苦参碱通过调控β-catenin信号通路抑制肝癌细胞干性

Abstract

目的

探讨苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性、细胞干性、β-catenin转录活性以及AKT/GSK3β/β-catenin信号通路的影响。

方法

应用MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞的克隆形成能力，荧光定量PCR分析0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞干性基因CD90、EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CD133 mRNA的表达水平，双荧光素酶报告基因检测0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞内β-catenin转录活性，Western blotting检测0 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞内AKT（蛋白激酶B）、GSK-3β和β-catenin及其相应磷酸化蛋白的表达水平。

结果

MTT实验结果显示，苦参碱呈时间-浓度依赖性地抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖，处理24、48、72 h对HepG2细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565、909.1 μg/mL，对Huh7细胞的半数抑制浓度依次为1355、781.8、612.8 μg/mL。苦参碱浓度依赖性地抑制肝癌细胞的克隆形成能力，400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞的克隆形成能力（P < 0.01，P < 0.001），200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞的克隆形成能力（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）。苦参碱能够显著肝癌细胞内CD90、EpCAM和CD133等干细胞标志物mRNA的表达，其中400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞中CD90（P < 0.01，P < 0.001）、EpCAM（P < 0.05，P < 0.01）和CD133（P < 0.01，P < 0.01）mRNA的表达，400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞中CD90（P < 0.01，P < 0.01）、EpCAM（P < 0.05，P < 0.01）和CD133（P < 0.01，P < 0.01）mRNA的表达。同时400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱显著抑制HepG2细胞（P < 0.001，P < 0.001）和Huh7细胞（P < 0.01，P < 0.001）内β-catenin的转录活性。研究结果显示400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著降低HepG2和Huh7细胞内β-catenin和磷酸化的AKT和GSK-3β蛋白水平，增加β-catenin的磷酸化水平。

结论

苦参碱可抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、克隆形成以及肝癌干性基因CD90、EpCAM和CD133的表达，其机制可能与抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路，从而降低β-catenin的转录活性有关。

肝细胞癌（HCC）是恶性程度最高的消化系统肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤前列^[1]。研究发现，包括肝癌在内的大部分肿瘤都具有异质性，肿瘤中部分细胞亚群具有干细胞样特征——较强的自我更新能力、侵袭能力、耐药性和可能存在的多潜能分化能力。这群细胞被称为肿瘤干细胞（CSCs）或肿瘤起始细胞（TICs）^[2]。肿瘤干细胞与肿瘤复发、转移以及耐药密切相关。在肝癌中分离到表达干性标志物CD90、EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CD133的肝癌干细胞，这些干性基因的表达受到上游Wnt/β-catenin等信号通路的调控^[3]。苦参碱是从天然豆科植物苦参根中分离提取的生物碱^[4]，具有抗病毒、免疫抑制、抗肿瘤、抗肝纤维化以及调节心律失常等药理作用^[5-9]。近年来，临床上将苦参碱与其它化疗药物联合试用于肿瘤的治疗，并取得一定的疗效^[10-11]。有研究报道，苦参碱抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和自噬，抗肿瘤血管生成等^[12-14]。但其具体作用机制尚未明确。我们以往的研究发现，苦参碱具有抑制肝癌Hep3B细胞生长和β-catenin转录活性的作用，本研究旨在探讨苦参碱对肝癌细胞干性的影响，并从Wnt/β-catenin信号通路探讨其作用机制，为临床应用苦参碱防治肝癌转移复发提供实验和理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 细胞株

人肝癌HepG2细胞株购自美国典型培养物中心（ATCC），人肝癌Huh7细胞株购买于中国科学院细胞库。

1.1.2. 药物与试剂

苦参碱注射液（广州白云山明兴制药有限公司）；DMEM高糖细胞培养基（Gibco）；MTT（Sigma）；PBS（博士德）；二甲基亚砜（Sigma）；4%多聚甲醛（Biosharp）；结晶紫（远航化工厂）；RIPA裂解液（康为世纪）；蛋白酶抑制剂（康为世纪），磷酸酶抑制剂（康为世纪），Pierce BCA Protein Assay Kit试剂盒（Thermo Scientific）；一抗AKT，P- AKT，GSK3β，P- GSK3β，β- catenin，P-β- catenin（Cell signaling technology）；二抗（碧云天）；Immobilon ECL发光液（弗德），荧光素酶质粒TOP^Flash和FOP^Flash（Upstate），pRL-TK（Promega)，双荧光素酶报告系统（Promega），Lipofectamin 2000（Invitrogen），SYBR^® Premix Ex TaqTM II试剂盒（Takara），RT-PCR逆转录试剂盒（Takara）。

1.2. 方法

1.2.1. MTT法检测细胞增殖活性

取生长状态良好并处于对数生长期的人肝癌HepG2和Huh7细胞，吸弃培养液，用胰酶消化后制备单细胞悬液，根据2.5×10³/孔的细胞密度接种于96孔板，各组设置3个复孔。待细胞过夜贴壁稳定生长后，吸弃培养基，孔内加入含有不同浓度梯度苦参碱（0、200、400、800、1 600 μg/mL）的培养液。并于苦参碱处理24、48、72 h后加入终浓度为0.5 mg/mL MTT溶液，放入CO₂培养箱继续孵育4 h。吸弃培养液，加入150 μL二甲基亚砜，震荡10 min至甲臢结晶完全溶解，在多功能酶标仪检测吸光度A_{490 nm}。并根据公式计算苦参碱对肝癌细胞生长的抑制率，并用Prism 5.0软件计算IC₅₀。细胞生长抑制率按以下公式计算：抑制率%=（1- A_处理组/A_对照组）×100%。

1.2.2. 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取生长状态良好并处于对数生长期的人肝癌HepG2和Huh7细胞，吸弃培养液，用胰酶消化后制备单细胞悬液，以3× 10²/孔的细胞密度接种于6孔板中，呈十字型摇晃均匀。待细胞过夜贴壁稳定生长后，吸弃培养基，孔内加入含有不同浓度梯度苦参碱（0、200、400、800 μg/mL）的培养液。待苦参碱处理48 h后，换成不含药的完全培养液，继续培养至出现肉眼可见克隆斑。吸弃板中培养液，用PBS清洗2次后加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞，10 min后吸弃固定液，加入1 mL 0.5%结晶紫染色10 min后流水冲洗多余染液，晾干后对板内克隆斑进行拍照和计数。根据如下公式计算各组的细胞克隆形成率：克隆形成率%=（克隆形成数/接种细胞数）×100%。

1.2.3. qRT-PCR检测肝癌细胞干性标志基因表达

取生长状态良好并处于对数生长期的人肝癌HepG2和Huh7细胞制备单细胞悬液，以1×10⁵/孔的细胞密度接种于6孔板中，待细胞过夜贴壁稳定生长后，吸弃培养基，孔内加入含有不同浓度梯度苦参碱（0、200、400、800 μg/mL）的培养液。苦参碱处理48 h根据总RNA提取试剂盒对肝癌细胞内总RNA提取，采用逆转录试剂盒对提取的RNA样本进行逆转录成cDNA，逆转录结束后，运用实时荧光定量PCR反应对cDNA进行扩增检测目的基因的mRNA表达水平。引物：CD133：F：5'- TTCTATGCTGTGTCCTGGGGC-3'；R：5'-TTGTTG GTGCAAGCTCTTCAAGGT-3'；CD90：F：5'-AAGTG TCACTGGCATGTATACAC-3'；R：5'-GGTCCTTTTCA CCAGCAA-3'；EpCAM：F：5'-GTGCTGGTGTGTGAA CACTG-3'；R：5'-AGCCACATCAGCTATGTCCA-3'。根据qRT-PCR检测结果，采用2^-△△Ct方法对数据进行定量，它表示处理中目的基因表达水平是对照组的2^-△△Ct倍。

△△Ct＝（Ct_目的基因－Ct_内参基因）_处理组-（Ct_目的基因-Ct_内参基因）_对照组。

1.2.4. 双荧光素酶报告基因系统检测转录活性

取生长状态良好并处于对数生长期的人肝癌HepG2和Huh7细胞制备单细胞悬液，以3×10³/孔的细胞密度接种于96孔板中，每组设置3个副孔。待细胞过夜贴壁稳定生长后，使用Lipofectamin 2000将荧光素酶质粒TOP^Flash，FOP^Flash和pRL-TK（双荧光素酶报告系统内参）共转染进人肝癌HepG2和Huh7细胞内。孵育24 h后，分别加入含浓度梯度苦参碱（0、400、800 μg/mL）继续孵育24 h，根据双荧光素酶系统操作说明裂解细胞，并在多功能酶标仪下测定发光值。实验数据在经内参校正后采用TOP/FOP数值表征β-catenin的转录活性。以对照组均值为100%计，其他处理组与对照组的比值为相对转录活性。

1.2.5. Western blotting法检测蛋白表达水平

人肝癌HepG2和Huh7细胞经不同浓度梯度的含苦参碱（0、400、800 μg/mL）培养液处理48 h后，于冰上用RIPA裂解液进行裂解，12 000 r/min 4 ℃离心15 min后吸取上清液。采用Pierce BCA Protein Assay Kit试剂盒检测蛋白浓度，蛋白样品浓度采用上样缓冲液（5×）和稀释液将蛋白调整至所需浓度，接着将蛋白样品置于100 ℃金属浴中变性5 min。待蛋白样品冷却经10 % SDSPAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜。采用5 %BSA封闭1 h后，置于一抗中4 ℃孵育至12 h。用TBST洗膜3次后，在室温下用二抗孵育1 h，经TBST将二抗清洗后加ECL化学发光液于多功能成像系统下采集曝光图片。

1.3. 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件对实验结果进行统计分析并作图，多组间比较采用One way-ANOVA，数据以均值±标准差表示，P < 0.05认为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性的抑制作用

不同浓度药物（0、200、400、800和1600 μg/mL）处理24、48、72 h后，苦参碱呈时间-浓度依赖性地抑制人肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖活性（图 1）。在人肝癌HepG2和Huh7细胞中，浓度为400 μg/mL苦参碱作用48 h后即呈现显著的抗增殖作用，抑制率分别为（16.63±2.27）%和（23.27±1.11）%，苦参碱在24、48、72 h对HepG2细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565和909.1 μg/mL，对Huh7细胞的半数浓度依次为1355、781.8、612.8 μg/mL（表 1）。

1.

苦参碱对肝癌HepG2和Huh7细胞增殖的影响

Effects of matrine on proliferation of HepG2 and Huh7 cells (Mean±SD, n=3). Compared with control, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

1.

苦参碱抑制肝癌细胞增殖的IC₅₀

IC₅₀ of matrine in HCC cells

Incubation time with matine Time (h)	IC50 (μg/mL)
	HepG2	Huh7
24	2369	1355
48	1565	781.8
72	909.1	612.8

2.2. 苦参碱显著抑制肝癌HepG2和Huh7细胞克隆形成

MTT实验结果主要表征细胞活力，而细胞克隆形成实验则更准确表征细胞增殖能力和细胞干性。肿瘤干细胞往往具有较强的克隆形成能力。图 2显示，克隆斑的形成数量随苦参碱药物浓度增加而呈浓度依赖性减少，在HepG2细胞中，400 μg/mL和800 μg/mL苦参碱处理组的克隆形成率分别为（50.51 ± 5.736）%，（38.89±13.66）%，与0 μg/mL组相比较均具有统计学差异。在Huh7细胞内，200、400、800 μg/mL苦参碱处理组的克隆形成率分别为（64.20 ± 5.685）%，（53.09 ± 13.01）%，（16.05±8.553）%，与0 μg/mL组相比较均具有统计学差异。

2.

苦参碱对肝癌HepG2和Huh7细胞克隆形成能力的影响镜下观察（上）及统计学分析（下）

Effects of matrine on colony formation of HepG2 and Huh7 cells. Upper panel: Microscopic observation; Lower panel: Statistical analysis (Mean±SD, n=3). Compared with control, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

2.3. 苦参碱显著抑制肝癌HepG2和Huh7细胞内干性标志物CD90、EpCAM和CD133 mRNA的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，在肝癌HepG2和Huh7细胞，苦参碱能够呈浓度依赖性抑制肝癌细胞的中CD90、EpCAM和CD133等肿瘤干性标志物的表达（图 3）。其中400、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞中CD90（P < 0.01，P < 0.001）、EpCAM（P < 0.05，P < 0.01）和CD133（P < 0.01，P < 0.01）mRNA的表达，400、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞中CD90（P < 0.01，P < 0.01）、EpCAM（P < 0.05，P < 0.01）和CD133（P < 0.01，P < 0.01）mRNA的表达。

3.

苦参碱对肝癌HepG2和Huh7细胞中CD90、EpCAM和CD133 mRNA表达水平的影响

Effects of matrine on expressions of CD90, EpCAM and CD133 mRNA in HepG2 and Huh7 cells (Mean±SD, n=3).Compared with control, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

2.4. 苦参碱显著抑制肝癌HepG2和Huh7细胞内β-catenin的转录活性

为进一步探讨苦参碱抑制肝癌细胞干性的作用机制，采用双荧光素酶报告系统检测苦参碱对肝癌细胞β-catenin的转录活性的影响。在肝癌HepG2和Huh7细胞，苦参碱能够呈浓度依赖性抑制肝癌细胞内的β- catenin的转录活性，400 μg/mL的苦参碱对HepG2和Huh7细胞的抑制率分别为（24.74±4.682）%和（32.98± 3.871）%。800 μg/mL药物浓度处理时，HepG2和Huh7细胞内β-catenin的转录活性抑制率分别为（51.42 ± 5.256）%和（53.04±5.939）%（图 4）。

4.

苦参碱对肝癌HepG2和Huh7细胞内β-catenin转录活性的影响

Effects of matrine on transcriptional activity of β-catenin in HepG2 and Huh7 cells (Mean±SD, n=3). Compared with control, **P < 0.01, ***P < 0.001

2.5. 苦参碱对肝癌细胞内Wnt/β-catenin信号通路的影响

研究发现，400 μg/mL和800 μg/mL苦参碱处理48 h后，肝癌HepG2和Huh7细胞中磷酸化AKT（P-AKT）、磷酸化GSK-3β（P-GSK-3β）和β-catenin蛋白水平显著降低，同时磷酸化β-catenin（P-β-catenin）蛋白表达增加。

5.

苦参碱对肝癌HepG2和Huh7细胞中CD90、EpCAM和CD133 mRNA表达水平的影响

Effects of matrine on expressions of CD90, EpCAM and CD133 mRNA in HepG2 and Huh7 cells (Mean±SD, n=3).Compared with control, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

3. 讨论

肝细胞癌是复发率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，易于转移，对传统的化疗药和靶向药耐药，导致预后较差。研究发现，肝癌中存在着一群具有自我更新、多向分化、无限增殖潜能、及致瘤性等生物学特性的干细胞，特异性地表达CD90、EpCAM、CD133等干性基因，介导肿瘤细胞的异常增殖，转移和耐药^[15]。因此，从天然产物中筛选特异性抑制肝癌细胞干性的药物，应用于临床肝癌的治疗意义重大。苦参碱是从传统中药苦参根中提取出的主要生物碱，临床上具有抗肿瘤，抗炎等作用^[16-17]。研究报道，苦参碱能够抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的耐药等^[18]。我们的研究结果显示，苦参碱能够呈浓度-时间依赖性地抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖活性，并且显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力，表明苦参碱能够抑制肝癌细胞无限增殖的干性，进而发挥抗肿瘤作用。CD90、EpCAM、CD133是肝癌干细胞的特异性标志物，CD90是一细胞表面糖蛋白，附着在细胞膜的胞浆面，参与肿瘤干细胞的增殖分化、机体免疫反应、细胞因子释放等过程, 与肝癌干细胞的增殖分化，克隆形成密切相关^[19]。EpCAM是黏附分子家族成员之一，属于上皮细胞间黏附分子，在细胞发生癌变过程中发挥着关键作用，能够调控肿瘤干细胞的侵袭、增殖、分化等功能，也是一类特异性的肝癌干细胞标记物，研究发现EpCAM可以通过促进细胞增殖、免疫逃逸等机制促进肿瘤的发生发展^[20-21]。CD133也是肝癌干细胞的特异性表面标记物之一，在肝癌干细胞的增殖，侵袭和分化方面发挥重要作用^[22]。本研究发现苦参碱能够显著抑制CD90、EpCAM、CD133三个肝癌干性标志物的mRNA的表达，进一步提示苦参碱具有抑制肝癌细胞干性的作用。

Wnt/β-catenin信号通路被发现在大于40%的肝癌细胞中被激活，参与调控肿瘤细胞增殖、分化、转移及维持肝癌细胞干性^[23]。活化的β-catenin转录入核，能够促进CD90、EpCAM、CD133等干性基因的表达，继而诱导肿瘤细胞的转移和无限增殖^[24-27]。我们以往的研究曾发现，苦参碱抑制肝癌Hep3B细胞生长和β-catenin的转录活性，因此我们推测苦参碱抗肝癌细胞干性的作用与Wnt/β-catenin信号通路相关。在β-catenin信号通路未被激活时，GSK3β通常与APC、Axin形成复合物，将胞浆中的β-catenin进行磷酸化，从而促进其泛素化降解。而在生长旺盛的肝癌细胞中，GSK-3β可被上游活化的蛋白激酶AKT磷酸化，失去磷酸化β-catenin的作用，积累的β-catenin发生核转位^[28]。本研究显示，苦参碱能够显著抑制AKT和GSK-3β的磷酸化，同时增加β-catenin的磷酸化水平，降低β-catenin蛋白水平，表明苦参碱通过抑制AKT和GSK-3β磷酸化后，使GSK3β恢复磷酸化β-catenin的能力，从而促进β-catenin的磷酸化使其发生降解。荧光素酶报告基因结果显示苦参碱能够显著抑制肝癌细胞内β-catenin的转录活性，进一步表明苦参碱能够通过抑制肝癌细胞内β-catenin信号通路的激活，进而抑制β-catenin的转录活性和下游肝癌细胞干性基因的表达。那么，苦参碱作用的靶分子是什么？通过何种方式抑制AKT的磷酸化呢？AKT上游信号主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶的激活和雷帕霉素靶蛋白的活化两条途径^[29]，文献报道和我们实验曾发现苦参碱具有诱导肝癌细胞自噬的作用，提示药物可能抑制雷帕霉素靶蛋白的活化。在下一步的工作中，我们拟采用RNA干扰等实验方法进一步研究β-catenin信号通路对肝癌细胞干性的调控作用，阐明苦参碱的作用靶点。

综上所述，苦参碱通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化，继而干扰CD90、EpCAM、CD133等干性标志物的表达，从而削弱肝癌细胞无限增殖、分化等恶性生物学特性，发挥抗肿瘤作用。研究结果对临床应用苦参碱治疗肝细胞癌具有重要的意义。

Biography

戴美琴，硕士研究生，E-mail: 1191571995@qq.com

Funding Statement

广东省自然科学基金（2016A030313595）；广州市科技计划项目（201707010074）