人卵子玻璃化冷冻原因及其技术在辅助生殖中的应用

Abstract

目的

探讨人卵子玻璃化冷冻的原因及其技术在辅助生殖中的可行性和临床应用价值。

方法

回顾性研究2008年1月~ 2018年10月在南方医科大学南方医院生殖医学中心行卵子玻璃化冷冻的26例患者共27个取卵周期，分析卵子玻璃化冷冻原因、卵子解冻后受精情况及临床妊娠结局。

结果

26例患者27个取卵周期共冷冻卵子274枚，卵子冷冻原因主要包括取卵日男方精子数量及质量差无可用精子、男方处于各种疾病急性期不适宜取精及男方因各种原因未能到场取精等。共19个周期行卵子解冻，该19个周期共冻存卵子217枚，解冻后存活176枚，卵子解冻存活率81.11%，其中131枚卵子解冻后行卵胞浆内单精子注射，正常受精98枚，正常受精率74.81%；卵裂88枚，卵裂率89.80%（88/98）；共形成可移植胚胎53枚，其中优质胚胎36枚，优质胚胎率36.73%（36/98）。15个移植周期共移植胚胎27枚，临床妊娠率为53.33%（8/15），活产率为33.33%（5/15）。随患者年龄增加，与 < 35岁组相比，≥35岁组患者卵子复苏率（82.76% vs 74.42%，P=0.211）、临床妊娠率（77.78% vs 16.67%，P=0.041）及活产率（55.56% vs 0，P=0.044）均呈下降的趋势。

结论

卵子玻璃化冷冻可作为不孕夫妻取卵当日因男方因素不能提供精子患者的临床补救措施；卵子玻璃化冻融后的受精率、临床妊娠率结局良好，卵子复苏率与年龄存在相关性，女性≤35岁者冻卵能够获得满意的临床妊娠结局。

人卵母细胞（简称卵子）冷冻保存主要用于辅助生殖技术及女性生育力保存。尽管早在1986年澳大利亚Chen ^[1]首次报道成功应用卵子慢速冷冻技术获得双胎妊娠和分娩，由于卵母细胞结构的特殊和冷冻方法技术的限制，其临床应用发展缓慢受限。直至Kuleshova等^[2]于1999年通过玻璃化冷冻技术进行人类卵子的冻存，后续国外通过研究探索明显提高了卵子冻存解冻后临床妊娠结局^[3]，近10余年其文献报道超过数千篇，其技术较为成熟，故美国生殖医学会^[4]2013年提出卵母细胞冷冻保存不再属于实验研究技术，将其列为成熟的临床应用项目，其临床应用范围广泛。国内由于多种原因，玻璃化冷冻的临床应用受到限制，开展卵子冻存的医院屈指可数，其卵子冻存的适应症主要限于取卵周期因丈夫未能够取精，另有极少数医院开展不孕妇女取卵较多将部分卵子冻存备用和冻存卵子进行生育力保存，国内有关卵子冻存的应用文献报道仅数篇^[5-6]。早期研究采用的冷冻方法为慢速冷冻法，并非目前普遍采用的玻璃化冷冻方法，故研究结果可能存在差异，近期研究虽采用玻璃化冷冻法，但未考虑患者年龄对冷冻结局的影响。本研究采用玻璃化冷冻方法，且对不同年龄段患者进行对比分析，探讨了卵子玻璃化冷冻的最佳年龄，对卵子冷冻临床应用具有重要参考价值。

1. 资料和方法

1.1. 研究对象

选取2008年1月~2018年10月在南方医科大学南方医院生殖医学中心行卵子玻璃化冷冻治疗的26例患者共27个取卵周期。卵子冷冻的原因主要包括：男方无精子症或重度生精低下，且拒绝使用供精；男方取卵当日睾丸穿刺未取到精子或所获精子为不动精子；男方取卵当日因个人特殊因素不能到达医院取精；男方因取卵前出现急症性疾病正在用药不适宜取精等。患者夫妻双方均在告知冷冻卵子相关风险及签署知情同意书的情况下实施卵子玻璃化冷冻。根据患者年龄分为 < 35岁组和≥35岁组，分析比较两组基础资料、卵子冷冻后解冻及临床妊娠结局。

1.2. 卵子冷冻及解冻过程

1.2.1. 控制性超促排卵方案

患者在取卵周期采用促性腺激素释放激素激动剂长方案、拮抗剂方案或自然周期（卵巢储备功能低下、卵巢低反应）行促排卵，在超声引导下行经阴道取卵术。

1.2.2. 卵子评价标准

电子显微镜下观察卵子，若外观均匀透亮，无细胞质变色、卵细胞破裂或固缩，细胞质和透明带相连，无透明带断裂，则判断为存活卵子；若细胞质变性、变黑或固缩，或存在透明带断裂现象，则判断为受损卵子。

1.2.3. 卵子玻璃化冷冻

患者取卵后，将卵子放于受精培养液（批号：505319，Vitro life）中，置于37 ℃、6% CO₂培养箱中培养2 h后，去除卵子外周颗粒细胞，将成熟卵子（电子显微镜下观察可见第一极体）进行玻璃化冷冻保存。玻璃化冷冻保存的具体操作步骤为：采用玻璃化冷冻试剂盒（批号：Y0847，Kitazato），其冷冻液包括平衡液（ES）和玻璃化冷冻液（VS），均于2~8 ℃保存，使用前取出，置于室温（23 ℃）下平衡处理30 min。采用吸卵管将卵子从培养液中吸出，置于ES表面，卵子自然下沉，于电子显微镜下观察卵子形状，卵子出现皱缩再恢复原形状（整个过程为5~10 min）时，将卵子放入VS中，约30 s后，再将卵子装载于全封闭载杆（CryoBioSystem）上，将载杆立即浸入液氮中使之迅速降温，并置于液氮罐中保存。

1.2.4. 卵子玻璃化解冻

采用玻璃化解冻试剂盒（批号：Z0872，Kitazat），其解冻液包括孵育液、稀释液及洗脱液-1、-2，均于2~8 ℃保存。使用前，将孵育液于37 ℃条件下平衡30 min，稀释液及洗脱液-1、-2，均于室温下（23 ℃）平衡30 min。将装载冷冻卵子的全封闭载杆从液氮罐中取出，迅速放入孵育液中1 min，使卵子脱落于孵育液中，然后将卵子依次置于稀释液、洗脱液-1和洗脱-2中各3 min，待卵子形态完全恢复后，将其转移至受精培养液中培养2~3 h。

1.2.5. 授精处理

冷冻卵子解冻后均行卵胞浆内单精子注射（ICSI）受精，后将卵子置于卵裂培养液（批号：505287，Vitrolife）中，培养18 h后，于Olympus IX71倒置荧光显微镜（Olympus）下，观察卵子是否有原核形成、第二极体是否排出。若观察到卵子双原核和第二极体出现，则为正常受精；若观察到多原核或单原核，则为异常受精。每24 h观察1次胚胎卵裂情况，并根据卵裂球数、碎片、卵裂球大小均一程度对胚胎进行评分。

1.3. 胚胎移植及移植后处理

采用激素替代周期、自然周期或促排卵方案进行子宫内膜准备，待子宫内膜准备充分后，进行子宫内膜转化及胚胎移植，所有患者均移植1~2枚胚胎。胚胎宫腔内移植11~14 d后，检测患者血清β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）水平，移植后4周行阴道B超检查，宫腔内见妊娠囊确定为临床妊娠。确诊为宫内妊娠后，随访并记录临床妊娠及分娩结局。

1.4. 统计学分析

本研究采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布用均数±标准差表示，不符合正态分布采用中位数表示，两样本间均数比较采用独立样本t检验，计数资料以百分率表示，率的比较采用χ²检验，理论频数小于5时采用Fisher确切概率法，非正态分布资料采用非参数检验，P < 0.05（双侧）认为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 患者行卵子冷冻原因分析

本研究中共26例患者27个取卵周期行卵子冷冻，27个卵子冷冻周期共冻存卵子274枚，其中19个卵子解冻周期，8个周期未解冻。卵子冷冻原因主要包括男方无精子症或重度生精低下、男方取卵日未能够取到精子或所取精子为不动精子、男方取卵日未能够到场取精、男方处于疾病急性期不适宜取精及其他原因（患者证件不符及个人原因）等（表 1）。

1.

卵子冷冻原因分析

Analysis of the causes of oocyte vitrification

Causes of oocytes vitrification	No. of cycles	Proportion (%)
Husband was azoospermia or severe spermatogenesis disorder	6	22.22
Sperms failed to be obtained from the husband on the day of oocyte retrieval	10	37.04
Husband was unable to reach the hospital on the day of oocytes retrieval	4	14.81
Husband was not suitable for sperm collection due to acute diseases	5	18.52
Other	2	7.41

2.2. 两组患者基本资料及冻卵情况比较

对两组患者进行比较，患者年龄24~41岁，< 35岁组17例，≥35岁组10例。两组患者平均年龄、基础卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E₂）水平存在统计学差异（P < 0.05）。两组不孕年限、体质量指数、原发性不孕比例、基础黄体生成素（LH）、孕酮（P）水平及基础窦状卵泡数无统计学差异（P>0.05）。 < 35岁组获卵数、冷冻总卵子数及第二次减数分裂中期（MII）卵子数明显高于≥35岁组（P < 0.05），两组患者共冷冻卵子274枚，其中MII卵子数207枚（表 2）。

2.

两组患者基础资料及冻卵情况比较

Comparison of baseline characteristics and oocyte vitrification between the two groups

Index	< 35 years group	≥35 years group	P
No. of cycles	17	10
Age (year)	28.59±2.92	38.00±1.83	< 0.001
Years of infertility	3.06±1.71	3.50±2.07	0.555
Body mass index (kg/m2)	21.17±3.07	22.14±3.60	0.464
Proportion of primary infertility (%)	70.59 (12/17)	30.00 (3/10)	0.057
Basal serum FSH (U/L)	6.30±1.29	9.95±6.68	0.036
Basal serum LH (U/L)	4.61±2.25	6.09±6.21	0.377
Basal serum E2 (ng/L)	35.08±8.93	57.36±43.10	0.048
Basal serum P (μg/L)	0.51±0.16	0.60±0.12	0.167
Antral follicle count	13.92±5.58	9.00±5.75	0.079
No. of oocytes retrieved	15.29±6.87	4.90±3.64	< 0.001
No. of oocytes vitrification	13.29±6.49	4.80±3.65	0.001
No. of MII oocytes vitrification	10.53±5.50	3.50±2.88	0.001

2.3. 两组患者卵子解冻结局比较

27个卵子冷冻周期中，共19例患者19周期进行了卵子解冻，其余8个周期由于男方精子差，卵子尚未解冻。解冻周期患者年龄25~40岁，< 35岁组11例，≥35岁组8例，19例患者共冻存卵子217枚，解冻后存活176枚，卵子解冻存活率81.11%，卵子冻存时长中位数为3月（1~47月）。共131枚MII卵子行ICSI，正常受精98枚，正常受精率74.81%；卵裂88枚，卵裂率89.80%（88/ 98）；共形成可移植胚胎53枚，其中优质胚胎36枚，优质胚胎率36.73%（36/98）。 < 35岁组冷冻卵子数、存活卵子数及ICSI注射MII卵子数高于≥35岁组（P < 0.05），卵子存活率、正常受精率、卵裂率及优质胚胎率可能因样本量较小未见明显统计学差异（P>0.05，表 3）。

3.

两组患者卵子解冻结局比较

Comparison of the outcomes of oocyte thawing between the two groups

Index	< 35 years group	≥35 years group	P
No. of cycles	11	8
No. of oocytes vitrification	15.82±6.08	5.38±3.82	0.001
Vitrification freezing duration (month)	4.0 (1-47)	2.5 (1-17)	0.295
No. of oocytes survived	13.09±5.05	4.00±2.73	< 0.001
Survival rate (%)	82.76 (144/174)	74.42 (32/43)	0.211
No. of MII oocytes for ICSI	9.55±4.46	3.25±2.12	0.002
Normal fertilization rate (%)	72.38 (76/105)	84.62 (22/26)	0.198
Cleavage rate (%)	88.16 (67/76)	95.45 (21/22)	0.449
No. of embryos available	3.36±2.50	2.00±1.41	0.185
No. of high quality embryos	2.45±2.34	1.13±1.73	0.193
High quality embryo rate (%)	35.53 (27/76)	40.91 (9/22)	0.645

2.4. 两组患者妊娠结局比较

19个卵子解冻周期，15个周期卵子解冻后行ICSI-胚胎移植，4个周期由于未形成可移植胚胎或患者个人原因暂未行胚胎移植，4个周期共冻存胚胎3枚。15个移植周期共移植胚胎27枚，着床10枚，胚胎种植率37.04%，获临床妊娠8例，临床妊娠率53.33%，分娩5例（3例分娩单活胎，2例分娩双活胎），活产率33.33%，< 35岁组妊娠结局明显优于≥35岁组（P < 0.05，表 4），对患者妊娠期及后续新生儿随访未见明显异常。

4.

两组患者临床妊娠结局比较

Comparison of clinical pregnancy outcomes between the two groups

Index	< 35 years group	≥35 years group	P
No. of cycles	9	6
No. of embryos transferred	1.55±0.82	1.25±0.89	0.464
Endometrial thickness (mm)	8.88±1.64	10.00±1.83	0.305
Clinical pregnancy rate (%)	77.78 (7/9)	16.67 (1/6)	0.041
Implantation rate (%)	52.94 (9/17)	10.00 (1/10)	0.042
Live birth rate (%)	55.56 (5/9)	0 (0/6)	0.044

3. 讨论

在世界范围内，卵子冷冻及复苏技术经历了数十年的研究探索，近年来发展迅速且日臻成熟完善，但仍有诸多问题有待探索和提高。美国生殖医学会指南于2013年首次将卵母细胞保存冷冻不再定义于实验研究技术之列，而属于临床应用项目。本研究通过回顾分析卵子玻璃化冷冻的临床结局，证实了卵子玻璃化冷冻的可行性和有效性，为今后卵子冷冻临床应用提供了重要参考依据。

目前广泛采用的玻璃化冷冻技术在一定程度上改善了慢速冷冻的缺陷，研究表明其卵子玻璃化冷冻的卵子复苏率、受精率均优于程序化慢速冷冻^[7-8]。故目前在世界范围内，卵子玻璃化冷冻技术已基本取代程序化慢速冷冻技术，但玻璃化冷冻仍存在卵子复苏率较低等问题，原因可能在于高浓度的冷冻保护剂对卵子产生不利影响及冷却和升温速率造成卵子损伤等，大量研究探索了如何减少卵子冷冻过程的损伤及改善临床结局，包括优化促排卵过程、采用玻璃化冷冻技术、探索新型低浓度低细胞毒性冷冻保护剂、适当的玻璃化装置探索最佳冷却和升温速率等措施^[9-10]有望改善临床结局，对于未成熟卵应选择体外培养成熟后行玻璃化冷冻还是玻璃化冻存后行体外培养成熟目前尚无定论^[11-12]，需要进一步研究证实。

近年国外有文献报道卵子玻璃化冷冻后妊娠及分娩可获得良好的临床结局^[13-14]，本研究26名患者共进行27个冻卵周期，其中19例患者行卵子解冻，217枚卵子解冻复苏后存活率为81.11%，这与Sole等^[15]报道989枚卵子玻璃化冷冻后复苏率85.6%的结果相似。卵子解冻复苏存活率仍明显低于胚胎解冻存活率，但卵子解冻后发育潜能似乎并未受影响，既往多项大样本研究表明^[16-18]，采用玻璃化冷冻后解冻的卵子其发育潜力、妊娠率、种植率及多胎妊娠率与新鲜卵子无明显差异，该结论在本研究中也被证实。但是与Sole在报道中冷冻卵子复苏后优质胚胎率与新鲜卵子相比无明显差异而言，本研究中优质胚胎为36.73%（36/98），低于其研究中49.8%的优质胚胎率，这可能与本研究中大部分为男方因素行卵子冷冻，男方精液质量较差导致优质胚胎率降低，也提示卵子玻璃化冷冻技术可能会对卵母细胞造成不同程度的损伤。既往动物实验研究表明^[19-20]，卵子玻璃化冷冻可能造成DNA甲基化及组蛋白的修饰，从而引起表观遗传学的异常，有可能影响子代长期的健康状况。关于人卵子的相关研究目前较少，De Munck等^[21]对人卵子玻璃化冷冻的安全性进行了小样本研究（n= 27），研究通过比较减数分裂染色体的分离、胚胎发育动力学及DNA甲基化水平3个方面，表明玻璃化冷冻卵子与新鲜卵子在3个方面未见明显差异，初步证实了人卵子玻璃化冷冻的安全性。

本研究中卵子保存时限最短为1月，最长为47月，未发现冻存时间延长对卵子存活率有明显影响。理论上，卵子同胚胎一样，可在液氮中无限期冻存。关于卵子冻存时限的研究尚为数不多，且多为针对慢速冷冻方法的研究。Parmegiani等^[22]对慢速冷冻方法研究显示不同冷冻时限（1~3月、4~6月、7~48月）不影响卵子解冻存活率、受精率及妊娠结局，但该研究最长冷冻时限为48月，更长冷冻时限的报道多为个案报道，Urquiza等^[23]报道1例患者卵子慢速冷冻14年后解冻行ICSI，成功获得活产，这是迄今为止卵子冷冻保存时限最长的文献报道。本研究中卵子采用玻璃化冷冻方法最长冷冻期限为47月，未发现长期冻存对卵子产生不利影响，因此关于卵子玻璃化冷冻的最佳冻存时限仍需要进一步研究探索。

年龄是影响临床妊娠结局的重要因素。本研究将卵子玻璃化冷冻复苏后行ICSI治疗的19例患者根据年龄分为两组，< 35岁组患者卵子解冻复苏率、临床妊娠率及活产率明显高于≥35岁组，≥35岁患者无1例活产，但临床妊娠率及活产率的差异亦有可能由男方因素所致，两组卵子存活率、正常受精率、卵裂率及优质胚胎率可能因样本量较小未见明显统计学差异。随年龄增加，卵子解冻后胚胎发育潜能及临床妊娠结局呈逐渐下降的趋势，提示对于 < 35岁患者进行卵子冷冻可获得较满意的结局。这与Cil等的荟萃分析^[24]结果一致，该研究表明不论冷冻方法和技术如何，卵母细胞冷冻保存的各项指标均有随年龄增加逐渐下降的趋势。Ubaldi等^[25]回归分析显示卵子解冻后持续妊娠率与不孕因素、卵巢刺激方案及获卵数均无相关性，女性年龄是影响卵子玻璃化冷冻临床结局的唯一因素，因此国际上建议作为生育力保存行卵子冻存的女性年龄应≤35~37岁^[26-27]。

本研究共有8例患者获得临床妊娠，其中5例获临床分娩（3例分娩单活胎，2例分娩双活胎），妊娠期及后续新生儿随访未见明显异常。关于卵子玻璃化冷冻复苏后受精及胚胎移植后妊娠分娩子代的安全性，意大利一项随访了2152例冷冻卵子出生婴儿和辅助生殖技术妊娠分娩婴儿的报道显示，两组出生婴儿先天畸形发生率相似^[28]。关于新鲜卵子及冷冻卵子获妊娠分娩的研究发现两者在围产期并发症及出生胎儿先天性异常发生率方面均无显著差异^[29-30]，但目前仍缺乏对出生子代长期随访的数据。对于冷冻卵子出生后胎儿的长期健康状况，仍需要多中心、大样本的前瞻性研究追踪和随访。

综上所述，卵子玻璃化冷冻可作为不孕夫妻取卵当日因男方因素不能提供精子患者的临床补救措施，且能够获得与新鲜卵子相似的妊娠结局。年龄与新鲜卵子临床妊娠活产率的关系的大数据表明年龄是影响活产率的重要因素之一，故为保障和提高临床妊娠率，建议女性或患者卵子冻存的年龄应≤35岁。我们需要进一步学习和探索卵子冻存和解冻受精等环节的诸多问题，以推进卵子冻存的深入研究和推广应用，并减少高龄卵子生育带来的诸多负面影响。

Biographies

折晶，在读博士研究生，E-mail: zxrzjj8@163.com

张俊，在读硕士研究生，E-mail: 3121636zj@i.smu.edu.cn

Funding Statement

国家自然科学基金（81671524）；国家重点研发计划（2017YFC1001103）；广东省省级科技计划（2016A020218009）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81671524)