变异链球菌耐酸毒力因子质子移位膜ATP酶在龋病进展中的动态变化

Abstract

Objective

To observe the dynamic changes of membrane-bound proton-translocating ATPase (F-ATPase) in the development of dental caries, the expression of Streptococcus mutans F-ATPase under different pH concentrations and during the development of dental caries is analyzed.

Methods

Streptococcus mutans cultured under different pH (pH4.0–7.0) concentrations and containing 5% glucose and no glucose containing BHI were collected. RNA was extracted. Subsequently, F-ATPase gene was detected using real-time polymerase chain reaction. Male Wistar rats were divided randomly into caries group and control group. The rats in the caries group were fed caries feed and 5% glucose water, whereas those of control group were fed normal feed. Total RNA was extracted from plaque samples, which were collected from rats' oral cavity every two weeks. F-ATPase gene was detected by real-time PCR. In the 11th week, the upper and lower jaw bone specimens of rats were taken, and molar caries damage assessed.

Results

The expression of F-ATPase in the caries group was higher than that in the control group (P<0.05). In addition, the gene was expressed highest in pH5.0 and the lowest in pH4.0 (P<0.05). 2) The expression of F-ATPase progressively increased during the caries development in both groups; expression in the caries group was higher than that in control group (P<0.05).

Conclusion

Acid-resisting viru-lence factor F-ATPase is related closely with the incidence and development of dental caries.

耐酸性是细菌在致龋过程中最重要的毒力表现，细菌产酸后若不能耐酸，则细菌就不能继续生存、代谢。Bender等[1]研究发现细菌的耐酸性与细菌膜对质子的透过性有关，变异链球菌的耐酸性主要依赖于细胞膜上的质子移位膜ATP酶（membrane-bound proton-translocating ATPase，F-ATPase），通过F-ATPase将质子泵出胞内，使胞内pH（pHi）高于胞外pH（pHo），即维持了一个跨膜梯度ΔpH（pHi-pHo），保持胞内pH接近中性，保护胞浆中与糖酵解相关酶的活性，使菌细胞在低pH的苛刻环境中仍能产酸、生存并最终导致龋病的发生[2]–[3]。可见，F-ATPase是变异链球菌致龋菌耐酸的引擎和马达，与龋病的发生密切相关。

目前尚缺乏关于变异链球菌耐酸毒力因子F-ATPase在龋病发生发展过程中的研究，为了进一步了解F-ATPase在龋病进展中的变化，本研究建立致龋动物模型纵向研究F-ATPase基因在龋病进展中的表达变化，比较F-ATPase基因在不同pH环境的表达，以评价生物膜中耐酸毒力因子F-ATPase与龋病发生的关系。

1. 材料和方法

1.1. 实验菌株及动物

变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）标准株UA159由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。18 d龄的雄性Wistar大鼠购于重庆医科大学实验动物中心，许可证编号为SYXK（渝）2012-0001。

1.2. 主要试剂及仪器

BHI培养基（OXOID公司，英国），YJ-875型超净工作台（苏州市华宇净化设备有限公司），FQ-聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Bio-Rad公司，美国） ，200型分光光度计（Thermo Fisher公司，美国），pH计（Mettler Toledo公司，瑞士），Bio-Rad电泳仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.3. 引物设计

根据GenBank报道的变异链球菌F-ATPase β亚基基因[4]序列及16sRNA基因序列（GenBank accession number NC_004350），采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物。F-ATPase上游引物 5′-CGGATGCGTGTTGCTCTTACTG-3′，下游引物5′-GGCTGATAACCAACGGCTGATG-3′；16sRNA上游引物5′-TGGAACTGAGACACGGTCCA-3′，下游引物5′-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCG-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4. 不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达

将变异链球菌标准株UA159复苏，培养24 h，3 000 r·min⁻¹离心15 min，弃上清，用无菌生理盐水于紫外分光光度计540 nm处制备成吸光度为1.0的菌悬液备用。以0.5为间隔配制pH4.0~7.0系列的含5%葡萄糖和不含葡萄糖的BHI液体培养基。取变异链球菌悬液，按菌液与BHI液体培养基1∶10的体积比接种细菌，37 °C厌氧培养至16 h指数生长期，每个样品一式3份，3 000 r·min⁻¹离心15 min收集菌体，通过RNAiso Plus（Takara公司，日本）提取RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增反应总体积为20 µL，含SYBR Premix Ex Taq（2x）10 µL（包括DNA Taq酶、Mg²⁺、dNTP、SYBR GreenⅠ荧光染料和Buffer缓冲液）、上下游引物各0.5 µL、模板cDNA 2 µL，加灭菌去离子水至20 µL。反应循环参数设置为三步法PCR扩增标准程序：95 °C预变性3 min，95 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，共40个循环。在延伸阶段收集荧光信号，循环结束后附加溶解曲线分析：95 °C 15 s，62 °C 23 s，95 °C 15 s。实验重复3次，取均值，收集实验数据，测定各样品的循环阈值（Ct值），通过2^−ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

1.5. 龋病动物模型的建立及变异链球菌F-ATPase基因表达检测

12只18 d龄的雄性Wistar大鼠，随机分为2组，致龋组6只，喂养致龋饲料2 000号及5%葡萄糖水；对照组6只，喂养普通饲料。从第1周开始每2周采集菌斑样本（共6次），采集样本前2 h大鼠禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，以棉拭子采集磨牙面及颊舌（颊腭）面的菌斑，置于含硫乙醇酸盐传送液的离心管中洗脱，将样本收集于离心管中，提取混合菌斑RNA，进行逆转录和实时荧光定量PCR（引物及反应体系同上）。结果取均值，通过2^−ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

第11周时处死大鼠，取上下颌骨标本，染色，根据Keyes经典评分方法[5]对磨牙进行龋损评定，将龋损分为4级。E级：仅限于釉质；Ds级：累及釉质及牙本质外层1/4以内；Dm级：累及牙本质厚度的1/4至3/4；Dx级：累及超过牙本质厚度的3/4，甚至达牙本质全层。

1.6. 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差表示，多组之间比较采用单因素方差分析。

2. 结果

2.1. 变异链球菌F-ATPase基因及16sRNA内参基因

F-ATPase基因和16sRNA内参基因经常规PCR都能得到特异性扩增，2%凝胶电泳显示各基因各实验组中的cDNA产物均为单一条带（图1、2），条带片段大小与引物预期扩增片段大小一致。

图 1. F-ATPase基因扩增产物电泳图.

Fig 1 Electrophoresis of products of F-ATPase gene

1、2为F-ATPase基因扩增产物；M为Marker DL2000。

图 2. 16sRNA基因扩增产物电泳图.

Fig 2 Electrophoresis of products of 16sRNA gene

1~3为16sRNA基因扩增产物；M为Marker DL2000。

2.2. 不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达

不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达见图3。实验结果显示，1）在pH5.0时F-ATPase基因的表达最高，然后依次是pH5.5、6.0、6.5，7.0，4.5，最低的是pH4.0（P<0.05）；2）5%葡萄糖浓度下F-ATPase的表达高于不含葡萄糖（P<0.05）。

图 3. 不同pH和葡萄糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达.

Fig 3 F-ATPase expression under different pH and glucose concentration

2.3. 大鼠磨牙龋病动物模型的建立

11周后处死大鼠，取磨牙进行Keyes评分，结果见图4和表1。实验成功构建了龋病动物模型，各组Wistar大鼠磨牙均有不同程度的龋损发生，但是龋损发生的严重程度、累及范围不尽相同。致龋组龋齿计分明显高于对照组，且龋坏病变的程度要高于对照组。对照组牙齿的损坏最小，仅达到牙本质中层，致龋组龋损多数达牙本质中层，其次是牙本质深层。

图 4. 大鼠龋齿 体视显微镜 × 30.

Fig 4 The caries of rats stereomicroscope × 30

从左到右依次为E、Ds、Dm、Dx级龋损（箭头示）。

表 1. 各组大鼠磨牙龋齿Keyes评分.

Tab 1 The Keyes score in the molar teeth of each rat group

组别	E	Ds	Dm	Dx
致龋组	9.91±2.91**	12.11±2.95**	7.30±2.63*	5.53±1.25*
对照组	22.06±3.25	5.17±2.28	2.51±1.08	0.00±0.00

注：2组比较，*P<0.05；**P<0.01。

2.4. 龋病过程中F-ATPase基因的表达

龋病过程中各组F-ATPase基因的表达见表2。在龋病的发生发展过程中，随时间的推移各组F-ATPase基因的表达逐渐增强，致龋组表达高于对照组（P<0.05），第9周后，致龋组增长程度有一定下降，对照组的表达下降。

表 2. 龋病过程中各组F-ATPase基因的表达.

Tab 2 F-ATPase expression in each group during the de velopment of caries

组别	2−ΔΔCt
	1周	3周	5周	7周	9周	11周
致龋组	1.00±0.00	2.63±0.31	6.30±0.17	7.36±0.32	8.59±0.23	9.08±0.15
对照组	1.00±0.00	1.64±0.03	1.86±0.60	3.05±0.20	2.05±0.24	2.64±0.53

3. 讨论

F-ATPase具有调节胞浆pH以及决定菌细胞耐酸性的生物学特性。细菌细胞的胞外质子向胞内扩散降低胞内pH，影响对酸敏感的糖酵解的活性，为了最大程度的发挥糖酵解的活性，致龋菌通过细胞膜和F-ATPase抵抗胞浆的酸化，F-ATPase将质子泵出细胞从而调节pH，使致龋菌在低pH值环境下仍能进行糖酵解[6]–[7]。

早期龋病研究表明，环境pH和糖在龋病的发生发展过程中起着重要的作用，而口腔原位环境是一个复杂且动态变化的环境，获取大鼠致龋过程中牙菌斑pH较困难，为了研究高糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达与pH之间的关系，本研究设计了体外实验，结果显示，变异链球菌在5%葡萄糖浓度下耐酸毒力因子F-ATPase表达高于不含葡萄糖环境。研究[8]表明，在高糖浓度下，变异链球菌的黏附毒力、产酸毒力、耐酸毒力及耐药毒力均高于低糖或无糖环境下，由此推测，高糖浓度下变异链球菌致龋能力上调。当外界环境中有充足的糖源时，变异链球菌能迅速合成胞外多糖，伴随着产酸耐酸能力的增强，环境中pH迅速下降，变异链球菌在酸压力状态下通过上调耐酸因子F-ATPase表达来维持生存代谢。Kuhnert等[4]对浮游状态的变异链球菌F-ATPase基因表达研究证实，在pH5.0时mRNA的表达水平大约是pH7.0时的2倍。研究[9]发现，当培养基中的pH由8.0下降至5.0时，变异链球菌的F-ATPase活性提高4倍，从而增强了其质子泵作用。本实验研究也证实，高糖浓度下变异链球菌F-ATPase基因的表达高于无糖或低糖环境，F-ATPase的表达在pH5.0时最高，pH4.0时最低，pH5.0到7.0时F-ATPase表达缓慢降低，在pH5.0以下时F-ATPase的表达急剧减少。学者[10]研究对比了干酪乳杆菌、变异链球菌和血链球菌3种耐酸性分别为高、中、低的口腔耐酸菌膜结合F-ATPase的pH活性范围，发现其最适pH值分别为5.5、6.0和7.0，证明了细菌的相对耐酸性与F-ATPase的活性和最适pH值有关，活性越大，最适pH值越低。在酸性环境中排除胞内多余H⁺能力越强，因而越耐酸。可见在最适pH以内，F-ATPase的表达随pH降低而升高，而当pH降低至5.0以下时，酶活性超过最适pH使F-ATPase的表达量下降，同时强酸的环境压力可以使细菌合成ATP不足，并破坏细胞质内的蛋白结构使之死亡[11]。通过对大肠杆菌的研究，Kasimoglu等[12]发现，F-ATPase的表达量在转录和翻译水平的调控是多层次的，其中细菌的生长率在F-ATPase的产生和表达中起着比较重要的作用，大量细菌死亡也会导致生物膜中F-ATPase的表达量大大减少。同样在pH5.0以下的环境，随着变异链球菌的大量死亡，F-ATPase的基因表达在高糖和无糖环境中差异较小。

龋齿Keyes评分结果显示，致龋组龋齿计分明显高于对照组，且龋坏病变的程度要高于对照组，证明本实验龋齿模型的建立成功。实验中所使用的致龋饲料为高糖饲料，大鼠牙菌斑长期暴露在高糖的环境中，致龋菌有足够的底物产酸，造成牙菌斑内pH持续下降，在龋病发生发展过程中，致龋组和对照组F-ATPase表达均逐渐增强，致龋组表达高于对照组，第9周后，致龋组增长程度有一定下降，对照组的表达有一定下降。在实验过程中第5周时大鼠龋坏开始出现，在龋坏启动前期，变异链球菌等致龋菌大量产酸，使菌斑内pH达到脱矿临界值pH5.0~5.5。F-ATPase是一种应激蛋白，当外界环境pH下降时，变异链球菌F-ATPase基因表达上调，从而合成更多的F-ATPase蛋白以排除更多的氢离子维持细菌的生存，当更多的氢离子排到外环境时，环境中的pH继续下降酸蚀牙齿致龋。当龋病发展到第9周时，牙菌斑内微生物已经形成一个稳定的动态平衡状态，随着唾液蛋白等的中和缓冲作用，牙菌斑内pH值上升[13]，F-ATPase表达下调。学者[14]分离临床牙菌斑中变异链球菌，结果表明高龋牙菌斑变异链球菌分离株黏附、产酸和耐酸能力高于无龋牙菌斑分离株。本实验中致龋组耐酸因子表达亦高于对照组。对照组大鼠使用的普通饲料内碳水化合物含量较低，大鼠本身的口腔自洁能力较强，唾液分泌较多，对菌斑内pH缓冲能力强，使菌斑pH维持在一个稳定的范围，F-ATPase的表达也维持在一个稳定的范围。

本文对变异链球菌耐酸毒力因子F-ATPase在不同pH中的基因表达进行了研究，并建立了大鼠致龋模型，结果显示，变异链球菌F-ATPase在pH5.0时表达最高，致龋组大鼠在龋病发展过程中F-ATPase表达上调，提示耐酸毒力因子F-ATPase在釉质脱矿及龋病的形成中发挥着重要的作用。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（31371473）；重庆市卫生局医学科研计划（2012-2-129）；重庆市卫生局医学科研计划重点项目（2011-1-062）；重庆市渝北区科技项目（2011）

Supported by: Natural Science Foundation of China (31371473); Medical Scientific Research Plan of Chongqing Municipal Health Bureau (2012-2-129); Key Program for Medical Scientific Research Plan of Chongqing Municipal Health Bureau (2011-1-062); Scientific and Technical Program of Chongqing Yubei District (2011).