗涤液后离心7 min（1 500 rpm），弃去上清，重复2次，弃去上清PBS，将洗涤液混匀，流式细胞仪上机检测，采用Diva软件分析获取细胞。sMICA根据试剂盒提供的操作方法测定，以波长450 nm检测结果。测定sMICA水平的样本获取：取静脉血2 mL-3 mL于无抗凝真空采血管中，待血液凝固后，2 000 rpm，离心10 min，取血清于1.5 mL的EP管中，-20 ℃保存备用。

1.3. 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行。结果用Mean±SD表示。各实验组之间表达水平差异采用独立样本t检验或One-Way ANOVA进行分析；双变量相关性分析根据变量是否符合正态分布采用Pearson相关分析或Spearman相关分析。以P < 0.05为有统计学差异。

2. 结果

2.1. 对照组健康人群与肺癌患者外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D表达情况

与对照组健康人群相比，患者外周血中CD8⁺NKT细胞受体NKG2D的表达下降（P < 0.001）（表 1，图 1）。

1.

正常人和肺癌患者外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D表达水平

NKG2D expression levels in CD8⁺ NKT cell of normal subjects and lung cancer patients

Group	n	Expression of NKG2D
		（Mean±SD）%	t	P
Control	45	83.52±4.95	-7.77	< 0.001
Lung cancer patient	82	75.73±5.64

1.

对照组健康人和肺癌患者CD8⁺NKT细胞受体NKG2D流式细胞散点图

Scatter plots about NKG2D-expressing CD8⁺NKT cells which was measured by flow cytometry for healthy controls and lung cancer patients

2.2. 肺癌患者外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D与生物学

特征之间的关系与非吸烟患者相比，吸烟患者外周血中CD8⁺NKT细胞受体NKG2D的表达下降（P < 0.05）。CD8⁺NKT细胞受体NKG2D的表达与病理类型、性别、年龄无关（P > 0.05）。随着TNM分期的增加，NKG2D的表达率逐渐降低。其中Ⅳ期肺癌患者NKG2D的表达低于Ⅰ期-Ⅱ期及Ⅲ期患者该受体的表达，差异有统计学意义（P < 0.001）（表 2）。

2.

肺癌患者外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D表达与一般生物学特征的关系

Relationship between the expression of NKG2D-expressing CD8⁺NKT cells and biological characteristics of advanced lung cancer patients

Characteristic		n	NKG2D
			(Mean±SD)%	t	P
Gender				-1.669	0.099
	Male	48	77.99±5.53
	Female	34	80.20±6.45
Age				1.457	0.215
	≤50	24	81.64±7.23
	51-60	32	77.43±5.66
	≥61	26	78.12±6.32
Smoking istory				6.254	< 0.05
	Smoker	49	75.06±4.84
	Non-smoker	33	82.39±6.14
Clinical stage				13.584	< 0.001
	Ⅰ-Ⅱ	22	83.51±6.80
	Ⅲa-Ⅲb	28	80.62±7.16
	Ⅳ	32	74.67±5.41
Histological type				1.46	0.825
	Squamous cell carcinoma	45	81.23±5.14
	Adenocarcinoma	37	79.82±6.37

2.3. 外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D与sMICA的相关性

经线性相关分析表明，外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D和sMICA呈线性负相关（r=-0.598, P < 0.001）（图 2）。

2.

外周血CD8⁺NKT细胞表面受体NKG2D与SMICA负性相关散点图

Scetter Plots about sMICA levers and the number of NKG2D-expressing CD8⁺NKT cells which are negatively corrected

3. 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与机体的免疫状态尤其是细胞免疫密切相关。因此，随着多学科治疗模式的逐步形成，免疫治疗作为继手术、化疗及放疗后第四种肿瘤治疗手段受到人们的广泛重视。自然杀伤性T细胞（natural killer T cell, NKT）是一类在机体早期抗肿瘤免疫机制中起重要作用的效应T细胞，作为机体抗肿瘤的第一道防线，其在抵抗肿瘤和病毒感染过程中起关键作用。NKT细胞以CD3⁺CD56⁺为生物学特征。根据CD4、CD8的表达与否，NKT细胞分为CD4⁺NKT、CD8⁺NKT和（CD4-CD8-）DN三个亚群^[5]。NKT细胞通过识别由非经典的MHC-Ⅰ类分子（CD1d）递呈的糖脂类抗原活化并迅速分泌大量TH1和TH2类细胞因子^{[6, 7]}。NKG2D是自然杀伤性T细胞重要的激活性受体，它通过识别靶细胞（多为肿瘤细胞）表面的配体MICA，并与之结合传递活化信号，继而激活免疫效应细胞（包括NKT细胞）对靶细胞的杀伤作用。因此NKG2D的表达是机体抗肿瘤免疫的关键因素。sMICA是由于肿瘤细胞的死亡、MICA分泌和金属蛋白酶水解而脱落至外周血中的MICA。sMICA降低了肿瘤表面MICA分子的表达水平，而且它还能诱导NKT细胞表面和NK细胞表面受体NKG2D发生内化降解，导致NKT细胞和NK细胞NKG2D的下调，抑制免疫细胞杀伤活性，导致肿瘤逃逸^[8]。

CD8⁺NKT细胞表面表达NKG2D的同时，NK细胞也表达CD56，因此本研究对NKG2D表达的流式细胞结果进行分析时，选择CD3⁺CD56⁺的细胞群，有效避免了NK细胞（CD3-CD56⁺）的干扰，确保了实验结果的准确性。本研究结果表明NKG2D发挥免疫正调节作用。Cristina等^[9]研究发现黑色素瘤患者及结直肠癌患者免疫细胞受肿瘤细胞的编辑，其细胞表面的活化性受体NKG2D表达下降时，NKT细胞的杀伤活性降低；CD8⁺NKT细胞表面受体NKG2D的表达明显低于健康对照组，同时其配体sMICA高于健康对照组；外周血sMICA上调介导的NKT细胞活化受体NKG2D的下调机制参与了以肿瘤为中心抑制免疫网络的形成，与机体免疫状态有着密切联系，可作为监视肿瘤患者免疫功能的参考指标，也可作为评估肿瘤发生发展的参考依据。

肺癌患者细胞免疫处于抑制状态，而机体的免疫状态与肿瘤的侵袭及演进有关。NKG2D表达的检测可作为评价肺癌细胞免疫状态的指标，在肺癌免疫监视中发挥重要作用。本研究结果表明，与健康对照组人群相比，肺癌患者外周血中CD8⁺NKT细胞表面NKG2D受体的表达水平较低（P < 0.001）。笔者认为肺癌患者外周血NKT细胞表面受体NKG2D下调的原因可能是：①血清高表达sMICA诱导了NKT细胞表面的NKG2D发生内化降解^[10]；②与肿瘤分泌有关的一些免疫抑制细胞因子如TGF-β有关^[11]；③可溶性抗原sMICA可作为封闭因子封闭效应NKT细胞表面受体NKG2D，阻止NKT细胞的细胞毒作用，由于其结合位点被占用，因此使用流式细胞仪无法检测到这部分受体的存在，导致所测NKT细胞表面受体NKG2D水平降低。④肺癌细胞表面脱落的sMICA反过来可以下调NKG2D受体的表达而产生肺癌免疫逃逸。

肿瘤的免疫治疗建立在免疫系统的监视功能的基础上，即免疫系统能够识别肿瘤细胞并将其杀死。本研究结果表明，肺癌患者外周血中CD8⁺NKT细胞表面NKG2D受体的表达较健康人群低（P < 0.001），同时该受体的表达与吸烟、临床分期相关（P < 0.05），且随着临床分期的增加，NKG2D的表达逐渐降低。其中Ⅰ期-Ⅱ期及Ⅲ期肺癌患者NKG2D的表达均明显高于Ⅳ期患者该受体的表达，差异有统计学意义（P < 0.001），但它与肺癌病理分型、年龄及性别无关（P > 0.05），说明外周血中CD8⁺NKT细胞表面NKG2D受体与肺癌的发生发展及预后密切相关。研究同时表明，外周血CD8⁺NKT细胞受体NKG2D和其配体sMICA呈线性负相关，间接证实肺癌患者血清sMICA升高介导NKG2D下调的肿瘤免疫逃逸机制，而其中NKG2D发挥免疫正调节作用。综上所述可能由于其表面NKG2D受体表达的下降，肺癌患者体内NKT细胞对肺癌细胞的反应性降低，因此不能对肺癌细胞进行有效地杀伤，同时表面MICA/B配体的表达而逃逸NKT细胞的细胞毒作用。肺癌细胞也可能通过减少其上调介导NKT细胞活化受体NKG2D下调机制参与了晚期肺癌以肿瘤为中心抑制免疫网络的形成，与机体免疫状态有着密切联系，可作为监视晚期肺癌患者免疫功能的参考指标，也可作为评估肺癌发生发展的参考依据。但以N KG2D-MICA为基础的免疫监视功能在肺癌患者中如何发挥作用、如何诱导肺癌细胞表面MICA/B的表达、如何减少膜性MIC的脱落以及如何上调NKG2D的表达以恢复NKT细胞的活性值得深入研究。