CRISPR/Cas9文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用

Abstract

The CRISPR/Cas9 technology has developed rapidly in recent years with fast, simple and accurate editing functions to allow gene knockout, knock in, activation and interference. It has become a powerful genetic screening tool and been widely used in various models including cell lines, mice and zebrafish. The application of CRISPR system in constructing genome library for high-throughput screening is the main strategy for target gene research of diseases, especially neoplasms. Here we summarize the rationales and recent development of CRISPR/Cas9 library screening technology, the strategies for improving the off-target effects, the basic workflow of library screening and the application of this technology in tumor research.

癌症作为威胁人类健康及生命的严重疾病之一，其发生率和死亡率一直居高不下。其病因主要是肿瘤细胞基因组中的突变或遗传缺陷不断积累，引发肿瘤形成和促进肿瘤的发展演进。因此修复肿瘤细胞基因或者沉默特定蛋白表达成为研究肿瘤发生发展过程以及开拓肿瘤治疗的重要手段。近年来，高通量测序和生物信息学技术的极速发展，为精准医疗背景下的肿瘤研究提供大量基因学信息。而CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简便、易于设计等特点，可为肿瘤相关基因的功能学研究提供新方法、新思路，进而更好地服务临床诊疗。

CRISPR/Cas9技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计3~10条sgRNA，利用芯片一次合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，在适当的筛选条件下测试筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出候选基因^[1-3]。目前，科学家们已成功构建人源和鼠源全基因组文库且在日渐完善^[4-6]，未来CRISPR/Cas9高通量文库筛选技术将得到前所未有的发展和应用。

1. CRISPR/Cas9系统原理及发展历史

CRISPR/Cas9系统由Ⅱ型Cas9核酸酶和single guide RNA（sgRNA）组成。Cas9与sgRNA形成的复合体能识别带有PAM（protospacer adjacent motif）（NGG或NAG）信息的互补序列，继而对靶DNA进行特异性切割，通过细胞内的非同源性末端连接机制（nonhomologous end joining, NHEJ）和同源重组修复机制（homologous recombination, HDR）对形成断裂的DNA进行修复，导致基因部分序列的插入或缺失，最终实现基因的定向编辑^[7]。

日本生物学家首次在大肠杆菌中发现存在于iap序列下游29nt的串联间隔重复序列^[8]。研究者发现该序列在大约40%的细菌和90%的古生菌中广泛存在。Jansen等^[9]把这种串联重复序列正式命名为成簇间隔规律短回文重复序列（CRISPR）。Barrangou首次用实验证明CRISPR系统是细菌的一种适应性免疫系统^[10]。Doudna与Charpentier在此基础上对CRISPR/Cas9系统进行改造，使其具备基因修饰功能，从而使CRISPR/ Cas9成为继基因打靶技术、RNAi、ZFNs和TALENs后又一新兴基因编辑技术^[11]。张峰团队首次利用改造的CRISPR/Cas9系统在人类细胞和小鼠细胞中成功完成基因组定点编辑^[12]。南京大学用CRISPR系统敲除了小鼠EGFP基因，首次将CRISPR技术应用于哺乳动物^[13]。近几年CRISPR/Cas9基因编辑技术受到科研人员的普遍认可，在医药、工业、农业等领域得到大量推广，涵盖基因敲除、敲入、转录激活、转录抑制、RNA编辑、全基因组筛选等众多基因编辑方向。

2. CRISPR/Cas9技术的改进与应用

2.1. 拓展CRISPR/Cas9技术应用范围

国内外研究者近年来不断拓展CRISPR/Cas9技术的应用范围。加州大学研究人员首创利用CRISPR基因转录激活技术（CRISPRa）筛选影响T细胞免疫细胞发育的一种基因增强子，有助于解析自身免疫疾病的病理机制^[14]；Church研究组^[15]在小鼠体内构建hgRNACas9系统，利用遗传条形码来记录发育中小鼠胚胎干细胞分裂的过程，追溯小鼠体内的单细胞谱系来源；亓磊研究组研发出CRISPR-基因组组装（CRISPR-GO）技术，为可编程地研究大规模空间基因组组织和功能提供一个良好的平台^[16]。另有研究团队创造性应用CRISPR构建一种促进细胞内特定基因进化的平台EvolvR^[17]，这种技术开辟了无数的可能性，如有效地将废物转化为生物燃料的工程酵母，或开发新的人类疗法。通过不断革新和优化，CRISPR/Cas9技术将为功能生物学、生物技术和基因治疗等各领域带来新的契机。

2.2. 设计改造CRISPR/Cas9技术以降低脱靶效应

虽然CRISPR/Cas9技术优势显著，但其潜在的脱靶风险也影响着基因编辑技术的深入研究，为此研究人员努力通过设计改造Cas9蛋白结构和sgRNA序列等方法降低脱靶率。亓磊研究组首次将CRISPR改造为可干扰基因转录调控进程的强大工具，并命名为CRISPR基因转录干扰技术（CRISPRi）^[18]。CRISPRi技术将Cas9蛋白的核酸酶结构域突变，使Cas9失去核酸内切酶活性而保留DNA结合活性，形成灭活的dCas9，这样不需要NHEJ等细胞修复途径即可进行编辑，从而降低脱靶风险^[19]。除此之外，将CRISPR/Cas基因编辑酶与核酸脱氨编辑酶整合成一种新的碱基编辑系统（BE），可在单碱基水平对基因实现高效率的靶向编辑改造。如2018年上海科技大学研究人员开发出一系列基于人胞嘧啶脱氨酶APOBEC的新型普适碱基编辑器，其中基于人APOBEC3A（hA3A）的碱基编辑器可高效介导甲基化胞嘧啶mC到胸腺嘧啶T的编辑^[20]。围绕Cas9特异性和sgRNA设计的科学态势正迅速发展，但CRISPR编辑技术的脱靶率仍未完全消除。如何在实现高编辑效率的同时降低甚至消除脱靶效应，这将是未来研究者深入研究CRISPR/Cas9技术并开拓其临床应用亟待解决的问题。

3. CRISPR/Cas9高通量文库的筛选原理及其在肿瘤相关研究中的应用

3.1. CRISPR/Cas9文库筛选原理

用于高通量筛选文库的形式主要有阵列文库和混合文库两种。前者将单个或数个sgRNA列于芯片或多孔板中进行处理，每孔中的基因编辑序列已知；后者则是用计算机设计待筛选sgRNA文库并富集阳性克隆，随后转至宿主细胞以引入各种基因突变^[1]，最终通过高通量测序等方法获得结果。相比之下，混合文库筛选成本低、操作简单且可用于体内研究，能够更全面地覆盖全基因组，侵染的细胞可在长期培养后检测结果^[21]，因而CRISPR文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。其操作流程主要包括设计合成sgRNA文库、Cas9细胞系的构建、表型选择、高通量测序、生物信息学分析、候选基因和脱靶效应的验证等（图 1）。

1.

CRISPR/Cas9高通量筛选流程

CRISPR/Cas9 high-throughput screening flow chart.

3.1.1. sgRNA文库的设计与合成

对于高通量筛选，文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。全基因组文库通常包含超过10万个sgRNA，一方面可以识别更多感兴趣的基因，但另一方面也会耗费大量时间和金钱。而在由激酶或膜蛋白等构成的特定基因组文库中进行筛选更易实现每个sgRNA的高覆盖率，提高数据质量，因而将会是高通量筛选更好的选择。目前市面上已有各类sgRNA在线设计软件，如CRISPR-FOCUS、CHOPCHOP、CRISPR library designer（CLD）等，可根据需求选择合适的软件设计sgRNA文库，但需保证其较低的脱靶效率。

3.1.2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞

CRISPR/ Cas9高通量文库筛选方法中，最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。根据Cas9和sgRNA是否构建在同一慢病毒载体上可大致分为单载体系统和双载体系统。有研究者使用具有不同抗生素选择标记的单独病毒载体递送Cas9（lentiCas9-Blast）和sgRNA（lentiGuidePuro），使得LentiGuide-Puro的功能性病毒滴度与原始lentiCRISPRv1相比增加了约100倍^[5]。但也有研究者认为在sgRNA文库构建之前预先产生表达Cas9的细胞系，即双载体系统对于文库筛选是有利的。尽管双载体系统需要更长的制备时间，但他们发现单载体系统内Cas9核酸酶的表达可能会影响染色体上特定sgRNA序列介导的突变效率^[22]。

3.1.3. 阳性或阴性筛选

筛选工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略。根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力，经文库扰动后野生型细胞致死，仅有获得抗性的细胞存活。与阳性筛选不同，阴性筛选是通过比较不同筛选时间点的sgRNA丰度差，获得缺失的sgRNA，分析其所对应的基因，从而找出可能影响细胞生长的候选基因。

3.1.4. 高通量测序与生信分析

此外，利用生物信息学方法寻找候选基因，排除假阳性或假阴性筛选结果，对CRISPR高通量筛选研究结果的后期分析至关重要。从所选的细胞亚群中提取基因组DNA，DNA模板应足量以保证文库的丰度。在提取基因组DNA后对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，随后对这些区域进行高通量测序以量化它们的相对丰度^[22-23]。根据筛选前后的sgRNA相对丰度变化确定sgRNA是被富集还是消耗，从而确定基因型与表型之间的关系。利用生物信息学工具可通过评估同一基因中多个sgRNA的富集水平来确定某一基因是否在相同背景下显著富集。

3.1.5. 验证候选基因

用CRISPR/Cas9技术筛选出若干个候选基因后，需要通过一系列方法进行验证，从而鉴定出调控特定表型的功能基因。首先需分析其脱靶情况，若非靶标位点在外显子内可能导致假阳性结果。候选基因的进一步验证非常必要，使用CRISPR/Cas9技术进行单个基因敲除，通过筛选单克隆细胞构建候选基因敲除细胞系，在基因分型和免疫染色确认基因已被敲除后，检测候选基因敲除对病毒复制的影响，同时可通过遗传互补试验确定其作用是否由基因敲除所致^[24-25]。

3.2. CRISPR/Cas9高通量文库筛选技术在肿瘤相关研究中的应用

CRISPR/Cas9技术为科学家提供了一个强大的基因组改造工具，通过构建高通量文库筛选平台，可研究肿瘤发生发展的相关基因，筛选和研发肿瘤治疗药物，也可进行肿瘤免疫治疗等。

3.2.1. 运用CRISPR/Cas9高通量文库筛选肿瘤发生发展的相关基因

CRISPR/Cas9技术可通过构建sgRNA文库筛选维持肿瘤细胞生长发育的相关基因，从而针对这些靶基因进行肿瘤机制研究和治疗。Korkmaz等利用CRISPR/Cas9敲除技术分别在人BJ细胞和乳腺癌细胞中构建筛选文库，发现p53效应基因CDKN1A的结合增强子是永生化人体细胞中致癌基因诱导的衰老（OIS）所必需的元件，Erα效应基因CCND1的结合增强子是乳腺癌细胞生长发育的重要元件^[26]。为发现TP53野生型尤文肉瘤的特异靶点，有研究者使用CRISPR/ Cas9 GeCKO文库在尤文肉瘤细胞系中筛选出MDM2、MDM4、USP7和PPM1D 4种调节因子，并使用遗传和药理学方法验证这些靶标通过p53作用机制在尤文肉瘤中的依赖性^[27]。Chen等^[28]利用全基因组文库筛选揭示了EZH2在MYCN癌症基因扩增的神经母细胞瘤中的依赖性。

由于肝肿瘤的遗传异质性，如何识别肝肿瘤抑制因子或抑癌基因一直是个难题。麻省理工研究人员^[29]用含有67 000个sgRNA的mGeCKOa文库感染过表达MYC的p53缺失小鼠胚胎肝祖细胞，将转导的细胞皮下移植到裸鼠体内，筛选出Plxnb1、Flrt2和B9d1等肝肿瘤抑制因子，并通过MAPK验证了RAS信号。Zhu等^[30]通过构建配对指导RNA（paired- guide RNA, pgRNA）CRISPR文库对人肝癌细胞中的长非编码RNA进行高通量筛选。他们建立了靶向671个lncRNA、含12 472对gRNA的文库，通过筛选确定了51个可正向或负向调节癌细胞生长的长非编码RNA，并对其中9种进行了生物功能的验证。重庆医科大学实验室通过在SK-Hep1肝癌细胞系中建立AT富集作用域2（ARID2）基因敲除模型，发现ARID2通过靶向pRb-E2F信号通路抑制cyclinD1和cyclinE1的表达进而抑制肝癌细胞增殖，证实ARID2作为抑癌基因参与肝癌的发生和进程^[31]。另有研究人员筛选出NF1、TSC2、NF2、BIM和Plnb1这5个与肝癌生长密切相关的基因^[32]。

3.2.2. CRISPR/Cas9文库技术在肿瘤药物研发中的应用

CRISPR/Cas9文库技术也为癌症药物学研究提供了有力工具，可利用CRISPR系统建立精确的肿瘤细胞模型，揭示细胞机制并确定新的药物靶点，从而开发更高效且安全的肿瘤药物。如亓磊研究组借助CRISPR/ Cas9基因敲除技术筛选上千个基因突变组合，寻找可以选择性杀死癌细胞的突变，从而找到癌症的弱点^[33]。研究人员针对3种实验室细胞系（人宫颈癌细胞，肺癌细胞和胚胎肾细胞）中的73个基因，总共150 000种基因组合研发了这一新系统，结果证明，这种方法能揭示超过120种新的合成致死相互作用，给未来癌症药物的研究提供了一个新的方向。

Ryan等^[34]在胶质母细胞瘤（GBM）中开发出一种腺相关病毒（AAV）介导的CRISPR自体筛选。他们首先构建了一个包含288个sgRNA的小鼠肿瘤抑制因子（mTSG）文库，并通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子构建可编码Cre重组酶的AAVCRISPR载体，然后将经载体包装后的sgRNA注射到条件Rosa26- LSLCas9-GFP小鼠中，去观察星形胶质细胞中Cas9和GFP的条件表达。结果发现，Zc3h13或Pten的突变改变了Rb1突变体的基因表达谱，使得它们对替莫唑胺更具抗性，这给胶质瘤抑制剂体内研究提供了一个良好前景。Matthew等^[35]在RB1-/-小细胞肺癌（SCLC）细胞系中构建了包括9100个靶向1350个基因的sgRNA文库进行筛选，发现RB1-/- SCLC细胞系过度依赖与染色体分离相关的多种蛋白，如Aurora B激酶。在此基础上，他们发现在SCLC和其他RB1-/-癌症中，pRB缺失是提高Aurora B激酶抑制剂敏感性的预测标志物，为降低多种癌症的耐药性提供借鉴意义。荷兰研究团队使用CRISPR/Cas9 GeCKO文库在BRAF^V600E黑色素瘤细胞系中证明癌症药物成瘾由ERK2依赖的表型转换中继^[36]。

在癌症化疗中，BAX可能是某些细胞毒性药物作用的主要驱动因子^[37]。有研究者使用87 897个sgRNA，靶向19150个小鼠基因的文库感染稳定表达Cas9的mcl1（myeloid cell leukemia-1）缺陷小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），证实了VDAC2与BAX相互作用促进BAX介导细胞凋亡^[38]。VDAC2的突变或沉默可能是慢性淋巴细胞白血病药物——维奈托克耐药的潜在驱动因素。另外，为了寻找急性髓系白血病(AML)治疗的新靶点，研究人员使用全基因组的CRISPR/Cas9文库进行体内外筛查，确定了DCPS作为AML治疗的靶标基因，并阐明了pre-mRNA代谢途径。RG3039是一种最初用于治疗脊髓性肌萎缩症的DCPS抑制剂，通过诱导premRNA错接表现出抗白血病活性，因而下一步我们可以拓展其在AML治疗中的应用^[39]。

3.2.3. CRISPR/Cas9文库技术在肿瘤免疫治疗中的应用

近年来肿瘤免疫治疗因其显著疗效和创新性备受关注，而CRISPR/Cas9技术在肿瘤免疫治疗研究中也显示出广泛的应用前景。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）表达的变化会影响T细胞活化并帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸，导致T细胞治疗效果不理想。为解决PD-1检查点阻滞免疫疗法仅对少数肿瘤患者有效的问题，Manguso等^[40]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在免疫治疗小鼠体内进行筛选，测试了黑色素瘤细胞表达的2368个基因，以识别与检查点阻滞协同或引起耐药性的基因。最终发现干扰素-γ信号通路中的缺陷导致了对免疫疗法的抗性。Marian等^[41]使用全基因组CRISPR/Cas9筛选发现CMTM6蛋白是广泛癌细胞中PD-L1的关键调节因子，为PD-L1调节的生物学提供了新的见解，确定了这一免疫检查点中以前未被认识的主要调节因子，并突出了克服肿瘤细胞免疫逃避的新潜在治疗靶点。

体细胞基因突变可以改变癌细胞对基于T细胞的免疫疗法的脆弱性。美国研究人员使用包含123 000个sgRNA的CRISPR/Cas9文库筛选分析在肿瘤细胞中丧失损害CD8+T细胞效应器功能（EFT）的基因^[42]。他们将来自癌症基因组图谱的11 000个患者肿瘤中的EFT基因与细胞溶解活性相关联，然后在免疫治疗效果不显著的患者肿瘤中鉴定了APLNR的多种功能丧失突变。结果显示APLNR与JAK1相互作用，调节肿瘤中的干扰素-γ反应，其功能丧失降低了小鼠模型中过继细胞转移和检查点阻断免疫疗法的功效。总的来说，他们将EFT必需基因的丧失与癌症对免疫疗法的抗性或无应答性联系起来。除此之外，有研究团队使用基因组规模的CRISPR/Cas9筛选来鉴定肿瘤细胞对抗细胞毒性T细胞杀伤的机制^[43]他们证明了PBAF复合物可降低肿瘤细胞内干扰素-γ诱导基因的染色质可及性，从而增加对T细胞介导的细胞毒性的抗性，为临床免疫治疗提供机制性理解。

4. 总结与展望

CRISPR/Cas9技术作为一个强大的基因编辑工具, 凭借其制作简单、成本低、作用高效等优点广泛应用于细胞基因编辑和基因表达调控、基因敲除动物模型的构建、人类疾病动物模型的治疗研究等领域。而随着高通量文库筛选技术的建立，CRISPR/Cas9技术为研究肿瘤发生发展机制、研发抗癌药物以及肿瘤治疗等难题都提供了较好的解决方案。虽然CRISPR/Cas9技术存在较多优势，但高脱靶率、PAM序列的限制、转导效率低等局限性仍限制着它的应用前景。因此，对于CRISPR/ Cas9技术的运用主要应通过建立相应的人源化小鼠模型，以模拟人体疾病的发生和发展，并且在此基础上探索和研发有效的基因治疗手段，从而为相关疾病的后续药物开发和治疗提供重要的治疗方案和思路。当前来看，将基因编辑工具应用于人体之前必须有更低的CRISPR脱靶率和更先进的检测技术支持，以非常严谨的态度评估其中潜藏的各种风险，切不可急功近利。

基于CRISPR/Cas9技术的高通量文库筛选策略涉及多个过程，包括sgRNA的设计及合成、Cas9细胞系的构建、表型选择、高通量测序、生物信息学分析、候选基因和脱靶效应的验证等。CRISPR文库的构建流程和筛选效果方面，至少有3个方面可以进行提高：sgRNA的设计；sgRNA数量的优化；选择更合适的单克隆Cas9蛋白表达细胞。CRISPR/Cas9高通量筛选文库在哺乳动物细胞中的应用毫无疑问会为肿瘤等相关疾病机制的研究提供极大的帮助，我们可以预见，随着相关基础研究的深入，CRISPR/Cas9系统将在肿瘤个体化治疗方面得到更广阔的发展与应用。

Biography

雷婷，硕士研究生，E-mail: 20181126814@stu.gzucm.edu.cn

Funding Statement

国家自然科学基金（81802634）；广东省自然科学基金（2018A030310014）；军队后勤科研项目（CWH17C017）；广州市科技计划项目（201804010186）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81802634)