口腔中过氧化氢的来源及在微生态平衡中的作用

Abstract

过氧化氢（H₂O₂）作为口腔中一种重要的抑菌物质，在口腔微生态平衡中发挥着重要作用。在口腔龈上菌斑定植的先锋菌中，约有80%细菌属于口腔链球菌属，这些口腔链球菌可以利用不同的氧化酶合成H₂O₂，同时H₂O₂可通过抑制对H₂O₂敏感的微生物参与菌间竞争拮抗，使氧耐受菌得以存活，从而调节生物膜的发展过程；H₂O₂还可通过影响微生物细胞外DNA的释放和感受态细胞的形成进而影响基因的水平转移，调节生物膜对口腔环境的适应能力；同时口腔微生物也可通过一系列机制耐受H₂O₂。此外，H₂O₂在微生物与宿主的关系中也发挥着重要作用。本文就口腔中H₂O₂的来源及其在口腔微生态平衡的作用两方面的研究进展进行综述。

口腔是一个复杂的微生态系统，过氧化氢（H₂O₂）是这个复杂生态系中一种重要的非特异性抗菌物质。H₂O₂可由乳杆菌和牙菌斑早期定植的链球菌产生，也可来源于宿主，在调控微生态平衡中发挥重要作用。H₂O₂可通过抑制对其敏感的微生物参与微生物间的竞争拮抗，使得对H₂O₂较为耐受的细菌获得竞争优势，从而在生物膜形成过程中，特别是在生物膜形成初期发挥重要的菌群调节作用。H₂O₂可通过介导细胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）的释放，参与细菌间基因的水平转移[1]，影响生物膜对口腔复杂环境的适应能力；口腔内微生物也可通过一系列耐受机制减少H₂O₂对自身的伤害[2]–[3]。此外，H₂O₂在微生物和宿主的交互关系中也发挥着重要作用[4]–[5]。本文就口腔中H₂O₂的来源及其在口腔微生态中的作用进行综述。

1. 口腔中H₂O₂的来源

口腔中的H₂O₂主要来源于细菌和宿主[6]。乳杆菌和口腔链球菌很早就被发现可以产生H₂O₂[7]–[8]。定性和定量研究[9]–[12]发现，口腔链球菌、缓症链球菌、表兄链球菌、血链球菌、戈登链球菌、寡发酵链球菌、副血链球菌等均能产生H₂O₂。这些链球菌均可以从人口腔牙菌斑中分离，且在牙菌斑中具有较高丰度[13]。体外实验[8]–[9],[11]表明，细菌H₂O₂的产生与其培养环境条件密切相关。口腔细菌主要依赖丙酮酸氧化酶[14]、乳酸氧化酶[15]、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶[16]和L-氨基酸氧化酶[17]等途径来产H₂O₂。

1.1. 丙酮酸氧化酶途径

血链球菌和戈登链球菌依赖丙酮酸氧化酶产生H₂O₂，该酶由spxB基因编码，可催化丙酮酸盐、无机磷酸盐和氧分子生成H₂O₂[14],[18]。研究者通过构建血链球菌和戈登链球菌的spxB基因的突变株和spxB基因的补偿菌株，并比较了野生株、spxB基因突变株及spxB基因补偿株与变异链球菌的竞争关系，证实spxB基因编码丙酮酸氧化酶合成H₂O₂是血链球菌和戈登链球菌与变异链球菌细菌间相互竞争的重要分子机制[14]。

血链球菌和戈登链球菌H₂O₂的产生受细菌生长环境影响和自身相关基因的调控。Barnard等[11]系统研究了外环境因素对戈登链球菌H₂O₂产生的影响，结果发现，培养基中葡萄糖和蔗糖、金属离子、pH、细菌生长期和氧分压均会对戈登链球菌H₂O₂合成造成显著影响。当培养基中蔗糖、葡萄糖含量有限时（0.1 mmol·L⁻¹左右），戈登链球菌产生H₂O₂和乳酸的能力相当，而当培养基中蔗糖和葡萄糖较为富足时，H₂O₂合成显著减少。由于口腔中的各种碳源代谢底物有限，戈登链球菌为了获取有限的生存空间和营养，可能通过产生H₂O₂来抑制其他H₂O₂敏感菌的生长，进而在生物膜群落中获得生长优势。Zheng等[19]发现，戈登链球菌中的分解代谢物控制蛋白CcpA可结合到spxB的启动子，抑制spxB基因表达，从而调控戈登链球菌H₂O₂的合成。

血链球菌H₂O₂的合成也受到一系列基因的调控。Zheng等[20]研究发现，血链球菌分解代谢物控制蛋白CcpA同样能调控spxB的表达，血链球菌ccpA突变株spxB表达量较野生株上调约6倍，提示血链球菌CcpA也可通过抑制spxB基因的表达调控H₂O₂的产生。与戈登链球菌不同的是，血链球菌spxB的表达受培养基中葡萄糖含量的影响并不显著，推测血链球菌CcpA蛋白依赖抑制作用受到其他代谢物（例如辅脱氢酶Ⅱ）的控制。Chen等[21]通过突变血链球菌全局性调控因子编码基因spxA1和spxA2，研究了这两个基因对血链球菌H₂O₂产生的影响。研究发现，spxA1突变株H₂O₂产量显著减少，spxA1补偿株H₂O₂的产生约为野生株的80%，但spxA2突变株H₂O₂的产量与野生株相比无明显差异，提示血链球菌的全局性调控因子SpxA1参与控制spxB的表达，而spxA2对该细菌H₂O₂的产生无明显影响。Chen等[22]另一研究表明，血链球菌ackA、spxR和tpk三个基因的突变株与野生株相比，产H₂O₂明显减少。ackA和spxR的突变株中spxB的表达量减少而tpk的突变株中spxB的表达量增多，推测ackA和spxR可能为spxB表达的正调节基因，而tpk为spxB表达的辅因子。Zhu等[23]设计spxB通用引物对口腔菌斑spxB的动态表达进行定量检测，结果发现，个体菌斑中spxB的表达量随时间的改变相对稳定，提示spxB在口腔菌斑中具有功能性作用。

1.2. 乳酸氧化酶途径

寡发酵链球菌除可通过丙酮酸氧化酶合成H₂O₂外[15]，还可通过乳酸氧化酶参与H₂O₂的合成。Tong等[10]发现，寡发酵链球菌可通过乳酸氧化酶利用变异链球菌产生的乳酸合成H₂O₂。在细菌生长的不同周期，主要负责合成H₂O₂的基因不同。丙酮酸氧化酶主要负责细菌生长潜伏期和对数期H₂O₂的产生，而乳酸氧化酶主要负责细菌生长平台期H₂O₂的合成。

1.3. NADH氧化酶和L-氨基酸氧化酶途径

Higuchi等[16]在变异链球菌耐氧菌株NCIB11723中分离纯化获得了可产生H₂O₂的NADH氧化酶Nox-1。该酶由4个相对分子质量约为5.6×10⁴的亚基组成，黄素腺嘌呤二核苷酸可促进该酶H₂O₂合成活性。Tong等[17]发现，寡发酵链球菌乳酸氧化酶Lox突变株在蛋白胨富集时对变异链球菌仍具有显著抑制作用。进一步体外研究发现，氨基酸氧化酶LAAO可通过7种氨基酸产生H₂O₂，该蛋白编码基因aaoSo突变株在上述氨基酸存在条件下也不产生H₂O₂，证实寡发酵链球菌还可通过氨基酸氧化酶LAAO合成H₂O₂。

1.4. 宿主来源的H₂O₂

H₂O₂是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的一种[24]。宿主来源的H₂O₂可来自众多途径。线粒体可通过呼吸作用产生ROS，包括H₂O₂[25]–[27]。细胞内的清除系统有效地保护宿主免受ROS造成的伤害，其中产生的H₂O₂可能不会离开黏膜细胞，但这个途径产生的H₂O₂的量大到足以在口腔微生态中发挥作用[5]。H₂O₂产生的另一个途径来自巨噬细胞的氧化爆发。ROS的稳定产生（包括H₂O₂）是巨噬细胞氧化爆发的一部分，巨噬细胞产生的ROS是针对巨噬细胞外对宿主有侵害的病原菌，因此可以自由扩散到病原菌的附近[28]。但有研究[29]–[30]表明，个体巨噬细胞的含量处于一个逐日变化的过程，因此由巨噬细胞产生的H₂O₂量很难确定。Geiszt等[31]发现了另一种宿主产H₂O₂的途径，他们发现表达双氧化酶2的唾液腺细胞能持续地给唾液供应H₂O₂，并且产生的H₂O₂能直接随着唾液进入到口腔中，这可能是唾液中H₂O₂的宿主来源的最主要途径。

2. H₂O₂在口腔中的生物学作用

2.1. H₂O₂对生物膜的调节作用

H₂O₂可在牙菌斑生物膜形成初期影响微生物的早期定植。细菌的初始黏附在生物膜形成过程中具有重要作用。在初始黏附时，链球菌是主要的早期定植菌，通过特异性表面蛋白与唾液中蛋白结合，黏附定植于牙齿表面[32]。链球菌本身的表面蛋白也为其他口腔细菌提供了黏附和聚集的位点[33]。因此，初始黏附的细菌（主要是链球菌）为生物膜的成熟奠定了基础。临床研究发现，血链球菌与低龋风险相关[34]–[35]；寡发酵链球菌与龋病发生呈负相关[36]，提示在生物膜形成初期，早期黏附的链球菌可通过产生H₂O₂抑制龋病的机会致病菌（如变异链球菌）的生长和定植，对早期生物膜健康发展具有重要意义。

H₂O₂可通过对微生物的杀伤作用在生物膜形成过程中调节生物膜的组成。在生物膜形成过程中，细菌间的距离是一个重要因素[37]。Liu等[38]通过测量距戈登链球菌生物膜不同距离H₂O₂的浓度发现，在距生物膜表面100 µm处H₂O₂浓度为1.4 mmol·L⁻¹，而在距离生物膜表面200 µm处H₂O₂的浓度为0.4 mmol·L⁻¹。1.4 mmol·L⁻¹是一个可以抑制H₂O₂敏感细菌的浓度，提示细菌产生的H₂O₂主要作用于那些与其相距较近的细菌。生物膜形成过程中H₂O₂浓度梯度的存在提示H₂O₂可通过对不同H₂O₂敏感性的微生物进行筛选，调节生物膜的组成。H₂O₂可穿过细菌细胞膜，对细菌的杀伤作用机制包括破坏细菌的酶活性或直接氧化细菌大分子（蛋白质和DNA）[39]。H₂O₂的氧自由基可与Fe²⁺发生反应，破坏对酶活性进行调控的铁硫簇[4Fe-4S]结构[40]。此外，细菌细胞内H₂O₂的积累会导致在精氨酸、赖氨酸、脯氨酸及苏氨酸残基的侧链中引入羰基引起不可逆的蛋白质羰基化，介导蛋白质的靶向降解[41]–[43]。

口腔细菌可以通过产生H₂O₂影响细菌eDNA的释放和细菌感受态的形成，从而影响基因的水平转移，进而调节生物膜对口腔多变环境的适应能力。口腔细菌为适应多变的口腔环境进化出了一系列的应对措施，包括基因的水平转移[1],[44]–[45]。接合、转导和转化是微生物基因水平转移的3种形式[46]。转化是处于感受态的细菌获取eDNA进行DNA同源交换的过程[47]。通过同源交换，细菌可以获取新的基因适应环境（如抗性基因、代谢相关基因等），同时也可修复突变的基因以维持其遗传稳定性[48]。细菌eDNA的释放依赖胞外细菌素、胞壁酸水解酶、胞内细菌素和H₂O₂等途径[49]。Kreth等[14]发现，戈登链球菌和血链球菌染色体DNA的释放与H₂O₂产生密切相关，SpxB缺陷株H₂O₂产生减少，染色体DNA的释放也相应减少。Itzek等[50]研究发现，戈登链球菌在厌氧环境下H₂O₂合成降低，其染色体DNA的释放也减少；在厌氧条件下加入H₂O₂会导致DNA的释放增加。尽管H₂O₂导致细菌DNA释放的具体机制尚不清楚，但该研究指出H₂O₂并不是通过介导细菌裂解进而促使DNA的释放。细菌H₂O₂的产生也伴随着细菌感受态的产生[50]–[51]，可以推测细菌在感知到H₂O₂所介导的DNA损伤后，可通过一些未知的分子机制释放DNA并形成感受态细胞，通过转化修复基因损伤与突变。

口腔微生物能通过一系列机制减少H₂O₂的损害。部分口腔细菌能利用过氧化氢酶减少H₂O₂对其的伤害。“戈登链球菌和内氏放线菌”是口腔细菌相互作用的经典研究模型，戈登链球菌可产生H₂O₂抑制内氏放线菌[52]–[53]。值得注意的是，戈登链球菌不能产生过氧化氢酶缓解H₂O₂对自身的伤害。Jakubovics等[3],[53]发现，内氏放线菌可通过自身过氧化氢酶不断消耗H₂O₂，从而减少H₂O₂对自身和戈登链球菌的伤害。另有研究表明，口腔细菌中的很多基因与耐受H₂O₂密切相关。“血链球菌和变异链球菌”以及“戈登链球菌和变异链球菌”是经典的口腔相互竞争研究模型，血链球菌和戈登链球菌主要产生H₂O₂抑制变异链球菌，而变异链球菌可产生变链素抑制血链球菌和戈登链球菌[14],[54]–[55]。Xu等[2]分别观察了血链球菌和戈登链球菌dps、trxB和sodA三个基因突变株对H₂O₂的耐受情况，发现血链球菌和戈登链球菌Dps突变株对H₂O₂极为敏感；血链球菌的TrxB的突变株和戈登链球菌SodA突变株对H₂O₂的敏感也显著增加；而血链球菌SodA和戈登链球菌TrxB突变株对H₂O₂的耐受无明显变化，提示戈登链球菌Dps和SodA及血链球菌Dsp和TrxB在相关细菌耐受H₂O₂过程中发挥了重要作用。另外，该研究还发现戈登链球菌比血链球菌更耐受H₂O₂，推测戈登链球菌在牙菌斑中的丰度较低，因此需要更强的耐受力进而在牙菌斑中获得生长优势。Zheng等[56]发现，与野生株相比，变异链球菌谷胱甘肽合成酶基因缺失株对H₂O₂更敏感；进一步通过血链球菌和变异链球菌双菌种实验证明谷胱甘肽合成酶在变异链球菌耐受H₂O₂过程中有重要作用。此外，产H₂O₂细菌为了减少H₂O₂对自身的伤害，可通过Mn²⁺代替[4Fe-4S]结构中的Fe²⁺，减少细胞内依赖铁硫簇调控活性的蛋白质[57]–[58]。

2.2. H₂O₂在微生物与宿主交互关系中的作用

H₂O₂参与了微生物与宿主之间的交互作用。口腔微生物与宿主口腔细胞相互接近，微生物与宿主间存在频繁的交互作用。微生物可产生对宿主有毒害作用的H₂O₂，对宿主造成损害。Ramsey等[59]发现，戈登链球菌产生的H₂O₂诱导伴放线菌嗜血菌表达基因katA和apiA，促使伴放线菌嗜血菌逃脱宿主的免疫系统。Okahashi等[60]发现，血链球菌可产生H₂O₂导致人类巨噬细胞死亡，抑制血链球菌ROS的产生可有效减少血链球菌对巨噬细胞的毒害作用。Okahashi等[61]进一步研究了口腔链球菌SpxB对人类巨噬细胞的作用，阐明了口腔链球菌产生H₂O₂导致人类巨噬细胞死亡的机制。Okahashi等[4]还发现，口腔链球菌产生的H₂O₂可诱导宿主上皮细胞白细胞介素-6的表达，引起上皮细胞死亡。宿主细胞也能通过合成H₂O₂，起到杀菌或化学屏障的作用[28],[62]。例如巨噬细胞针对病原菌的氧化爆发过程产生大量的ROS（包括H₂O₂），可杀灭病原菌或将病原菌屏蔽在由H₂O₂组成的化学屏障外，进而保护宿主。有意思的是，细菌还可以通过产生H₂O₂减少条件致病菌对宿主的侵害，乳杆菌可以通过产生H₂O₂抑制白假丝酵母菌对上皮细胞的黏附[63]。

在口腔中，生物膜中的微生物持续处于“战争与和平”的状态，致病菌与宿主之间也时刻展开着“斗争”。微生物可通过一系列途径产生H₂O₂，限制有限生存资源内的竞争对手，并采取措施减少H₂O₂对自身的损害。H₂O₂是研究产H₂O₂菌株与对H₂O₂敏感菌间交互关系的良好切入口。H₂O₂在微生物与宿主间的关系中也发挥着重要的调节作用。系统研究H₂O₂在口腔微生态中的作用，揭示H₂O₂在维持口腔微生态平衡中的更多功能，有利于更好地理解口腔微生态系统。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81170959，81200782，81430011，81371135）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81170959, 81200782, 81430011, 81371135).