B细胞连接蛋白的结构、功能及其在B细胞相关疾病发展中的作用

Abstract

B细胞连接蛋白，是B细胞受体通路的关键接头蛋白。B细胞连接蛋白通过自身的结构特性及蛋白互作网络参与调控PLC-γ的活性和Ras通路激活，在B细胞受体信号转导中发挥重要作用，广泛参与调控B细胞的增殖、分化、凋亡及信号传导等过程，并与过敏性疾病、多发性硬化症、染色体组非整倍体、无丙种球蛋白血症、B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的发生发展密切相关。本文对B细胞连接蛋白的结构、生物学功能及其在B细胞相关疾病中的作用进行综述：B细胞连接蛋白可与多个效应蛋白协作，激活B细胞受体信号通路，从而影响着B细胞的发育成熟及功能调节；B细胞连接蛋白发生功能性突变，会破坏B细胞稳态并影响B细胞发育成熟，从而导致B细胞相关疾病的发生。全面总结B细胞连接蛋白的生物学功能不仅有助于了解B细胞相关疾病的发生机制，也有望将B细胞连接蛋白作为相关疾病的治疗靶标提供新思路和突破口。

B细胞连接蛋白（BLNK）又称SLP-65或BASH，典型的BLNK的基本结构包括N-末端亮氨酸拉链，其后是“酸性”区域，富含脯氨酸和关键区域Src同源结构域2（SH2）^[1]，亮氨酸拉链因其卷曲螺旋的特性，能与膜蛋白相互作用，使BLNK定位于质膜。BLNK具有多个受体酪氨酸激酶磷酸化位点，磷酸化的BLNK可以招募多种效应蛋白（包括Grb2、Sos、PLCγ和Nck），进而活化PLC-γ2、Ras和Rac1-JNK信号通路^[2-3]。然而关于BLNK结构的文献报道较少，对蛋白质亚基组成、折叠方式等方面的认识尚且不足，也是今后BLNK结构研究亟待解决的问题。

1. BLNK生物学作用

1.1. BLNK在B细胞发育过程中的作用

BLNK在祖B细胞向前B细胞转化的进程中起关键作用。BLNK在骨髓细胞发育早期表达水平较高，而随着B细胞的发育成熟其表达水平逐渐降低。BLNK调控祖B细胞的发育依赖于B细胞受体（BCR）通路的活化^[4]。BCR前体产生过程中发生μ重链基因重排、细胞表面标记物改变等事件，而BLNK在协调上述过程中发挥了巨大作用，其作为“衔接蛋白”将BCR相关激酶与多种信号蛋白连接起来，组成B细胞信号通路，影响着B细胞的发育成熟及功能调节。BCR前体和BLNK的缺陷，将导致B细胞的发育停滞在前B细胞阶段。研究表明，BLNK在整个B细胞个体发育过程中表达，并在B细胞发育周期中具有潜在的重要作用^[5]，而前B细胞分化为早期幼稚B细胞的过程同样需要BLNK的调控^[6]。

1.2. BLNK在BCR信号通路中作用

BCR是B细胞表面重要的免疫球蛋白。高水平BLNK表达量与BCR的活化密切相关^[7]。当BCR活化发生偶联后，激活至少3种蛋白酪氨酸激酶（包括Src-PTK、SYK、BTK）以调节下游因子的活化^[8-9]。BCR的ITAM基序与蛋白酪氨酸激酶结合，使蛋白酪氨酸激酶发生酪氨酸磷酸化，磷酸化的蛋白酪氨酸激酶继而与BLNK相互作用，促进BLNK的酪氨酸磷酸化。磷酸化的BLNK可以招募下游的多个效应蛋白，激活相应信号通路（图 1）。BLNK的活性对BCR信号通路的关闭同样重要：激酶PI3K介导了下游AKT/PKB的激活，从而引起BTK（S51/T495）和SYK（S295/S297）的丝氨酸/苏氨酸位点磷酸化；同时，AKT和HPK1共同使BLNK的S285和T152发生磷酸化，导致BLNK蛋白发生泛素化降解，从而终止了BCR信号通路的传递^[10-11]。

1.

BLNK在BCR信号通路中的作用机制

Mechanism of BLNK in the BCR signaling pathway.

除了BCR通路外，BLNK的活性还与NOTCH通路的激活密切相关。在正常B细胞中，NOTCH通路的激活可以增强BCR对胞外信号的应答并提高BLNK的表达水平；利用特异性抗体封闭NOTCH受体后，NOTCH和BCR通路的活性同时显著降低，进而影响了NOTCH通路相关转录调控分子的表达以及B细胞的成熟^[12]。

1.2.1. BLNK调控PLC-γ的活性

BLNK和PLC-γ是激活Ca²⁺信号介导的BCR信号通路的关键组分。BLNK通过结合SYK和BTK参与PLC-γ2分子的活化^[13]。过表达BLNK促进PLC-γ的酪氨酸磷酸化、受体介导的Ca²⁺应答及NFAT的转录活化；反之，BLNK显性负突变体抑制PLC-γ磷酸化、Ca²⁺应答及NFAT的转录活化进程。PLC-γ磷酸化的具体机制如下：BCR复合物耦联后激活下游的SYK，SYK使BLNK发生酪氨酸磷酸化并促进BLNK从细胞质向细胞膜跃迁，BLNK与PLC-γ的SH2结构域结合并促进其磷酸化，同时将PIP2切割成三磷酸肌醇和二酰基甘油，导致游离Ca²⁺浓度增加和PKC的活化。三磷酸肌醇与其受体在内质网结合后，向细胞质释放Ca²⁺，游离的Ca²⁺可激活丝氨酸/苏氨酸、磷酸酶、钙调磷酸酶等多种钙依赖性酶，从而使NFAT发生去磷酸化，促进NFAT从细胞质转移到细胞核参与转录调控，进而促进B细胞的活化^[14]。

E3泛素连接酶Cbl参与了SYK负调控PLC-γ2的生物学进程。BCR复合物的偶联活化能够促进Cbl的SH2结构域与BLNK结合，抑制BLNK与PLC-γ的结合，从而抑制PLC-γ2信号通路的激活；同时，Cbl的SH2结构域还能与SYK结合，抑制SYK的活化，进而抑制PLC-γ的磷酸化^[15]。受体酪氨酸激酶BTK也参与了PLC-γ2通路的激活。BTK的PH结构域与Ptd Ins-3, 4, 5-P3结合，促进BTK向细胞膜迁移，随后，BTK的SH2结构域与BLNK结合，使BLNK发生磷酸化，磷酸化的BLNK为BTK和PLC-γ提供结合位点，从而激活PLC-γ2^[16]。

1.2.2. BLNK参与Ras通路的激活

BLNK能够与Grb2的SH2及SH3结构域结合，使Grb2被招募到细胞膜上，同时Grb2的SH3结构域也能够与鸟苷释放蛋白Sos的脯氨酸富集区结合，Sos促进Ras释放GDP，结合GTP，使Ras蛋白由非性状态转变为活性状态；激活的Ras通过诱发酶促级联反应而激活MAPK/ERK信号通路^[17-18]。

2. BLNK与B细胞相关疾病

BLNK与B细胞相关疾病的发生发展关系极为密切，是B细胞病变与疾病发生过程中的关键作用分子，BLNK在B细胞成熟的不同阶段可能发生功能性突变，破坏B细胞稳态并导致B细胞发育成熟障碍，从而导致B细胞相关疾病的发生。近年来人们对BLNK在各种B细胞相关疾病中的作用机制进行了诸多探索。

2.1. BLNK与过敏性疾病的关系

IgE抗体的异常产生会导致过敏性疾病的发生。正常情况下，IgE⁺B细胞极少分化为记忆B细胞或长寿命浆细胞，因为它们只是短暂地参与生发中心的合成。但膜IgE可通过BLNK-JNK/p38通路而触发浆细胞的快速分化和凋亡，并且这种浆细胞分化不依赖抗原和细胞外环境，反应涉及多个IgE结构域和SYK、BTK等关键分子。在BLNK-/-小鼠中生发中心IgE⁺B细胞增殖的抑制解除和IgE过度产生的进程被延长^[19-20]。可见BLNK与过敏性疾病有密切关系。

2.2. BLNK与多发性硬化症的关系

多发性硬化症是中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病。研究表明，B淋巴细胞去除药物利妥昔单抗在治疗复发-缓解型多发性硬化症患者时具有良好的临床效果，证实B细胞参与多发性硬化症的发病进程，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化症的理想动物模型^[21]。金桂花等^[22]利用MOG 35-55多肽抗原配剂分别免疫野生型C57BL/6鼠与BLNK-/-鼠制备动物EAE模型，发现BLNK表达缺失可加重EAE反应，使EAE病程延长，提示BLNK参与了EAE的发生发展。该课题组还发现BLNK-/-鼠脾脏中调节性T细胞（Treg）数量较C57BL/6鼠显著减少^[22]，表明在EAE中，B细胞可能通过促进Treg的增殖维持其数量，使得Treg细胞发挥抑制EAE的作用，而BLNK的功能性缺失可能通过影响B细胞的生物学状态从而调节Treg在EAE中的作用。Ray等^[23]认为B细胞依靠GITR配体与Treg表面表达的GITR结合，从而促进EAE中Treg的增殖以维持调节免疫的稳态；该课题组检测了EAE小鼠血清中的抗MOG 35-55特异性抗体，发现无论在发病的高峰期还是恢复期，BLNK-/-小鼠血清中的MOG特异性IgM和IgG水平始终较低，表明BLNK缺失能够显著抑制MOG特异性抗体的产生；另外，在BLNK-/-小鼠中，B细胞分泌的IL-10明显降低，而IL-2的表达增高，由B细胞分泌的IL-10可抑制巨噬细胞和树突状细胞分泌IL-12，并抑制T细胞增殖及分化，从而抑制由Th1型T细胞介导的疾病，提示BLNK可能通过调控B细胞分泌的Th1/Th2细胞因子而影响EAE炎症反应。T细胞的活化、抗体的升高、细胞因子的异常调控等事件的共同作用导致了EAE的发生。

2.3. BLNK与染色体组非整倍体的关系

染色体组的非整倍体特性是恶性肿瘤的典型标志。非整倍体可能是恶性肿瘤发生的主要原因。BLNK通过调控胞质分裂，参与调控p53基因的转录活性，从而维护染色体的完整性，阻止非整倍体的产生。p53基因在50%以上的人类癌症中均发生突变，是肿瘤复杂信号传导网络中的中枢调控分子。p53基因是BLNK的转录调控靶点，过表达BLNK能够增强p53基因的表达，从而促进p53介导的DNA损伤修复；另一方面，外源BLNK的异位表达能够抑制细胞分裂，通过调控p53稳定性而维持基因组的完整性，从而阻止了非整倍体的发生^[24]。

2.4. BLNK与无丙种球蛋白血症的关系

先天性无丙种球蛋白血症是一种遗传性免疫系统紊乱疾病，主要由早期B细胞发育过程中的先天错误而导致机体无法正常产生抗体，临床表现为血液循环中B淋巴细胞数量减少，各类免疫球蛋白含量明显降低或缺乏。X-连锁无球蛋白血症是最主要的病理亚型，主要由BTK基因突变导致的B淋巴细胞分化发育障碍引起^[25]。临床上还发现与X-连锁无球蛋白血症临床表现相似，但无X染色体关联性的疾病，称为非Btk基因突变的先天性无丙种球蛋白血症，它的发生可能由BLNK基因突变引起。Lagresle等^[26]将BLNK基因进行移码突变，导致骨髓中的B细胞发育阻滞在pre-B1至pre-B2阶段。与健康B细胞相比，BLNK缺失突变细胞中的BLNK转录产物和蛋白质表达急剧减少，B淋巴细胞数量显著降低；另外，BLNK缺失突变还能破坏B细胞稳态并造成未成熟B细胞的异常扩增及B细胞分化发育异常，导致成熟B细胞和各种类型的免疫球蛋白缺乏^[27-28]。

2.5. BLNK与B淋巴细胞白血病的关系

前B细胞白血病与BCR前体信号通路密切相关，BLNK和BTK作为BCR前体信号通路的关键蛋白，是前B细胞白血病常见的治疗靶点^[29]。在BLNK-/-小鼠中，大约15%的小鼠在出生6月后自发形成前B细胞白血病。在免疫缺陷小鼠体内注射BLNK-/-的前B细胞，3~5周后可引发小鼠白血病。从机理上解释：BTK与BLNK发挥协同作用，终止BCR前体介导的前B细胞增殖扩张，从而阻止B细胞白血病的发生。

除了B细胞白血病，儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）细胞中也往往缺乏BLNK蛋白表达，BLNK的表达与ALL患者的预后显著相关，表明BLNK是B细胞相关肿瘤的关键抑癌基因^[30]。JAK3/STAT5信号通路的激活是驱动前B细胞白血病细胞增殖的主要动力，而该通路的激活在一定程度上需要IL-7的参与。在ALL中，BLNK可以抑制JAK3/STAT5通路活性及IL-7R的表达，JAK3活性的降低增强了细胞周期抑制基因p27kip1的表达水平，造成细胞周期阻滞，从而促进ALL细胞凋亡。BLNK对JAK3的抑制作用依赖于BLNK与JAK3的直接相互作用。BLNK的体细胞丢失和伴随的JAK3/STAT 5通路激活是导致B细胞白血病发生的主要原因^[31]。

PAX5基因是儿童和成人ALL体细胞突变最常见的基因，其突变频率在儿童和成人ALL体细胞中分别为38.9%和34%。PAX5是BLNK转录激活必需的转录因子。PAX5的融合蛋白（如PAX5-PML）已被证实对PAX5转录活性有明显的负调控作用，其在B淋巴细胞中可抑制PAX5基因的表达，导致BLNK的表达水平被选择性地抑制。Imoto等^[32]将PAX5-PML融合基因转入正常的小鼠祖B细胞中，导致细胞发育停滞在祖B细胞阶段，且小鼠在长时间饲养后可自发形成ALL。PAX5基因的突变抑制BLNK的表达，BLNK的选择性抑制对ALL的发生具有重要意义^[33]。

在慢性淋巴细胞白血病中，BLNK和CD5高表达，而二者在正常B或T细胞中不表达。BLNK和CD5是STAT 3磷酸化所必需的。敲低BLNK或CD5可显著降低慢性淋巴细胞白血病细胞中STAT 3的丝氨酸水平，可见BLNK是STAT 3磷酸化状态的重要调控因子^[34]。

2.6. BLNK与淋巴瘤的关系

致癌基因rel的持续性激活是许多肿瘤的标志事件之一。Gupta等^[35]通过微阵列分析发现v-rel和c-rel是淋巴瘤细胞的关键转录因子，rel与BLNK基因的上游启动子结合，可负调控关键BCR元件及BLNK的转录活性。v-rel和c-rel的转录调控作用及BLNK的功能性抑制是淋巴细胞恶性转化的重要因素，且两者在多种淋巴瘤中的表达呈显著负相关。在原发性纵膈大B细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中，c-rel蛋白发生明显的核积聚现象，导致BLNK及各种BCR通路信号分子表达下调；c-rel还可以诱导B细胞凋亡并增强B细胞肿瘤和其他肿瘤细胞对化疗的敏感性^[35]。该课题组还发现，BLNK的过表达强烈拮抗由v-rel引起的淋巴细胞恶性转化，提示BLNK可能通过负反馈调控v-rel及其下游通路发挥抑癌基因作用^[36]。

3. BLNK的研究前景

BLNK在BCR信号通路中发挥重要作用，通过多条信号通路的级联传递，最终影响特定基因的转录表达，参与B细胞的增殖、分化、凋亡等生物学进程。随着对BLNK的结构、功能及分子作用机制认识的不断深入，人们越来越意识到BLNK作用方式的多效性、复杂性和重要性。多项研究已证实由BLNK基因突变或缺失引起的B细胞功能紊乱可导致自身免疫性疾病的发生。因此，平衡BLNK的表达水平和维持B细胞功能稳定被认为是多种自身免疫性疾病的潜在治疗方向^[37]。BLNK在特定疾病中还可能以融合基因的方式发挥生物学作用。在费城染色体样急性淋巴细胞白血病中，检测到BLNK的5’端与DNTT基因发生融合，这种不常见的融合方式可能为研发靶向BLNK的功能性抑制剂提供新的思路^[38]。作者一直致力于BLNK在恶性肿瘤中的机制研究，目前已发现BLNK能够在体内和体外促进乳腺癌的增殖和转移（未发表），然而BLNK促进乳腺癌转移的作用靶点尚不清楚。最后，围绕BLNK的作用机制尚有一些问题亟待解决：BLNK如何影响B细胞的发育？BLNK在BCR信号通路中还有哪些未知的功能机制？BLNK如何影响B细胞相关疾病的发生发展？这些研究方向也将为自身免疫性疾病的治疗方案提供新的思路。

Biography

肖斌，博士，技师，E-mail: xiaobin2518@163.com

Funding Statement

军队后勤科研项目（CWH17C017）；广州市科技计划项目（201804010186）