巨噬细胞功能和炎症消退机制及与牙周炎关系研究进展

Abstract

巨噬细胞是人体固有免疫系统中重要的组成部分，具有强大的识别、吞噬、清除细菌及外来异物的功能。牙周炎是一种以牙龈炎症和牙槽骨丧失为特征的慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要病因。目前已经明确，牙周炎的组织破坏是由宿主对感染的免疫应答引起的，巨噬细胞作为宿主免疫应答的重要组成部分，在炎症的发生发展中起重要作用。近年研究显示，巨噬细胞在炎症消退过程中亦扮演着重要作用。本文就巨噬细胞在炎症的发生、发展及消退中的作用进行综述，并总结了其在牙周炎发展及治疗中可能的作用。

巨噬细胞（macrophage）是人体固有免疫系统中重要的组成部分，具有强大的识别、吞噬、清除细菌及外来异物的功能。巨噬细胞包括定居和游走两大类，定居巨噬细胞广泛分布全身，主要来源于卵黄囊、胎肝、骨髓前体细胞；游走巨噬细胞主要由血液中的单核细胞被募集至炎症、损伤部位后分化而来。巨噬细胞作为免疫应答的第一道防线，可以通过识别清除病原体、杀伤靶细胞、抗原提呈、免疫调节等功能维持机体的稳态，然而，其过度的聚集和活化也会导致机体的组织损伤，故其动态平衡在组织的稳态中起着重要的作用[1]。

牙周炎是一种以牙周组织破坏、牙齿丧失为特征的慢性感染性疾病，主要特征有牙龈的炎症、牙周袋的形成、牙槽骨的吸收、牙齿的松动和移位，是造成成年人失牙的主要原因。目前已经明确，牙周炎的组织破坏主要是由宿主对感染的免疫应答造成的。巨噬细胞作为牙周组织中对抗牙周致病菌的第一道防线，不仅可以通过其强大的杀菌吞噬作用杀死病原菌，同时其过度的活化也会导致牙周组织的破坏，加重牙周炎的进程。

1. 巨噬细胞的来源及类型

1.1. 巨噬细胞的来源

早在20世纪初，Cavaillon[2]第一次报道巨噬细胞作为吞噬细胞清除病原体及维持机体的功能；1960年，Mackaness[3]第一次发现了巨噬细胞的活化状态；1968年，van Furth等[4]将巨噬细胞归入单核吞噬系统。然而关于巨噬细胞的来源仍然有很大的争议。在小鼠胚胎期9~10 d，卵黄囊血岛产生原始造血祖细胞通过血液循环至整个胚胎，分化出胚胎期原始的巨噬细胞分布于胚胎组织。与此同时，在胚胎期10.5 d，主动脉-中肾-生殖嵴产生永久造血组织，随后分化出造血祖细胞定居于胎肝，随后分化为血液中的单核细胞分布到胚胎组织，最后再分化为巨噬细胞[5]。出生后，组织中的巨噬细胞主要通过造血干细胞逐步分化为血液中的单核细胞，进而再分化为组织中的巨噬细胞[6]。

1.2. 巨噬细胞的类型极化

功能上，巨噬细胞在局部微环境中可分为经典型（M1）、非经典型（M2）和中间型。M1型巨噬细胞在Th1淋巴细胞及干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的辅助下形成，表达大量的主要组织相容性复合体Ⅱ、Toll样受体（Toll-like recpetor，TLR）、CD86、集落刺激因子，并分泌白细胞介素 （interleukin，IL）1β、TNF-α、IL-6、IL-23等促炎因子[7]。然而，M2型巨噬细胞在Th2淋巴细胞及IL-4、IL-13、TLR、IL-10、糖皮质激素的辅助下形成，高表达清道夫受体、甘露糖受体、CD163，并分泌抗炎因子IL-10、IL-RA、精氨酸、转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等[8]–[9]。中间型巨噬细胞兼具M1和M2型巨噬细胞的表型及功能。随着更多中间型巨噬细胞的发现，目前认为巨噬细胞的活化是一个连续的谱，M1、M2仅仅是谱上的两个极端，分别代表了促炎和抗炎两种极化状态，Runt相关转录因子和PU.1在向M1和M2转化过程中都起着重要作用[10]。虽然巨噬细胞主要极化为M1和M2型，但关于两种类型的来源却还不完全清楚。目前主要有3种假说，一是血液中经典型单核细胞来源的巨噬细胞主要是M1型，而非经典型单核细胞来源及定居的巨噬细胞为M2型；二是无论哪种单核细胞，在局部微环境的影响下早期极化为M1型，而后期为M2型；三是两种巨噬细胞可以根据环境的变化相互转化。然而无论哪种假设均不能完全解释巨噬细胞的来源和活化[11]。

2. 巨噬细胞的功能

2.1. 巨噬细胞的抗炎、修复功能

巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，在清除病原体和维持组织的稳态方面有着重要的作用。在Fas诱导巨噬细胞凋亡模型中，当清除巨噬细胞时，成骨细胞及骨形成均明显减少[12]，而当骨损伤时，缺少巨噬细胞会导致骨修复的失败[13]，表明巨噬细胞在骨的重建、骨稳态方面起着重要作用。在结缔组织中，当组织损伤或病原菌侵入时，巨噬细胞通过其表面的TLR识别病原菌，在Th1细胞及局部刺激因子的作用下分化为M1型巨噬细胞，参与炎症反应，当病原菌被清除后，在Th2细胞及局部刺激因子的作用下分化为M2型巨噬细胞，促进组织的修复和稳态的恢复[14]–[15]。此外，巨噬细胞表达大量的Fc及补体受体，通过这些受体参与细菌的清除。

2.2. 巨噬细胞的胞葬功能

中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）在吞噬和杀灭病原体后会经历自动凋亡过程，研究表明，在炎症区域病原体被消除后，PMN主要通过半胱天冬酶、钙蛋白酶、泛素-蛋白酶系统等的活化而引发自身非炎症性凋亡[16]，凋亡PMN如果不能及时被清除，则会释放出其胞内有毒内容物而造成二次感染，扩大炎症，从而使病情迁延不愈[17]。

巨噬细胞吞噬凋亡PMN的过程叫胞葬（efferocytosis），由Gardai等[18]第一次报道。目前由于该过程在炎症消退中的重要性而受到越来越多的关注。胞葬和吞噬作用类似，均依赖Rho家族的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP），却是两个不尽相同的过程[19]。吞噬是巨噬细胞清除外来微生物的过程，而胞葬是巨噬细胞清除凋亡细胞的过程。凋亡是细胞的一种非炎症性死亡，而胞葬则是确保其不引起炎症反应的重要步骤。它们的受体、分子机制以及所引发的下游信号通路均存在差异。吞噬过程主要依赖RhoA以及随后肌动蛋白的聚合和应力纤维的形成[20]。胞葬类似于大胞饮，由识别凋亡细胞的受体介导，RhoA的活性被抑制，而Rac1的活化协助巨噬细胞对凋亡小体的吞食。肌动蛋白聚合使细胞伸出板状伪足，然后胞膜内陷形成膜皱褶，将凋亡细胞包裹，内化为胞葬体（efferosome），溶酶体的融合将水解酶传送至胞葬体中，形成酸性的恶劣环境而摧毁凋亡细胞[19]。胞葬过程是一个密切调控的过程，包括“发现我”，即凋亡细胞暴露其磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），释放细胞因子，吸引巨噬细胞至凋亡细胞区域；“抓住我”，即巨噬细胞高表达细胞间黏附分子（intracellular adhesion molecule，ICAM）、清道夫受体CD36、CD14等[21]，通过这些分子桥与凋亡细胞相互作用；“吃掉我”，即巨噬细胞通过形成胞葬体而消灭凋亡细胞[21]–[22]。B类Ⅰ型清道夫受体通过识别PS导致RhoGTP酶Rac1的活化，活化的Rac1导致细胞骨架肌动蛋白的重新排列[23]。Kimura等[24]发现，凋亡细胞通过释放二磷酸尿苷（uridine diphosphate，UDP）上调单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）3的表达，从而促进巨噬细胞向坏死区域浸润，该过程可能间接增加巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。Schif-Zuck等[25]在小鼠腹膜炎的实验中发现了一种中间型的CD11^low巨噬细胞，命名为促炎消散巨噬细胞（resolution-promoting macrophages，Mres），这种细胞在炎症的恢复阶段出现。Mres主要由CD11^high巨噬细胞吞噬凋亡细胞后转变而来，CD11^low巨噬细胞又叫做“饱和的巨噬细胞”，具有更低的吞噬潜能，并移居到淋巴器官，这可能与促进炎症的消退而防止组织进一步纤维化有关。由此可见，巨噬细胞通过不同的途径识别、吞噬凋亡细胞（主要为PMN），从而在消除炎症、维持机体稳态方面有重要的作用。

2.3. 巨噬细胞参与炎症消退的机制

凋亡PMN的吞噬不仅是清除炎症因子的过程，同时也是引发巨噬细胞抗炎程序的重要步骤。近年来，随着炎症消退机制相关理论的逐渐成熟，促炎消散介质（proresolving mediators，SPMs）得到广泛的关注。脂氧素（lipoxin，LX）和Maresin（MaR）被发现是巨噬细胞胞葬作用的重要调控因子。LX是类花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代谢产物，主要包括脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）和脂氧素B4（lipoxin B4，LXB4）以及他们的异构体15-异构体-脂氧素A4（15-epimer-lipoxin A4，15-epi-LXA4）和15-异构体-脂氧素B4（15-epimer-lipoxin B4，15-epi-LXB4）4种。它们可以通过4种方法合成，其中2种是PMN通过与血小板或血管内皮细胞相互作用产生，一种是通过外源性的阿司匹林诱导产生，最后一种则是由PMN受到刺激时通过胞膜释放[26]。Ma-derna等[27]发现LX及其类似物通过激活不同的Rho GTP酶，导致巨噬细胞细胞骨架肌动蛋白的重新排列，此过程可能与LX引起巨噬细胞非炎症性的胞葬作用有关。LXA4还被发现通过增强αvβ3-CD36复合体的活性而增强巨噬细胞对凋亡PMN的识别。同时，经过LXA4预处理后的巨噬细胞吞噬能力明显增强，其吞噬过程中的促炎因子IL-8、MCP-1的释放明显降低[28]。此外，有学者[29]发现应用抗TGF-β抗体，可使巨噬细胞明显减少5-脂氧合酶及白三烯的产生，却可增加LXA4的产生，提示巨噬细胞可能通过TGF-β途径调节LXA4的产生而吞噬凋亡细胞，促进炎症的消退。

MaR是二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的代谢产物，由巨噬细胞在局部炎症微环境中合成，包括MaR1[30]和MaR2[31]，MaR1较MaR2有着更强的促炎消退和增强巨噬细胞胞葬的作用[31]。最近研究[32]发现MaR1除了由经典途径的巨噬细胞合成以外，还可以在血管中由PMN和血小板相互作用而跨细胞合成。Nordgren等[33]发现通过腹膜预注射MaR1可以明显减少暴露于有机粉尘的小鼠支气管肺泡盥洗液中PMN的浸润，炎症因子TNF-α、IL-6、趋化因子1、趋化因子2的产生，ICAM-1的表达。同时，Serhan等[34]发现，给予每只老鼠0.1 ng MaR1可以明显减少实验性腹膜炎中PMN的浸润。而当剂量增加到10 ng时，可以减少PMN浸润达50%~80%，同时MaR1还增加巨噬细胞对凋亡PMN的吞噬。LPS导致的急性肺损伤动物模型中，MaR1可以在体外使抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表达降低，从而促进PMN的凋亡；在体内通过减少PMN的聚集和肺组织的水肿而促进炎症的消退。同时，经MaR1处理的小鼠肺泡盥洗液中促炎因子明显降低，而抗炎因子IL-10却明显增加[35]，提示MaR1不仅可以在炎症后期促进炎症的消退，同时还可以在炎症早期促进PMN的凋亡，防止其坏死后释放出胞内容物而扩大炎症。Li等[36]在四氯化碳导致的肝损伤实验中得到了相似的结论。对小鼠实验性结肠炎的研究[37]也发现MaR1可以明显减少实验小鼠结肠的损伤，减少促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-a、INF-γ的产生，降低ICAM-1等的表达，抑制PMN的浸润。

除LX和MaR，后来又相继发现了几种SPMs，包括两种DHA的代谢产物以及它们的异构体，分别是PMN产生的保护素D1（protectin D1，PD1）和消散素D（resolvin D，RvD）以及一种二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）的代谢产物消散素E1（resolvin E1，RvE1）[38]–[39]，它们均能不同程度增强巨噬细胞的胞葬作用和促进炎症的消退。因此，SPMs可能通过不同的途径参与炎症反应，尤其是促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬而促进炎症的消散。

3. 巨噬细胞与牙周炎

3.1. 巨噬细胞与牙周炎症

牙龈组织中的常驻巨噬细胞通过与牙周微生物相互作用，分泌大量的促炎细胞因子和趋化因子，上调PMN和上皮细胞的黏附分子表达而招募PMN至牙周组织，参与牙周致病微生物的吞噬和炎症的产生。目前，除了经典的诱导性一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）、IL-1等巨噬细胞的致炎因子，SPMs在牙周炎的病因方面得到了很大的关注。Fredman等[40]在一项局限型侵袭性牙周炎（loca-lized aggressive periodontitis，LAP）的实验中发现，LAP患者血液中的PMN、巨噬细胞较正常人表达更高的CD18，且血小板-PMN、血小板-巨噬细胞的凝集均较正常组增加。同时LAP患者PMN在体外活化时产生更多的白三烯B4（leukotriene B4，LTB4），更少的LXA4，从而加重炎症反应。而给予1 nmol·L⁻¹的RvE1后LAP患者巨噬细胞的吞噬功能明显增加。Wang等[41]发现LAP患者组血液来源的巨噬细胞较牙周健康组产生更少的MaR1，提示牙周炎患者可能存在SPMs减少，导致致炎因子的明显增加而使炎症迁延不愈。

3.2. 巨噬细胞与牙槽骨的吸收

牙槽骨的丧失是牙周炎失牙的最主要的原因，细胞核因子κＢ受体活化因子配体（recepetor activator of NF-κB ligand，RANKL）-细胞核因子κＢ受体活化因子（recepetor activator of NF-κB，RANK）-骨保护素（osteoprotegerin，OPG）轴在骨的维持和改建中起着重要的作用。RANK主要表达于成骨细胞和其他细胞，包括成纤维细胞和淋巴细胞，Liu等[42]运用原位杂交技术检查了RANKL mRNA的表达水平，发现RANKL mRNA主要表达于炎症细胞，包括淋巴细胞和巨噬细胞。在慢性骨破坏疾病中如关节炎、牙周炎，均在骨破坏区检测到大量的M1型巨噬细胞来源的炎症因子如IL-1、TNF-α[43]。在风湿性关节炎中运用IL-1、TNF-α的拮抗剂进行治疗导致炎症的减轻和骨吸收的降低[44]，提示M1型巨噬细胞在骨吸收中起着重要的作用。以牙槽骨吸收为主要表现之一的牙周炎可能也与M1、M2之间的不平衡有关。有实验表明，牙龈卟啉单胞菌导致的老鼠牙周炎骨吸收模型中M1及其分泌的炎症因子明显较M2增多，通过皮下注射双磷酸盐-脂质体后，M1及骨吸收明显减少[45]。巨噬细胞通过其特异性的TLR-2识别牙龈卟啉单胞菌而产生TNF-α，同时TNF-α又促进TLR-2的表达，当把表达TLR-2的巨噬细胞输入TLR-2敲除的小鼠中时，牙槽骨的吸收明显增加[46]。在正畸骨吸收的研究中，M1/M2比例增加可导致牙槽骨的吸收，而M1/M2比例降低可抑制骨的吸收[47]。在牙齿移动较快的时候，M1型巨噬细胞及其分泌的炎症因子TNF-α明显增加，而通过注射双磷酸盐-脂质体阻断M1后，牙齿的移动明显减慢[48]。因此在牙周炎中，可能存在M1与M2之间的不平衡，导致M1型巨噬细胞占据主要地位，最终导致牙槽骨的吸收。

3.3. 巨噬细胞与牙周炎的治疗

反向极化及促进单核细胞极化为M2型巨噬细胞可能将成为治疗慢性炎症的有效方法。体内外实验均表明，极化的巨噬细胞可以再极化，噻唑烷二酮类药物可以促进脂肪组织血液里的单核细胞极化为M2型巨噬细胞[49]。有实验表明，体外极化的M2型巨噬细胞可以缓解小鼠的结肠炎、胰腺炎、肾功能损伤，而且体外极化的M1或M2型巨噬细胞可分别维持其促炎或抗炎的特性达4周。此外，RvD1、RvE1、LX等均可以促进巨噬细胞移出炎症部位，通过淋巴途径清除PMN，促进更多的巨噬细胞对PMN的吞噬[50]。Hasturk等[51]在兔的牙周炎实验中发现，RvE1可使牙槽骨恢复到炎症之前的状态，而且Sharpey纤维嵌入新形成的牙槽骨及牙骨质中。另一项关于LAP的试验中，通过局部的每天、每颗牙4 µg的RvE1治疗1周，可减少组织损伤及骨丧失达95%[38]。不同的试验均表明LX类似物的应用可以明显减少PMN的聚集、增强巨噬细胞的吞噬作用[52]。研究[42]发现，MaR1不仅可以通过增加巨噬细胞胞内抗菌活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生而增强巨噬细胞对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的吞噬，而且可以增强PMN对两种细菌的吞噬作用，提示MaR1不仅可以通过促进炎症消退，而且可能通过促进机体吞噬细胞对病原菌的吞噬而防止牙周炎的发生。综上所述，SPMs及其类似物的应用可能通过作用于巨噬细胞而促进牙周炎消退，是一类有着很大潜力的治疗方法。

4. 总结

炎症消散的基本过程包括PMN浸润的停止、SPMs的产生、巨噬细胞对凋亡PMN及坏死组织的吞噬、巨噬细胞由经典型转化为非经典型而促进组织的愈合。牙周炎的组织破坏主要是由宿主针对牙周致病菌产生的先天性及获得性免疫应答而导致，而巨噬细胞在牙周炎的发生发展中有着重要的作用。在炎症开始阶段，巨噬细胞被不同的刺激因子诱导，通过不同的途径大部分极化为M1型，参与病原菌的消除；而在炎症恢复阶段，巨噬细胞由M1型转化为M2型，通过胞葬途径清除凋亡的PMN。其中，由凋亡PMN产生的LX、PD1、RvE1以及巨噬细胞产生的MaR等SPMs可以显著的抑制PMN的浸润、促进巨噬细胞对PMN的吞噬从而促进炎症的消散。进一步了解巨噬细胞在牙周炎中的类型极化、胞葬机制、SPMs产生的途径，以及它们之间的关系有利于寻找更加有效的方法防止牙周组织的破坏。

Funding Statement

[基金项目] 四川省科技厅科技支撑计划（2015SZ0137）

Supported by: Science and Technology Support Program of Sichuan Science and Technology Department (2015SZ0137).