Abstract
目的
初步探讨核因子κB（NF-κB）/B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）信号通路与糖原合成激酶3β（GSK-3β）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中的表达情况，为OSCC的早期诊断及治疗提供参考。
方法
收集OSCC标本55例及癌旁组织10例，采用免疫组织化学SP法检测OSCC组织及癌旁组织中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达情况，并分析三者相互之间的表达关系及三者与患者临床病理参数之间的关系。
结果
GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC中的表达高于癌旁组织中的表达（P<0.01），且三者与患者年龄、性别以及临床分期无明显关系（P>0.05）。Bcl-2在不同组织学分化程度的OSCC组织中的表达有统计学差异（P<0.05），而GSK-3β及NF-κB在不同组织学分化程度的OSCC中的表达无统计学差异（P>0.05）。GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC中的表达均两两相关（P<0.05）。
结论
GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC组织中的表达显著高于癌旁组织中的表达，检测GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达水平对于OSCC的早期诊断和预后估计有一定的临床意义。
Keywords: 糖原合成激酶3β, 核因子κB, B细胞淋巴瘤2, 口腔鳞状细胞癌
Abstract
Objective
This study aims to examine the expression of nuclear factor κB (NF-κB)/B cell lymphoma-2 (Bcl-2) signal pathway and glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and provide references for the early diagnosis and prognosis evaluation of OSCC.
Methods
A total of 55 cases of OSCC and 10 cases of paracancerous mucosa were examined in this study. Their expressions of GSK-3β, NF-κB and Bcl-2 were detected using the SP method immunohistochemistry. The correlation between their expression in OSCC and the clinical and pathological peculiarity of OSCC was analyzed.
Results
The positive expression of GSK-3β, NF-κB, and Bcl-2 in OSCC were significantly higher than that in paracancerous mucosa (P<0.01). The expression of GSK-3β, NF-κB, and Bcl-2 had no obvious relationship with patient's age, sex, and clinical stages of the disease (P>0.05). The expression of Bcl-2 was significantly correlated with the degree of tumor differentiation (P<0.05), whereas the expression of GSK-3β and NF-κB in OSCC had no obvious relationship with the degree of tumor differentiation (P>0.05). Strong positive correlations were observed among the expressions of GSK-3β, NF-κB, and Bcl-2 (P<0.05).
Conclusion
The positive expression of GSK-3β, NF-κB, and Bcl-2 in OSCC are significantly higher than that in paracancerous mucosa. Detecting GSK-3β, NF-κB, and Bcl-2 in OSCC may have implications in the early diagnosis and prognosis evaluation of OSCC.
Keywords: glycogen synthase kinase 3β, nuclear factor κB, B cell lymphoma-2, oral squamous cell carcinoma
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最为常见的恶性肿瘤，其发病率有逐渐增加的趋势。研究表明糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）能磷酸化多种底物，负性调节多条信号通路。多种恶性肿瘤的发生与GSK-3β均密切相关，如喉癌、食道癌、恶性黑色素瘤等[1]–[2]。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）作为抗细胞凋亡基因B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的上游调控基因[3]，是具有多向性调节作用的转录因子。NF-κB的异常活化在肿瘤发生发展及侵袭转移中有着十分重要的作用[4]–[5]，但目前关于NF-κB/Bcl-2信号通路与GSK-3β在OSCC发生发展中的作用及这几种因子之间相互关系的研究较少见。本研究选用免疫组织化学方法检测不同组织学分化程度的鳞癌组织和OSCC癌旁组织中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达情况，初步探讨GSK-3β、NF-κB及Bcl-2与OSCC临床病理参数的关系，以及这几种蛋白在OSCC中表达的相互关系，研究其作为OSCC的标志物或者预测因子的可能性，为临床上对OSCC进行早期诊断和治疗提供参考。
1. 材料和方法
1.1. 标本来源
收集2007—2011年四川大学华西口腔医院头颈肿瘤外科手术切除并经病理确诊为口腔鳞状细胞癌的病例55例，同时伴发其他口腔疾病者不纳入本实验的范围，所有纳入病例术前均未行放化疗。55例患者中，男39例，女16例；根据组织学分化程度分类，鳞状细胞癌一级25例，二级18例，三级12例；临床分期Ⅰ期14例，Ⅱ期12例，Ⅲ期15例，Ⅳ期14例。在55例患者中随机选取10例，取癌旁组织（肿瘤边缘约1 cm）作为对照组。所有标本均在离体后经甲醛固定，取材，逐级脱水后采用石蜡包埋。
1.2. 主要试剂
兔抗人p-GSK-3β（Ser9）多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗人Bcl-2多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗人NF-κB多克隆抗体、免疫组织化学羊抗兔试剂盒（SP-9001）及浓缩型DAB试剂盒（ZL1-9031）（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.3. 实验方法
1.3.1. 标本切片
将所收集的病理标本石蜡块常规切片，每个标本切4 µm厚连续切片，切5张，1张采用苏木精-伊红染色进行复查。
1.3.2. 免疫组织化学SP法染色
先通过预实验明确p-GSK-3β抗体的最佳稀释浓度是1︰200，NF-κB抗体的最佳稀释浓度是1︰300，Bcl-2抗体最佳稀释浓度是1︰100。SP法染色主要步骤为：烤片；脱蜡；梯度乙醇脱水；3%H2O2溶液阻断灭活内源性过氧化物酶；抗原修复；正常山羊血清封闭；滴加一抗孵育（用PBS液代替一抗作阴性对照），PBS液洗3次；滴加生物素化标记二抗孵育，PBS液洗3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，PBS液洗3次；DAB显色液染色，水洗；苏木素复染，水洗；1%盐酸乙醇分色，水洗；氨水返蓝，水洗；最后常规脱水、透明、干燥、封片。
1.4. 结果观察
在200倍及400倍的光学显微镜下观察切片的染色反应。胞浆或（和）胞核中呈棕黄色或棕褐色深染的细胞为GSK-3β、NF-κB及Bcl-2阳性表达的细胞。实验结果采用Fromowitz等[6]的综合计分法进行计分。每张切片随机选取5个高倍视野（×400）计数，阳性细胞表达率=（阳性细胞数/计数细胞总数）×100%。无阳性细胞计0分，阳性细胞表达率小于等于25%计1分，26%~50%计2分，51%~75%计3分，>75%计4分。着色强度以多数阳性细胞呈现的染色特性计分，无着色计0分，呈淡黄色计1分，呈棕黄色计2分，呈棕褐色计3分。根据2种计分之和进行评价，0~1分为阴性（-），2~3分为弱阳性（+），4~5分为中度阳性（++），6~7分为强阳性（+++）。所有切片均采用双盲法阅片。进行相关性分析时，将“-”、“+”归为弱表达，“++”、“ +++”归为强表达。
1.5. 统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。各组标本GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表达阳性率比较采用χ2检验和Fisher确切概率。以α=0.05作为检验标准，P<0.05为有统计学意义。GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表达相关性采用趋势性检验及一致性检验分析，以α=0.05作为检验标准，P<0.05、κ>0.6为有统计学意义。表达强度比较采用等级资料的秩和检验，以α=0.05作为检验标准。
2. 结果
2.1. GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁组织、OSCC中的表达情况
GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁组织及OSCC中的表达见图1、表1。1）GSK-3β在OSCC中的阳性表达主要定位于癌细胞胞浆内，呈棕黄色至棕褐色深染；NF-κB在OSCC中的阳性表达部分定位于癌细胞胞浆内，部分定位于胞核中，呈棕黄色甚至棕褐色深染；Bcl-2在OSCC中的阳性表达主要定位于癌细胞胞浆内，呈棕黄色甚至棕褐色深染。2）GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC癌旁组织中分别只有40％、40％、20％呈弱阳性表达；而在OSCC中其阳性表达率分别为98.18％、94.55％、96.36％，且以强阳性表达为主（表1）。GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC中的表达与癌旁组织中的表达之间具有统计学差异（P<0.01），在OSCC中的表达高于在癌旁组织中的表达。
图 1. GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁组织及OSCC中的表达 免疫组织化学 × 400.
Fig 1 Expression of GSK-3β, NF-κB and Bcl-2 in paracancerous and OSCC immunohistochemistry × 400
上：癌旁组织；下：OSCC。从左到右：GSK-3β、NF-κB、Bcl-2。
表 1. GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁组织及OSCC中的表达.
Tab 1 Expression of GSK-3β, NF-κB and Bcl-2 in paracancerous and OSCC
| 表达等级 | GSK-3β |
NF-κB |
Bcl-2 |
|||
| OSCC | 癌旁组织 | OSCC | 癌旁组织 | OSCC | 癌旁组织 | |
| - | 1 | 6 | 3 | 6 | 2 | 8 |
| + | 9 | 4 | 9 | 4 | 12 | 2 |
| ++ | 27 | 0 | 20 | 0 | 27 | 0 |
| +++ | 18 | 0 | 23 | 0 | 14 | 0 |
| 合计 | 55 | 10 | 55 | 10 | 55 | 10 |
2.2. OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达与患者临床病理参数之间的关系
OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达与患者临床病理参数的关系见表2。如表2所示，GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达与患者的年龄、性别以及临床分期无明显关系（P>0.05）。Bcl-2在不同组织学分化程度的OSCC组织中的表达有统计学差异（P<0.05），随着分化程度级别的增加，强表达率逐渐升高，而GSK-3β与NF-κB在不同组织学分化程度的OSCC中的表达无统计学差异（P>0.05）。
表 2. OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表达与患者临床病理参数的关系.
Tab 2 Relationship between expressions of GSK-3β, NF-κB and Bcl-2 in OSCC and clinicopathological parameters
| 临床病理参数 | n | GSK-3β |
NF-κB |
Bcl-2 |
||||
| 强表达/% | P值 | 强表达/% | P值 | 强表达/% | P值 | |||
| 性别 | 男 | 39 | 32/82.05 | 1.000 | 30/76.92 | 1.000 | 29/74.36 | 1.000 |
| 女 | 16 | 13/81.25 | 13/81.25 | 12/75.00 | ||||
| 年龄/岁 | >70 | 4 | 4/100 | 0.935 | 3/75.00 | 0.640 | 4/100 | 0.893 |
| 50~70 | 38 | 31/81.58 | 31/81.58 | 28/73.68 | ||||
| <50 | 13 | 10/76.92 | 9/69.23 | 9/69.23 | ||||
| 分化程度 | 一级 | 25 | 17/68.00 | 0.109 | 17/68.00 | 0.215 | 14/56.00 | 0.028 |
| 二级 | 18 | 16/88.89 | 15/83.33 | 15/83.33 | ||||
| 三级 | 12 | 12/100 | 11/91.67 | 12/100 | ||||
| 临床分期 | Ⅰ、Ⅱ期 | 26 | 22/84.62 | 0.733 | 21/80.77 | 0.660 | 19/73.08 | 0.813 |
| Ⅲ、Ⅳ期 | 29 | 23/79.31 | 22/75.86 | 22/75.86 | ||||
2.3. OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表达的相关性分析
GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表达相关性的两两比较见表3。如表3所示，经过趋势性检验及一致性检验分析，GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC中的表达均两两相关（P<0.05）。其中，GSK-3β和NF-κB表达显著相关且一致性较高（P<0.05，κ>0.6）；GSK-3β和Bcl-2表达显著相关且一致性较高（P<0.05，κ>0.6）；NF-κB和Bcl-2表达显著相关且中度一致性（P<0.05，0.4<κ<0.6）。
表 3. OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表达相关性的两两比较.
Tab 3 Multiple comparison between expressions of GSK-3β, NF-κB and Bcl-2 in OSCC
| 对比组 | 弱 | 强 | 合计 | χ2值 | P值 | κ值 |
| GSK-3β | 10 | 45 | 55 | 16.634 | 0.001 | 0.676 |
| NF-κB | 12 | 43 | 55 | |||
| 合计 | 22 | 88 | 110 | |||
| GSK-3β | 10 | 45 | 55 | 22.838 | 0.001 | 0.683 |
| Bcl-2 | 14 | 41 | 55 | |||
| 合计 | 24 | 86 | 110 | |||
| NF-κB | 12 | 43 | 55 | 22.838 | 0.001 | 0.497 |
| Bcl-2 | 14 | 41 | 55 | |||
| 合计 | 26 | 84 | 110 |
3. 讨论
近年来学者[7]–[10]研究发现，在肿瘤细胞模型中通过基因敲除或沉默GSK-3β后，NF-κB信号通路的活性受到了抑制，从而下调其靶基因Bcl-2抗凋亡蛋白的表达，增强肿瘤细胞的凋亡。这些证实了NF-κB/Bcl-2信号通路和GSK-3β与OSCC的发生发展密切相关。
GSK-3是一种能磷酸化多种信号调节蛋白和各种转录因子的丝氨酸/苏氨酸激酶[11]–[12]。研究[2]发现，多数病理过程与GSK-3β磷酸化修饰调节有关，且在上皮源性的癌组织中发现GSK-3β（Ser9）高表达。GSK-3β能抑制一些肿瘤细胞的生长（如喉癌、食道癌、恶性黑色素瘤等），同时也能够促进某些肿瘤的生长（如白血病、卵巢癌、肾细胞癌等）[1]–[2]。在OSCC中，GSK-3β作为抑制肿瘤生长的功能存在，能够检测到GSK-3β（Ser9）的高表达[13]，且在激活GSK-3β后能逆转上皮间叶转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程[14]。本研究结果显示，GSK-3β在癌旁组织组中的表达较弱，而在OSCC中则呈强阳性表达，GSK-3β在OSCC组的表达显著高于癌旁组，但与OSCC的组织学分化程度无明显相关。这表明，在OSCC组织中存在GSK-3β的高表达，其处于失活状态，而且GSK-3β能够抑制OSCC的生长[2]，可知GSK-3β的异常活化与OSCC的发生发展密切相关。
NF-κB是一种可与免疫球蛋白轻链基因增强子κB序列特异性结合并促使κ链转录以及轻链形成的一种细胞因子，当细胞受到刺激时，IκB激酶（IκB kinase，IκK）复合体能使IκB发生磷酸化而降解，从而使NF-κB游离出来并在胞核内聚集发生活化[4],[15]。本研究显示，NF-κB在癌旁组织中的表达较弱，而在OSCC中则呈强阳性表达，NF-κB在OSCC组的表达显著高于癌旁组，但与OSCC的组织学分化程度无明显相关。NF-κB的活化通过调控诱导抗凋亡蛋白的靶基因的表达而抑制细胞凋亡。在多种肿瘤细胞中，NF-κB的持续过度活化暗示NF-κB的活化在肿瘤的发生中有着重要作用。
Bcl-2家族是一类高度保守的蛋白，与细胞凋亡密切相关，按功能可以分为以Bcl-2为代表的抗细胞凋亡蛋白及以Bax为代表的促进细胞凋亡基因[16]。在肿瘤细胞中，Bcl-2作为抗凋亡基因通过抑制各种凋亡刺激信号从而抑制肿瘤细胞凋亡。研究[3]表明NF-κB是Bcl-2的上游调控基因。本实验显示，Bcl-2在癌旁组织中的表达较弱，而在OSCC中则强阳性表达，Bcl-2在OSCC组的表达显著高于癌旁组，且与OSCC的组织学分化程度显著相关。这表明在OSCC中存在Bcl-2的持续活化，而Bcl-2作为抗凋亡基因在很大程度上抑制了肿瘤的凋亡，与OSCC的发展密切相关。
本文研究结果与其他学者对肾细胞癌、结肠癌以及前列腺癌的研究结果相似。在肾细胞癌中，抑制GSK-3β的活性后，NF-κB靶基因Bcl-2的表达下调[17]。在结肠癌及前列腺癌中，抑制GSK-3β活性能使NF-κB的转录活性下调，从而抑制了肿瘤细胞的生长[18]–[19]。这些研究均提示，NF-κB/Bcl-2信号通路与GSK-3β可能与一些恶性肿瘤的发生发展有相关性。另外本研究还分析了GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表达之间的相关性，结果发现其两两之间的表达均显著相关（P<0.05），进一步验证了NF-κB/Bcl-2信号通路与GSK-3β在OSCC中的存在。
综上，本研究结果显示NF-κB/Bcl-2信号通路和GSK-3β在OSCC中持续激活，提示这种异常活化可能与OSCC的发生发展密切相关，对其表达水平进行检测能对OSCC的早期诊断和判断预后提供帮助；但要阐明NF-κB/Bcl-2信号通路和GSK-3β与OSCC发生发展的关系及其在此过程中的具体作用机制，尚有待进一步深入的研究。GSK-3β对NF-κB/Bcl-2信号通路的影响可能使其在分子水平上为头颈部鳞癌的基因治疗、新的抗肿瘤药物的开发提供新的靶点。
Funding Statement
[基金项目] 四川省科技支撑计划基金资助项目（2011SZ0156）
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