AMPK调控不同强度电刺激引起的C2C12肌管线粒体氧化应激

Abstract

目的

研究不同时间电刺激模拟不同强度运动对C2C12肌管线粒体氧化应激水平的影响，并进一步探讨5′-磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信号通路在不同运动强度过程中所发挥的作用。

方法

C2C12肌管分化7 d后给予1次电刺激，刺激强度为15 V，30 ms，3 Hz，刺激时间分别为0、60、120和180 min。实验共4组，对照组(Con); 电刺激60 min组(E60)，120 min(E120)和180 min(E180)。细胞电刺激处理后于倒置显微镜观察肌管形态; 试剂盒法检测脂质过氧化产物(MDA)和活性氧自由基(ROS); 流式细胞技术检测线粒体ROS和膜电位; 免疫蛋白印迹法检测PGC1、AMPK-Ser485、AMPK-Thr172、AMPK的蛋白表达。

结果

不同时间的电刺激后，C2C12肌管的形态无显著差异; 电刺激60 min，MDA、ROS、AMPK-Ser485和AMPK-Thr172显著上升(P < 0.05);电刺激120 min和180 min，MDA、ROS、线粒体ROS、AMPK-Ser485、PGC1显著上升(P < 0.05)，线粒体膜电位显著下降(P < 0.05)。

结论

电刺激导致肌管氧化应激，且随时间延长，线粒体氧化应激程度越强烈，线粒体损伤越严重; AMPKThr172调控中长时间电刺激引起的氧化应激，而AMPK-Ser485及PGC1调控超长时间电刺激引起的氧化应激。

氧化应激是新陈代谢生成的活性氧(ROS)与机体的抗氧化系统之间失去平衡所导致的一系列应激反应。众所周知，适宜强度的运动可以延缓肌肉损伤及老化^[1-2]，而长时间力竭运动导致机体ROS水平急剧增加，加速肌肉的疲劳损伤及老化^[3]，严重影响运动员的成绩。从ROS的角度出发，通过调控ROS缓解氧化损伤可能是依赖运动处方进行抗疲劳损伤的重要方法之一，其中的机制值得我们去探讨。5′-磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)及过氧化物酶体增殖物激活受体辅助激活因子(PGC1)，对于细胞内的氧化应激水平具有重要的调节效应^[4-6]，能减少活性氧自由基的生成，改善细胞的生存环境^[7-8]。

运动训练可通过活化多种转录因子，增强肌肉代谢、提高运动能力^[9]。AMPK是一种由催化亚基α、β和γ三个亚基组成的异源三聚体蛋白。运动过程中，ROS引起AMPK异源三聚体的结构异变^[10]，但不同ROS水平导致AMPK的活化位点目前没有定论。AMPKα可通过亚基Thr172和Ser485磷酸化发挥调节作用，目前研究最多的是Thr172^[11-12]，而关于Ser485的研究相对较少^[13-14]。多数研究支持，骨骼肌中ROS的上升导致AMPKThr172磷酸化而激活AMPK^[15-17]，而AMPK-Ser485拮抗AMPK-Thr172^[18-19]。也有研究显示，AMPK-Ser485与Thr172变化一致，其活性的调节作用取决于实验环境和组织^[11]。因此，不同运动时间后，ROS与AMPKThr172及AMPK-Ser485的关系仍值得研究。

本文基于AMPKα的Thr172和Ser485，研究不同时间电刺激模拟不同强度运动对C2C12肌管线粒体氧化应激水平的影响，并进一步探讨AMPK信号通路在不同运动强度过程中所发挥的作用，以期对后续的运动处方开具提供更有力的分子靶标。C2C12细胞是小鼠骨骼肌肌母细胞株，分化的C2C12肌管可完成与在体骨骼肌细胞同样的收缩^[20]，同时避免了在体实验中其他器官、组织、细胞和激素的影响，能更实时的研究不同运动刺激对骨骼肌线粒体功能的影响，为运动损伤及恢复提供理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 研究材料

C2C12细胞(南方医科大学解剖教研室)；DMSO、DEPC、L-谷氨酰胺(sigma)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，MBCHEM公司)；胎牛血清(四季青)；DMEM培养基、马血清(GIBCO)；MDA、SOD试剂盒(建成)；AMPK、AMPK-Ser485、AMPK-Thr172、p-ULK(CST)，PGC1(abcam)；四甲基罗丹明甲酯TMRM染料(哈灵)。

1.2. 电刺激方案及分组

C2C12细胞常规培养，取生长状态好的细胞传代于35 cm的6孔板培养皿中，加入含10%胎牛血清的生长培养基培养，待细胞铺满皿底面积的90%以上时，加入含2%马血清的分化培养基分化。采用GRASS S48 Stimulator型电刺激器电刺激共分化7 d的C2C12肌管，强度为15 V，30 ms，3 Hz，电刺激时间为60、120、180 min。实验共4组，对照组(Con)；电刺激60 min组(E60)，120 min(E120)和180 min(E180)。

1.3. MDA和ROS检测

1.3.1. MDA测量

细胞收集后，按照试剂盒说明书加试剂，旋涡混匀器混匀。管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷却，3500 r/min离心10 min。移取200 μL至96T板中，532 nm处测定吸光度(A)。

1.3.2. ROS检测

细胞收集后悬浮于稀释好的DCFHDA(10 μmoL/L)中，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3~5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，荧光酶标仪实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

1.4. 免疫蛋白印迹

取处理后的6孔板，冰PBS冲洗2遍，每孔加入150μL的裂解抽提液比例，混合并匀浆。取上清2~4 μL，进行蛋白定量。取蛋白样品，加入上样缓冲液混匀，煮沸10 min后，上样，蛋白样品经8%或10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，运用湿转法将凝胶上的蛋白条带转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用3%的牛血清白蛋白(BSA)封闭PVDF膜，置于脱色摇床上，室温封闭2 h。加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜。所用抗体分别为AMPK、AMPKSer485、AMPK-Thr172、PGC1；TBST冲洗，二抗敷育2 h，TBST冲洗，常规显色曝光。

1.5. 流式细胞仪测定肌管线粒体ROS

按照线粒体提取试剂盒说明提取线粒体，加入荧光探针10 μmol DCFH-DA避光染色30 min；11 000 g离心，10 min，4 ℃，弃上清；翘液清洗2遍，每次11 000 g离心，10 min，4 ℃，弃上清；加入翘液重悬，上机检测线粒体ROS。

1.6. 流式细胞仪测定线粒体膜电位

加入荧光探针为100 nmol TMRM，避光染色30 min；11 000 g离心，10 min，4 ℃，弃上清；翘液清洗2遍，每次11 000 g离心，10 min，4 ℃，弃上清；加入翘液重悬，上机检测线粒体膜电位。

1.7. 数据统计处理

研究数据用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，各数据以均数±标准差表示，并用单因素方差分析进行各组间的比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 电刺激对C2C12肌管形态的影响

分化7 d的C2C12肌管作为电刺激对象，此时的肌管已分化完全，给予外源性刺激后具有在体性质的收缩能力。不同时间的电刺激后，10×的每组图片中均含有大量C2C12肌管；40×放大后，可清晰看到骨骼肌肌管的精细形态，但肉眼无法辨别其显著差异(图 1)。

1.

电刺激对C2C12肌管形态的影响

Effects of electrical stimulation on C2C12 tube phenotypes.

2.2. 电刺激对C2C12肌管MDA和ROS的影响

分化7 d的C2C12肌管给予一次模拟在体运动模式的电刺激，电刺激时间为60 min，120 min和180 min，分别模拟在体中等时间、长时间及力竭运动模式。收集各组肌管后，分别检测MDA和ROS水平，评价氧化应激水平。电刺激60 min ROS及MDA上升(P < 0.05)，电刺激120 min和180 min ROS及MDA亦上升(P < 0.01) (表 1)。

1.

电刺激对C2C12肌管MDA和ROS影响

Effect of electrical stimulations on MDA and ROS in C2C12 myotubes

	Control	E60	E120	E180
*P < 0.05; **P < 0.01 vs Control.
MDA (nmol/mL)	3.65±0.14	4.37±0.21*	4.95±0.09**	5.21±0.15**
ROS (U/mL)	21.7±12.4	88.2±16.7*	155.4±11.2**	147.4±10.9**

2.3. 电刺激对C2C12肌管线粒体ROS的影响

电刺激60 min线粒体ROS稍有上升，但无显著差异(P>0.05)；电刺激120 min的情况下线粒体ROS显著上升(P < 0.05)，电刺激180 min的情况下线粒体ROS稍有上升(图 2)。

2.

不同时间电刺激对C2C12肌管线粒体ROS影响

Effect of electrical stimulation on ROS in C2C12 myotubes (^*P < 0.05 vs Control). A: Flow cytometry of DCFH; B: Quantification of the results.

2.4. 电刺激对C2C12肌管线粒体膜电位的影响

电刺激60 min线粒体膜电位稍有下降，但无显著差异(P>0.05)；电刺激120 min的情况下线粒体膜电位下降(P < 0.05)，电刺激180 min的情况下线粒体膜电位亦下降(P < 0.01，图 3)。

3.

不同时间电刺激对C2C12肌管线粒体膜电位影响

Effect of electrical stimulation on TMRM in C2C12 myotubes (^*P < 0.05; ^**P < 0.01 vs Control). A: Flow cytometry of the TMRM; B: Quantification of the results.

2.5. 电刺激对C2C12肌管机制蛋白的影响

电刺激60 min和120 min可以显著激活AMPKSer485(P < 0.05)，而AMPK-Thr172仅在电刺激60 min显著活化(P < 0.01)，PGC1在电刺激120 min显著上升(P < 0.01，图 4)。

4.

不同时间电刺激后C2C12肌管AMPK表达

Expression of AMPK proteins in C2C12 myotube after electrical stimulations (^*P < 0.05; ^**P < 0.01 vs Control). A: Immunoblotting of the related proteins; B-E: Quantification of the results.

3. 讨论

众所周知，不同的运动方案引发不同的细胞和组织表型变化^[21-23]。耐力运动的特点是高摄氧量、低收缩力和线粒体依赖功能，运动可刺激骨骼肌线粒体生物发生，促进线粒体融合与分裂^[24-25]。此外，最近研究表明肌肉是运动中产生自由基的重要来源^[26-27]，因此耐力运动一定程度上提高了骨骼肌的氧化能力和线粒体功能^[28-30]。本研究发现，随着电刺激时间的延长，虽然肌管的形态没有显著变化，但是肌管MDA、ROS和线粒体ROS都有上升，线粒体膜电位逐渐下降。表明本实验的电刺激强度模拟的是有氧耐力运动，而且成功导致运动氧化应激和线粒体功能下降。但是，不同的电刺激时间导致的运动氧化应激和线粒体功能的变化不同，因此需要开展其机制研究。

我们的实验结果显示，电刺激60 min，AMPKSer485显著上升，AMPK-Thr172极显著上升；电刺激120 min，只有AMPK-Ser485极显著上升，电刺激180 min，两者均无变化。分析结果可知，首先，中等时间电刺激后，虽然两个AMPK两个位点都被磷酸化，但AMPKThr172磷酸化占绝对优势，此时AMPK处于活化状态。因此，C2C12肌管电刺激60 min后，即使ROS造成了显著的氧化应激，但线粒体膜电位虽有下降，并无显著差异。其次，中长时间电刺激后，AMPK-Ser485磷酸化占绝对优势，AMPK活化受到抑制，此时ROS造成的氧化应激引起明显的线粒体膜损伤。最后，超长时间电刺激后氧化应激水平较高，肌管损伤非常严重，AMPK两个位点的磷酸化均未显著上升。

综上所述，不同时间的电刺激后导致肌管不同程度的氧化应激，且随时间延长，氧化应激程度越强烈，线粒体损伤越严重。不同时间电刺激引起的氧化应激由AMPK不同位点的磷酸化调控，AMPK-Thr172调控中长时间电刺激引起的氧化应激，而AMPK-Ser485及PGC1调控超长时间电刺激引起的线粒体氧化应激。本文研究了不同强度的运动训练对ROS及AMPK信号通路的影响，探索最新的分子靶点，为调控骨骼肌细胞稳态及运动后肌肉疲劳损伤及老化。

Biography

董合玲，博士，讲师，E-mail: dongyihe914@163.com

Funding Statement

广东省自然科学基金(2017A030310178);中央高校教育教学改革专项(82617058)