启动子区H3K27me3修饰异常促使系统性红斑狼疮患者CD4⁺ T细胞CREMα过表达

Abstract

目的

探讨SLE中CREMα表达升高的原因。

方法

分离5名正常对照和5名SLE患者的CD4⁺ T细胞，用染色质免疫沉淀（ChIP）微阵列法对各种基因启动子区组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）的水平进行分析。随后分离30名正常对照和30名SLE患者的CD4⁺ T细胞，用ChIP结合实时定量PCR检测CREMα启动子区H3K27me3、H3K27去甲基化酶JMJD3和UTX、H3K27甲基转移酶EZH2的水平，采用实时定量RT-PCR检测CREMα mRNA水平。

结果

SLE CD4⁺ T细胞的CREMα启动子区H3K27me3水平是正常对照的0.23倍。随后通过ChIP结合实时定量PCR，我们证实了SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3水平显著降低（P＜0.001），且与CREMα mRNA水平呈显著负相关（P＜0.001）。该区的JMJD3水平显著升高（P＜0.001），且与H3K27me3水平呈负相关（P＜0.001），与CREMα mRNA水平呈正相关（P＜0.001）。而UTX（P=0.172）及EZH2（P=0.281）水平则与对照组无明显差异。

结论

SLE CD4⁺ T细胞CREMα启动子区JMJD3增多，导致该区H3K27me3水平降低，结果促使CREMα过表达，最终引起SLE的发病。

系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，涉及到多重致病机制^[1-2]。近年来，越来越多的研究证明了T细胞某些基因表观遗传学的改变在SLE的发病机制中起到了关键的作用^[3-4]。表观遗传学指的是不涉及DNA序列变化的稳定且可遗传的基因表达改变，其机制主要包括DNA甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA调控，以及染色质重塑^[5-6]。而在这些表观遗传学调控机制中，作为基因沉默标志的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)一直备受关注^[6-7]。已知H3K27me3的水平由组蛋白去甲基化酶JMJD3 ^[8-9]、UTX ^[10-11]和组蛋白甲基转移酶EZH2 ^[12]共同参与调控。

研究发现cAMP反应元件调控因子α (CREMα)在SLE的发病机制中起到关键作用。CREMα水平在SLE患者的T细胞中显著升高，且CREMα启动子活性与SLE疾病活动指数(SLEDAI)呈正相关^[13-15]。升高的CREMα可从多个方面促使SLE的发生与发展：首先，CREMα水平升高可导致IL-2减少，进而致使机体对细胞毒素反应的减弱，Treg细胞数目和功能的降低，以及活化诱导的细胞死亡(AICD)的缺陷^[16-17]；其次，CREMα水平升高还可导致IL-17A增加，而增加的IL-17A则会与多种趋化因子和细胞因子相互作用从而引发多重炎症反应^[18]；IL-17A也能刺激B细胞增殖，从而产生更多的自身抗体^{[15, 19-20]}；此外，CREMα的过表达能抑制TCR/CD3ζ链的转录从而阻碍其终止T细胞反应，导致T细胞持续活化；它还能抑制转录因子c-fos、抗原提呈细胞分子CD86、Notch信号通路分子Notch-1等而参与SLE的发病^[21-24]。那么SLE患者T细胞CREMα水平升高的原因又是什么呢？

通过染色质免疫沉淀(ChIP)微阵列，我们发现SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区的H3K27me3水平显著低于正常对照。以此为线索，我们进一步探讨SLE CD4⁺ T细胞CREMα表达升高的原因，为揭示SLE的发病机制提供新的思路。

1. 资料和方法

1.1. 研究对象

30名SLE患者来自中南大学湘雅二医院皮肤科门诊及住院部。所有的患者均符合1997年美国风湿协会制订的SLE诊断标准^[25]。SLE患者相关的临床信息见表 1。其中女性27例，男性3例，年龄20~42(28.567± 6.558)岁，SLEDAI评分0~16(7.567±4.384)分。30名正常对照均为中南大学湘雅二医院健康职工和研究生。其中女性27例，男性3例；年龄20~41(27.133± 6.067)岁。患者及正常对照年龄性别均无统计学差异(P＞0.05)，并均签署了知情同意书。本次研究获得了中南大学湘雅二医院伦理委员会的批准。

1.

患者资料表

Patient profiles

Patient	Gender	Age (year)	SLEDAI	Medications
a: Prednisone; b: Hydroxychloroquine; c: Tripterygium glycoside.
1	Female	35	6	Preda 30 mg/d
2	Female	34	7	None
3	Male	28	6	Pred 40 mg/d
4	Female	32	4	HCQb0.2 g/d
5	Female	25	8	Pred 50 mg/d
6	Female	24	9	Pred 30 mg/d
7	Female	21	12	None
8	Female	23	8	Pred 30 mg/d
9	Female	25	15	Pred 50 mg/d
10	Female	29	3	None
11	Female	32	15	Pred 40mg/d, TGc 30mg/d
12	Female	23	2	None
13	Female	20	3	Pred 5 mg/d
14	Female	22	10	Pred 30 mg/d, TG 30 mg/d
15	Female	25	0	None
16	Male	40	10	Pred 40mg/d, HCQ0.2 g/d
17	Female	42	14	Pred 40 mg/d, TG 30 mg/d
18	Female	26	2	HCQ 0.2 g/d
19	Female	20	8	None
20	Female	35	12	Pred 35 mg/d, HCQ0.2 g/d
21	Female	37	16	Pred 50 mg/d, TG 30 mg/d
22	Female	26	10	Pred 40 mg/d
23	Female	24	8	Pred 40 mg/d
24	Female	28	4	None
25	Female	29	5	TG 30 mg/d
26	Female	34	8	None
27	Male	37	12	Pred 40 mg/d
28	Female	20	2	HCQ 0.2 g/d
29	Female	22	4	Pred 30 mg/d
30	Female	39	4	Pred 30 mg/d

1.2. 材料与试剂

淋巴细胞分离液购自瑞典GE Healthcare公司；CD4⁺ T细胞阳性分选试剂盒购自德国Miltenyi公司；ChIP试剂盒购自美国Millipore公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；SYBR^® Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)和One Step SYBR PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；抗H3K27me3抗体购自美国Millipore公司；抗JMJD3抗体、抗UTX抗体和抗EZH2抗体购自美国Abcam公司；PCR引物由上海铂尚生物有限公司合成。

1.3. 细胞分离

抽取实验对象外周静脉血60 mL (用20 U/mL肝素抗凝)，加入淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。所得PBMC加入PBS洗涤，随后使用免疫磁珠进行阳性分选获得CD4⁺ T细胞。

1.4. ChIP微阵列

使用1%的甲醛对5名SLE患者和5名年龄、性别均匹配的正常对照的CD4⁺ T细胞进行固定，随后使用裂解缓冲液对细胞进行裂解。SLE患者和正常对照细胞的裂解液分别进行混合，随后送至北京博奥生物有限公司。ChIP微阵列的质控、标记、杂交、扫描以及统计分析由博奥公司进行。抗H3K27me3抗体沉淀的DNA和总DNA (input)分别采用Cy5 (红色)和Cy3 (绿色)进行标记。标本随后杂交于微阵列板中，最后得到Cy3/Cy5比例图像。在这些图像中，不同的颜色强度代表各种基因启动子区相对的H3K27me3水平。与正常对照CD4⁺ T细胞相比，SLE CD4⁺ T细胞启动子区H3K27me3水平增加至2倍以上或减少至0.5倍以下被认为具有显著意义。

1.5. ChIP结合实时定量PCR

按照厂家说明书，采用ChIP试剂盒进行ChIP分析。简而言之，CD4⁺ T细胞使用1%甲醛固定10 min，随后使用裂解缓冲液进行裂解，并用超声波剪切细胞裂解液中的DNA，离心后取上清液。使用蛋白G琼脂糖珠去除非特异性背景后，加入抗体并在4 ℃中涡旋孵育过夜。次日，加入蛋白G琼脂糖珠并在4 ℃中涡旋孵育1 h以结合免疫复合物。琼脂糖珠-DNA-蛋白复合物经清洗后，再使用洗脱缓冲液将DNA-蛋白复合物洗脱出来，置于65 ℃中加热4 h以解除DNA和蛋白质之间的交联，随后将DNA进行纯化。使用SYBR^® Premix Ex Taq^TM (Tli RNaseH Plus)试剂盒，通过标准曲线相对定量法进行实时定量PCR检测DNA水平。具体方法如下：以获得的DNA为模板进行扩增，同时取一份DNA样本，将其对倍稀释成5个梯度作为标准品，2/4/8/16/32倍稀释，以此产生标准曲线用于计算每一份样本的相对浓度，同时以input作为内参照。目的蛋白结合的DNA浓度相对于input DNA浓度的倍数即为相对定量的结果。所有实验重复3次。引物序列如下：CREMα启动子区上游引物：5'-TGGGGAGATAGAGGTTGCAG-3'，下游引物5'-CGCCAGAAATCCAATGACTT-3'。反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s，60 ℃，15 s，72 ℃，20 s，共40次循环。

1.6. RNA抽提与实时定量一步法RT-PCR

按照厂家说明书，采用TRIzol对分离的CD4⁺ T细胞总RNA进行抽提，紫外/可见光分光光度计测定总RNA浓度及A₂₆₀/A₂₈₀比值。A₂₆₀/A₂₈₀比值均在1.8~2.0之间。所得RNA分装冻存于-80 ℃中。使用One Step SYBR PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒，通过标准曲线相对定量法进行实时定量一步法RT-PCR检测mRNA水平。方法与前述的实时定量PCR类似，以CD4⁺ T细胞的RNA为模板，同时扩增β-actin作为内参照。同一标本目的基因的浓度相对于其β-actin的浓度的倍数即为相对定量的结果。所有实验重复3次。引物序列如下：CREMα上游引物5'-GAAACAGTTGAATCCCAGCATG ATGGAAGT-3'，下游引物5'-TGCCCCGTGCTAGTC TGATATATG-3'；β-actin上游引物5'-CGCGAGAAGAT TGACCCAGAT-3'，下游引物5'-GCACTGTGTTGGCG TACAGG-3'。反应条件为：42 ℃，5 min；95 ℃，10 s；95 ℃，10 s，60 ℃，20 s，共40次循环。

1.7. 统计分析

采用SPSS 16.0 for windows统计软件储存和分析数据。计量资料以均数±标准差表示。两组独立样本均数之间进行比较采用两样本t检验，部分实验指标间作单因素直线相关分析，计算Pearson相关系数。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. ChIP微阵列结果

在ChIP微阵列中，共筛查了20832个不同的基因启动子，其中552个基因启动子区H3K27me3水平在两组中差异达到2倍以上。在这些基因中，SLE CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3水平是正常对照CD4⁺ T细胞的0.23倍。

2.2. ChIP微阵列结果验证

为了证实ChIP微阵列的结果，我们采用ChIP结合实时定量PCR检测了30名正常对照和30名SLE患者的CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3的水平。相对于正常对照，SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3水平显著降低(正常对照vs SLE患者：2.723±0.659 vs 0.489±0.146，P＜0.001)，这与我们的ChIP微阵列结果相符。我们进一步检测了SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα mRNA水平，结果证实了在SLE患者的CD4⁺ T细胞中，CREMα启动子区的H3K27me3与其mRNA水平呈负相关(r=-0.796，P＜0.001，图 1)。

1.

SLE CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3的水平与CREMα mRNA表达的相关

Correlation between H3K27me3 enrichment within the CREMα promoter in SLE CD4⁺ T cells and the levels of CREMα mRNA.

2.3. SLE患者和正常对照CD4⁺ T细胞CREMα启动子区JMJD3、UTX和EZH2水平

ChIP结合实时定量PCR结果显示，相对于正常对照，SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区JMJD3水平明显增加(P＜0.001，图 2A)。且在SLE患者的CD4⁺ T细胞中，此区域的JMJD3水平与H3K27me3呈负相关(r=-0.803，P＜0.001，图 2B)，而与CREMα mRNA水平呈正相关(r=0.697，P＜0.001，图 2C)。然而，SLE患者和正常对照CD4⁺ T细胞的CREMα启动子区UTX(P= 0.172)及EZH2 (P=0.281)水平并无明显差异(图 2A)。

2.

正常对照和SLE CD4⁺ T细胞CREMα启动子区JMJD3、UTX和EZHZ的水平及JMJD3与H3K27me3、CREMα水平的相关

Levels of JMJD3, UTX and EZH2 binding within the CREMα promoter region in CD4⁺ T cells from healthy controls and SLE patients and the correlations of JMJD3 with H3K27me3 and CREMα. A: Relative levels of JMJD3, UTX, and EZH2 within the HPK1 promoter region in healthy and SLE CD4⁺ T cells. B: Correlation between JMJD3 promoter binding and H3K27me3 level in SLE CD4⁺ T cells. C: Correlation between JMJD3 promoter binding and CREMα mRNA level in SLE CD4⁺ T cells.

3. 讨论

SLE患者发生自身免疫的关键在于CD4⁺ T细胞过度活化，进而刺激B细胞，结果导致各种自身抗体过度产生。而CD4⁺ T细胞某些免疫相关基因启动子区的表观遗传学改变则是CD4⁺ T细胞过度活化的重要原因。但目前的研究大多集中于DNA甲基化上^[26-27]，而对SLE CD4⁺ T细胞组蛋白修饰的探讨则非常有限。

已知H3K27me3能抑制基因的转录。它可与PRC1中的Pc蛋白结合，从而募集PRC1到染色质。PRC1可阻断转录活化因子及染色质重塑因子与DNA结合，并阻碍RNA聚合酶Ⅱ发动的转录；此外，PRC1还能与组蛋白去乙酰化酶相联，后者能抑制基因的转录；而且，PRC1和H3K27me3还能阻碍正性活化标志，例如H3K4的甲基化^[28-29]。因此，H3K27me3一直是表观遗传学的研究热点之一。为了探讨SLE患者CD4⁺ T细胞的基因启动子区H3K27me3水平与正常对照有无差异，我们通过ChIP微阵列对正常对照和SLE患者的CD4⁺ T细胞各种基因启动子区的H3K27me3水平进行了检测和筛选，结果我们发现，SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3的水平较低，这与SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα表达水平升高正相吻合。

近年来，CREMα在SLE中所起到的作用已得到了充分的研究和验证，然而，引起SLE T细胞CREMα增加的分子机制至今仍不清楚。ChIP微阵列的结果提示了我们，可能正是由于SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3水平降低导致了CREMα水平升高。为此，我们首先通过ChIP结合实时定量PCR对ChIP微阵列的结果进行了验证，结果正如所料，SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3的水平显著低于正常对照。而且，我们发现H3K27me3与CREMα mRNA的水平呈负相关。这些结果表明SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα水平升高的原因可能是因为其启动子区H3K27me3水平较低所致。

那么，SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3水平降低的原因又是什么呢？前文已述，H3K27me3的水平由组蛋白去甲基化酶JMJD3、UTX和组蛋白甲基转移酶EZH2共同参与调控。于是我们采用ChIP结合实时定量PCR对这3种H3K27甲基化调控酶在CREMα启动子区的表达进行了检测，结果发现SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区JMJD3显著增加，且JMJD3与H3K27me3水平呈负相关，而与CREMα mRNA水平呈正相关。然而，SLE患者和正常对照CD4⁺ T细胞CREMα启动子区的UTX及EZH2水平无明显差异。

综合上述结果，我们的研究提示SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区JMJD3增加，这可导致此区域H3K27me3水平下降，从而促使CREMα增多，这一改变可能是引起SLE发病的重要机制之一。本研究为SLE的发病机理提供了新的理论依据，并为SLE的治疗提供了潜在的治疗靶点。

前文已述，H3K27me3能阻碍正性活化标志H3K4的甲基化。有趣的是，我们团队已证实了SLE患者CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K4me3的水平明显高于正常对照^[30]。而本次试验中，我们又发现SLE CD4⁺ T细胞CREMα启动子区H3K27me3水平显著降低，这就使得我们联想到这二者之间是否有因果关系，还是相互独立的事件？还有待进一步的研究。

Biography

张庆，博士，助理研究员，E-mail: 245145077@qq.com

Funding Statement

国家自然科学基金（81301359）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81301359)