S100A9在糖尿病大鼠牙周组织中的表达及其作用研究

Abstract

目的

研究S100A9蛋白在糖尿病大鼠牙周组织中的表达，探讨其在糖尿病诱发的牙周病变中可能的作用机制。

方法

本实验通过对SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）构建糖尿病大鼠模型，通过苏木精-伊红（HE）染色观察糖尿病大鼠牙周结构的变化，免疫组织化学染色观察糖尿病大鼠牙周组织中S100A9的表达与分布，同时检测其配体Toll受体4（TLR4）和核转录因子κB（NF-κB）/p-P65蛋白的表达。通过分析上述蛋白的表达规律，探讨S100A9蛋白在糖尿病诱发的牙周病变中的作用机制。

结果

糖尿病大鼠的牙槽骨骨小梁结构稀疏，硬骨板消失；免疫组织化学染色显示牙周膜、牙槽骨及牙龈上皮中S100A9的表达水平比对照组明显上调，TLR4在牙槽骨、牙周膜、牙龈中的表达水平相较于对照组也显著增强；p-P65在对照组中没表达，但在糖尿病组中牙周膜和牙槽骨中呈阳性表达。

结论

糖尿病导致大鼠牙周组织结构病变，其原因可能与S100A9介导的TLR4和NF-κB信号通路的活化有关。

糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，主要的病理生理基础为两种，胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗。牙周炎同样属于多发高发的慢性疾病，是一类由细菌引起的慢性牙周感染，导致牙周组织破坏、牙槽骨吸收、牙周袋内形成溃疡等症状的疾病。糖尿病患者出现牙周炎的概率比正常人要高出3~5倍。研究[1]发现糖尿病会导致因牙周微生物群引起的过度炎性反应，使牙周组织修复功能受损，进而导致牙周组织的进一步破坏。牙周炎也会影响糖尿病患者的血糖调控机制[2]，促发糖尿病的多种并发症发生，但两者间的相互关系尚未完全明确。

S100A9是S100蛋白家族的一员，在体内可和S100A8形成异源二聚体，S100A9自身也能形成同源二聚体，临床中大多数炎症患者血清中S100A9及其同源二聚体和形成的异源二聚体的表达量都呈明显的升高[3]。S100A9和S100A8结合形成的异源二聚体是S100A9在体内最稳定的生理结构[4]，有推测S100A9的生理活性形态是在和S100A8结合后，也有研究[5]发现S100A8/A9二聚体可调控细胞的凋亡，且具有一定的抗菌能力[6]。然而，目前就S100A9在糖尿病导致的牙周病变中的表达和作用机制的研究甚少。

S100A9蛋白功能多样，可高亲和性地结合Ca²⁺、Zn²⁺等离子，参与细胞迁移、骨髓细胞成熟[7]、酪蛋白激酶抑制、免疫调节等生物学过程[8]。该蛋白主要表达于中性粒细胞和单核细胞的胞质中，少量表达于细胞核、细胞骨架和质膜上。体内S100A9大概分为分泌型和胞内型两种，胞内主要以钙离子依赖的方式调节细胞活性，分泌型S100A9蛋白则位于胞外通过结合晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end products receptor，RAGE）和Toll受体（Toll-like receptor，TLR）发挥生物学功能。研究[9]发现S100A9蛋白通过RAGE作用于P38、P42/44和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路，以激活核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）进而导致一系列的生物学反应。本课题旨在研究分泌型S100A9蛋白在糖尿病大鼠牙周组织中的高表达和牙周组织病变的关联，以及S100A9蛋白对TLR、NF-κB信号通路的作用。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂

S100A9（稀释比例为1︰200，Thermo公司，美国），TLR4（稀释比例为1︰200，Abcam公司，美国），p-P65（稀释比例为1︰200，Santa Cruz公司，美国），链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司，美国）。

1.2. 方法

1.2.1. 糖尿病大鼠模型建立

选取8周龄雄性SD大鼠30只，体重250~300 g，随机选取20只作为糖尿病模型组（实验组），10只为对照组。现配0.1 mol·L⁻¹ pH为4.5的柠檬酸缓冲液溶解STZ，22 µm孔径滤器过滤除菌，注射用量以60 mg·kg⁻¹体重为准，腹腔注射一次；正常对照组以0.1 mol·L⁻¹柠檬酸缓冲液作为对照。在腹腔给药前12 h严格禁食，给药后可自由取食。模型组分别在给药48 h、1周后取尾静脉血测定血糖，血糖值≥16.5 mmol·L⁻¹视为造模成功。此后每周检测血糖，饲养过程中一旦发现血糖恢复正常者或死亡者均视为造模失败。按照标准实验动物规定饲养。

1.2.2. 组织固定和切片制作

对照组和实验组大鼠在以STZ注射12周后取材，实验组和对照组分别注射10%水合氯醛2 mL麻醉致死后取下颌组织，立即置于4%多聚甲醛中4 °C固定24 h，PBS缓冲液清洗2~3次，置于10%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）中进行脱钙处理12周。组织脱钙完成后，进行梯度乙醇脱水，70%、80%、90%乙醇各1 h，100%乙醇2 h2次，组织置于二甲苯中1 h 2次，进行浸蜡包埋，制作8 µm切片。

1.2.3. 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色

石蜡切片经脱蜡、水化处理后，依次PBS缓冲液清洗5 min×2次，苏木素染色5 min，双蒸水清洗5 min×2次，伊红染色10 min，双蒸水清洗5 min×2次，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树脂封片。

1.2.4. 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色采用ABC法进行，详细步骤如下：石蜡切片经脱蜡、水化处理后，以3%H₂O₂室温处理20 min灭活内源性过氧化物酶；切片经PBS漂洗后进行抗原修复、羊血清封闭；随后切片滴加相应一抗后37 °C孵育2 h，4 °C过夜；二抗37 °C孵育1 h，室温下DAB显色，显微镜下观察显色效果，PBS漂洗终止显色，苏木素复染30 s，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片。

1.2.5. 免疫组织化学染色半定量分析

染色结果的半定量分析以多数细胞的阳性染色程度进行评分：从阴性到强阳性分为4个等级：0分为阴性（-），1分为弱阳性（+），2分为阳性（++），3分为强阳性（+++）。切片置于高倍镜下观察，每张切片至少选取4个视野进行综合评分。

1.3. 数据处理和统计

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，对实验组和对照组的血糖和体重等计量资料进行正态性检验，用均数±标准差进行统计描述，采用t检验进行统计学分析，以P<0.01为差异显著。

2. 结果

2.1. 糖尿病大鼠模型构建

实验组和对照组大鼠血糖分别为（29.22±4.47）、（5.41±0.96） mmol·L⁻¹，实验组大鼠血糖水平显著高于对照组（P<0.001）。实验组和对照组大鼠体重分别为（241.08±46.23）、（332.54±34.39）g，实验组大鼠体重显著下降（P<0.001）。由此表明糖尿病大鼠模型建立成功。

2.2. 大鼠下颌牙周组织结构的改变

通过组织形态学观察发现，实验组大鼠牙槽骨中骨小梁结构稀疏并且散乱，骨吸收明显增加，在牙周膜与牙槽骨相衔接的一层硬骨板被完全破坏（图1），表明糖尿病导致大鼠牙周炎性病变或外伤。

图 1. 糖尿病大鼠和正常大鼠牙周组织形态学观察 HE.

Fig 1 The histomorphology observation of diabetic and control rats' periodontium HE

A：正常大鼠牙槽骨，× 100；B：糖尿病大鼠牙槽骨，× 100；C：正常大鼠硬骨板，× 400；D：糖尿病大鼠硬骨板，× 400。

2.3. S100A9在糖尿病大鼠下颌牙周组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示，S100A9在糖尿病大鼠牙槽骨、牙周膜和牙龈组织中均有表达，且主要集中于细胞质中表达。与对照组相比，S100A9在牙周膜中的表达增强；在牙龈组织中的表达明显增强，且主要集中于牙龈上皮中；在牙槽骨中出现显著上调（图2）。通过半定量分析对染色组织进行评分，S100A9蛋白在正常大鼠牙周膜、牙龈、牙槽骨中的表达评分分别为1、2、1；在糖尿病大鼠牙周膜、牙龈、牙槽骨中的表达评分分别为2、3、2。

图 2. S100A9蛋白在糖尿病和正常大鼠牙周中的表达 免疫组织化学染色 × 400.

Fig 2 The expression of S100A9 in the periodontium of diabetic and control rats immunohistochemical staining × 400

上：正常组；下：实验组。左：牙周膜；中：牙龈上皮；右：牙槽骨。

2.4. TLR4和p-P65在糖尿病大鼠牙周组织中的表达

TLR4在牙周膜、牙龈上皮和牙槽骨中均有阳性表达。与对照组相比，TLR4在糖尿病大鼠牙周膜中的表达更强；在牙龈中TLR4的表达仅局限于牙龈上皮中，相比于对照组表达明显上调；在对照组牙槽骨中TLR4的表达较低，而在糖尿病大鼠牙槽骨中TLR4的表达明显增强且更为广泛（图3）。通过半定量分析对染色组织进行评分，TLR4蛋白在正常大鼠牙周膜、牙龈、牙槽骨中的表达评分均为1。在糖尿病大鼠牙周膜、牙龈、牙槽骨中的表达评分分别为2、3、3。

图 3. TLR4蛋白在糖尿病和正常大鼠牙周中的表达 免疫组织化学染色 × 400.

Fig 3 The expression of TLR4 in the periodontium of diabetic and control rats immunohistochemical staining × 400

上：正常组；下：实验组。左：牙周膜；中：牙龈上皮；右：牙槽骨。

p-P65在对照组的牙周组织中均无表达，在糖尿病大鼠牙周膜和牙槽骨中均出现较为明显的表达，而在糖尿病大鼠牙龈组织中不表达（图4）。通过半定量分析对染色组织进行评分，p-P65蛋白在正常大鼠牙周膜、牙龈、牙槽骨中的表达评分均为0，在糖尿病大鼠牙周膜、牙龈、牙槽骨中的表达评分分别为1、0、2。

图 4. p-P65蛋白在糖尿病和正常大鼠牙周中的表达 免疫组织化学染色 × 400.

Fig 4 The expression of p-P65 in the periodontium of diabetic and control rats immunohistochemical staining × 400

上：正常组；下：实验组。左：牙周膜；中：牙龈上皮；右：牙槽骨。

3. 讨论

本研究发现，在糖尿病大鼠的牙周组织中，牙槽骨吸收明显增加，骨小梁稀疏，且与牙周膜结合的硬骨板破坏；免疫组织化学染色结果显示S100A9表达显著上调，TLR4和NF-κB信号活化水平显著增加。研究[10]发现S100A9/A8复合物激活NF-κB信号通路，而本实验组检测到的TLR4和NF-κB/p-P65在糖尿病大鼠牙周组织中激活，推测S100A9蛋白高表达可能通过激活NF-κB和TLR4信号通路促进牙周炎症的发生，增加牙槽骨的骨吸收。

以往研究表明，糖尿病会引起成骨细胞的分化功能障碍[11]，导致下颌骨骨密度降低[12]，糖尿病引起的S100A9表达水平增加与炎症密切相关[13]，并且可能通过TLR4[14]和NF-κB[5]信号通路发挥作用。已有研究[15]发现在S100A9敲除的小鼠体内，通过抗原诱导形成的骨关节炎模型中骨吸收明显被抑制，据此推测糖尿病导致的牙周结构的改变可能是与S100A9介导的炎症反应和S100A9对骨吸收的促进有关。在目前的临床案例中，糖尿病和牙周炎关系密切，而且糖尿病患者会有更高的概率患牙周炎。有研究[16]表明高血糖会诱导骨髓髓系祖细胞的增殖和扩增，释放单核细胞进入血液循环，并且会促进中心粒细胞分泌S100A8/A9蛋白。本研究糖尿病大鼠模型中，单是从牙周组织来看，牙周被严重破坏，推测糖尿病大鼠牙槽骨骨髓腔单核细胞会被激活分泌S100A9蛋白，并释放到牙周组织中，促使牙周组织中细胞炎性发生，促进破骨细胞分化，加强牙槽骨中破骨性骨吸收，而糖尿病大鼠的牙龈上皮中S100A9高表达是组织被细菌侵入，S100A9表达的增强有着微生物抵抗的作用[6]，实验中S100A9在牙龈上皮中的表达很高，可能预示着糖尿病大鼠的牙龈已被微生物感染；S100A9的内源性配体TLR4，作为牙周炎中牙龈上皮表达的信号蛋白[17]，检测到的TLR4在牙龈中的高表达也有文献证实，高糖的环境会促使牙龈中TLR4的表达上调，在局部的炎症环境中TLR4的表达增强还会促进糖尿病患者更容易患上牙周炎[18]。通过对S100A9、TLR4、p-P65在牙周膜、牙龈和牙槽骨中表达的半定量分析发现，在实验组动物中三者的表达有明显相似的趋势，推测S100A9蛋白可能通过激活TLR4表达使牙槽骨的破骨性吸收加重。

本研究通过构建糖尿病大鼠模型，研究糖尿病对牙周结构的影响，并检测牙周组织中S100A9蛋白的表达，以及TLR4和NF-κB/p-P65在牙周组织中的表达。本研究结果表明，S100A9可能通过激活TLR4的表达增强牙槽骨的破骨性骨吸收，同时通过激活NF-κB信号通路促进牙周炎症的发生，本研究结果可为糖尿病导致的牙周病变的临床治疗提供药物靶点，可能会为改善糖尿病导致的牙周病变提供新的治疗靶点。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81271119）；四川省应用基础研究项目（2013JY0019）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81271119); Basic Research Program of Sichuan Province (2013JY0019).