蓬乱蛋白2在高脂血症大鼠种植体周围早期表达的实验研究

Abstract

Objective

This study aims to investigate the expression of disheveled 2 (Dvl2) around the implant of hyperlipidemic rats at an early stage after the implantation.

Methods

A total of 24 Wistar rats were divided equally into the experimental group fed with high-fat diet group and control group fed with a normal diet. After 8 weeks, the serum lipid levels were detected, and rats received implants in the femur metaphysis. Rats were sacrificed at 1, 3, and 5 days after implantation, and the bones around implants were obtained. Methylene blue-acid fuchsin staining was performed to observe the implant-bone interface. Real-time polymerase chain reaction was performed on runt-related transcription factor 2 (Runx2), cathepsin K (CatK), and Dvl2. Dvl2 Western blot or immunoprecipitation, phosphorylation, and ubiquitination were also conducted.

Results

In the experimental group, less osteoblasts, lower expression of Runx2 and Dvl2, and lower Dvl2 phosphorylation (P<0.05) than those of the control group were observed; furthermore, the CatK expression and Dvl2 ubiquitination were higher than those in the control group (P<0.05).

Conclusion

Hyperlipidemia may suppress bone remodeling around the implant at an early stage by Dvl2 down-regulation, phosphorylation, and up-regulated ubiquitination.

目前种植修复已成为牙列缺损或缺失的常见修复方式，种植体-骨结合界面形成良好的骨整合是种植成功的关键因素。影响种植体骨整合的因素有很多，高脂血症也是其中之一[1]，因其可以抑制种植体-骨结合界面的形成和强度，但具体机制尚未明确。高脂血症是以血清脂质水平升高为主的代谢紊乱疾病，发病率较高[2]。研究[3]–[4]发现，高脂血症与骨代谢性疾病密切相关，可以促进破骨细胞生成而抑制骨代谢和矿化，导致骨质疏松的发生。本课题组前期研究[5]证实，患高脂血症大鼠在种植术后1、5 d，成骨相关的钙、磷元素沉积减少，提示高脂血症对种植后早期，即术后5 d内的骨改建有一定影响。

Wnt信号通路是调节骨形成和代谢的重要通路[6]。蓬乱蛋白2（disheveled 2，Dvl2）是Wnt信号通路中发挥关键作用的蛋白之一[7]。本实验通过建立高脂血症大鼠模型后植入种植体，观察术后5 d内种植体的骨改建情况以及Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、组织蛋白酶K（cathepsin K，CatK）、Dvl2的表达情况，并初步探讨其可能的分子作用机制。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂和仪器

高脂饲料、普通饲料（北京科澳协力饲料有限公司）；10%水合氯醛（山东大学齐鲁医院配制），头孢唑林钠（哈尔滨哈药集团制药总厂），亚甲基蓝（南京森贝伽生物科技有限公司），酸性品红（青岛捷世康生物科技有限公司）；纯钛种植体（江苏双羊医疗器械有限公司）；逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（Takara公司，日本），放射免疫沉淀检测（radioimmunoprecipitation assay，RIPA；北京康为世纪有限公司）试剂盒，苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、BCA蛋白试剂盒（北京索莱宝有限公司）；抗体（Abcam公司，英国），蛋白A+G琼脂糖珠（北京碧云天生物科技有限公司）；Roche480 PCR扩增仪（Roche公司，瑞士），硬组织切片机（EXAKT公司，德国）。

1.2. 建模

24只6周龄雄性Wistar大鼠，重量约（200±20）g，购于山东大学动物中心。随机数字表法均分为对照组和实验组。建模方式、筛选标准参见本课题组前期研究[5]。对照组普通饲料喂养，实验组高脂饲料喂养，其中高脂饲料配方是由普通饲料质量分数78.8%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%、胆汁盐0.2%构成。8周后，通过内眦静脉取血检测血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）。如果实验组TC含量是对照组的2倍以上，且TG、LDL含量显著高于对照组即认为成功建立高脂血症大鼠模型，进行后续实验并继续进行高脂饲料喂养。

1.3. 种植体植入

采用10%水合氯醛按3 mL·kg⁻¹腹腔注射麻醉大鼠，分别于距双侧股骨干骺端远心端5 mm处植入直径1.5 mm、长度2.5 mm的种植体一枚。创面对位分层缝合，术后3 d内每天肌肉注射头孢唑林钠20万U。

1.4. 取材

术后1、3、5 d，通过注射过量水合氯醛处死大鼠，剥离肌肉和黏膜，截取包含种植体的骨组织样本。每组每个时间点取来自不同大鼠的3个样本置于多聚甲醛中固定、乙醇梯度脱水、浸塑液浸泡、聚甲基丙烯酸树脂包埋备用，其余样本去除多余骨组织，获得种植体及其周围1 mm的骨组织样本并于液氮中保存。

1.5. 亚甲基蓝-酸性品红染色

包埋完成的样本用硬组织切片机沿种植体长轴切开，获得厚30 µm的组织切片。亚甲基蓝-酸性品红染色后，400倍光学显微镜下观察种植体-骨结合界面情况。

1.6. 实时荧光定量PCR（real time-fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）

样本在液氮中研磨成粉末状，Trizol提取总RNA，逆转录生成cDNA。各管中加入5.0 µL的SYBR Premix Ex Taq TM，正反向引物各0.2 µL，cDNA样本各0.5 µL，补水至10 µL，进行PCR循环，95 °C 30 s，95 °C 5 s，60 °C 20 s，共40个循环，以磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参照。所有引物序列由济南博尚生物科技有限公司设计并合成，具体序列见表1。

表 1. 基因及其引物序列.

Tab 1 Genes and primer sequences

基因名称	上游引物序列（5′—3′）	下游引物序列（5′—3′）
GAPDH	TGATGGGTGTGAACCACGAG	CCCTTCCACGATGCCAAAGT
Dvl2	ACCTCCACCATTACCCCCTT	CCTCCTAGGTCGGTCTCGTC
Runx2	CAGACACAATCCTCCCCACC	GCCAGAGGCAGAAGTCAGAG
CatK	TGGTTCCTGTTGGGCTTTCA	CCTTTGCCGTGGCGTTATAC

1.7. 免疫印迹法

PMSF提取总蛋白，RIPA裂解，测定BCA蛋白浓度。配制十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶，上样，电泳，转膜，封闭1 h。加一抗后于4 °C孵育过夜，加二抗后于室温孵育1 h。ProteinSimple化学发光成像系统曝光和显影，Alpha-View SA软件分析条带的灰度值，分析Dvl2和磷酸化Dvl2蛋白的表达。

1.8. 免疫共沉淀与免疫印迹法

提取、裂解、测定蛋白浓度步骤同1.7，加入一抗4 °C摇动过夜，再加入蛋白A+G琼脂糖珠，4 °C摇动1 h，离心后吸取上清液，裂解液洗涤，加入SDS缓冲液，沸水煮10 min后进行SDS-PAGE及免疫印迹检测，分析泛素化Dvl2蛋白的表达。

1.9. 统计学分析

实验数据用均数±标准差描述，采用SPSS 19.0软件分析，并用t检验进行统计学分析，检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. 血脂水平检测

实验组大鼠的血脂水平明显升高。与对照组相比，实验组的TC值升高约两倍（P<0.05），TG和LDL水平明显高于对照组（P<0.05）（表2），这表明本实验成功建立高脂血症大鼠动物模型。

表 2. 两组大鼠血清TC、TG、HDL和LDL测定结果.

Tab 2 The serum TC, TG, HDL and LDL of two groups

测量项目	对照组	实验组
TC	1.26±0.20	2.53±0.49*
TG	0.73±0.23	1.39±0.51*
HDL	0.88±0.18	1.14±0.23*
LDL	0.25±0.07	0.44±0.12*

注：*P<0.05。

mmol·L⁻¹, n=12

2.2. 光镜观察硬组织切片

实验组种植体周围的骨小梁数目较少，且呈无序排列，胶原纤维较少（图1上）；而对照组的骨小梁数目增加且排列相对密集（图1下）。随着时间推移，各组骨小梁、成骨细胞均增多。术后第5天，相比于对照组，实验组种植体周围的成骨细胞增多，破骨细胞减少（图1 ）。

图 1. 2组种植体周围的骨结合情况 亚甲基蓝-酸性品红染色 × 400.

Fig 1 Bone binding around the implant of two groups methylene blue-acid fuchsin staining × 400

上：实验组；下：对照组；左、中、右分别代表1、3、5 d。

2.3. Runx2、CatK和Dvl2 mRNA的表达

Runx2亚类Ⅰ型、CatK分别是鉴定早期成骨细胞、破骨细胞分化的标志物之一，测试结果显示：实验组Runx2的相对表达量明显低于对照组 （P<0.05）（图2左），实验组CatK的相对表达量明显高于对照组（P<0.05）（图2中），实验组Dvl2的相对表达明显低于对照组（P<0.05）。

图 2. Runx2（左）、CatK（中）和Dvl2（右）mRNA的表达.

Fig 2 Expression of Runx2 (left), CathK (middle) and Dvl2 (right) mRNA

对照组Dvl2的表达在术后3 d内增加，第5天稍微减少，但仍高于实验组；实验组Dvl2的表达在术后3 d内呈下降趋势并在第5天轻微升高（图2右）。

2.4. Dvl2、磷酸化Dvl2和泛素化Dvl2蛋白的表达

实验组Dvl2蛋白的表达与其mRNA的表达一致，均明显低于对照组（P<0.05，图3左）。两组中磷酸化Dvl2蛋白表达一致，均在前3 d轻微减少而在第5天明显升高，但实验组相对表达量明显低于对照组（P<0.05，图3中）。实验组磷酸化Dvl2蛋白，在种植后第1、3天的表达几乎一致，第5天明显升高；但对照组的表达在种植后3 d内下降，随后升高。实验组泛素化Dvl2蛋白表达水平明显高于对照组，特别是种植后第3、5天（P<0.05，图3右）。

图 3. Dvl2蛋白（左）、磷酸化Dvl2 蛋白（中）和泛素化Dvl2蛋白（右）的表达.

Fig 3 Expression of Dvl2 protein (left), phosphorylation of Dvl2 protein (middle) and ubiquitination of Dvl2 protein (right)

C：对照组；E：实验组；上：免疫印迹电泳图；下：相对表达量。

3. 讨论

种植体周围骨整合过程与骨折愈合过程相似。骨折愈合过程中，成骨细胞促进胶原基质沉积[8]，而高脂血症可以破坏胶原纤维的获取和定位，使胶原纤维缺失，进而降低骨质和机械完整性，影响骨质愈合[9]。高脂饮食降低骨密度和骨矿物质含量，导致骨机械性能降低[4]。本实验发现，种植后5 d，实验组骨小梁排列紊乱，成骨细胞减少，破骨细胞增多，同时伴随Runx2表达降低、CatK表达升高。这表明高脂血症不利于种植体-骨结合界面的形成，抑制种植体周围的早期骨改建。

Dvl有3个同源基因，Dvl2的含量最高。β-catenin是经典Wnt信号通路激活必需的蛋白。Dvl促进β-catenin结合到淋巴细胞增强结合因子/T细胞特异转录因子（lymphoid-enhancer binding factor/T cell-specific transcription factors，LEF/TCF），最终启动一系列基因表达，调控成骨细胞的增殖和分化[7]。Dvl与跨膜卷曲蛋白的结合是非经典Wnt信号通路激活的第一步。本实验发现，实验组的Dvl2表达明显减少，提示高脂血症可能通过抑制Dvl2的表达进而抑制Wnt信号通路。

Wnt信号分子与受体结合后，Dvl2被广泛磷酸化。参与该磷酸化过程的蛋白激酶和因子，包括酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）、同源结构域相关蛋白激酶2等[10]。例如，CK1ε依赖的Dvl2磷酸化可增强Dvl2和Frat-1（Frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas 1）作用，激活Wnt信号通路，启动LEF/TCF介导的转录活性[11]。Dvl的磷酸化调节蛋白分子的稳定和相互作用，还调节蛋白分子与Wnt通路相关的其他信号通路分子的结合。

蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，而高脂血症能抑制PKB活性。有研究[12]证实，高脂饮食妨碍PKB磷酸化，降低其活性。本实验发现，实验组磷酸化Dvl2明显减少。高脂血症可能使PKB诱导的Dvl2磷酸化减少，抑制Wnt通路的激活和成骨分化，也影响Dvl2参与的蛋白之间的相互作用。

Dvl2的阴性调节主要通过泛素化。泛素连接酶可以促进磷酸化的Dvl2泛素化和降解，进而抑制经典Wnt通路[13]。本实验中，实验组泛素化Dvl2明显升高。可能是由于高脂血症可以抑制Wnt信号通路，并诱导Dvl2结构异常，使蛋白质错误折叠和功能紊乱，而这些受损的蛋白质通过泛素化信号通路被识别和清除。

脂质氧化导致的氧化应激压力是骨代谢改变的起始因素[14]。氧化应激压力抑制成骨相关的信号通路，减少成骨细胞和成骨相关分子表达[15]。高脂饮食促进脂蛋白和氧化产物生成，使氧化应激压力增高，进而抑制Wnt信号通路及其相关分子的表达。这与本实验中实验组Dvl2和磷酸化Dvl2表达减少，而泛素化Dvl2表达增加一致。

由本研究结果可以看出，高脂血症抑制种植体周围早期骨改建，这种抑制作用可能与下调Dvl2和磷酸化Dvl2、上调泛素化Dvl2有关。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81671025）；山东省科技发展计划（2015GSF118186）

Supported by: The National Natural Science Fundation of China (81671025); Shandong Science and Technology Development Plan (2015GSF118186).