牙髓卟啉单胞菌在原发性感染和再感染根管内的定植

Abstract

目的

采用16s rDNA PCR和实时荧光定量聚合酶链反应（RTFQ-PCR）分析和比较牙髓卟啉单胞菌（P. endodontalis）在原发性感染和再感染根管中的定植情况。

方法

将120例慢性根尖周炎患者的120颗单根管患牙按原发性感染和再感染分为2组，每组60颗。采用16s rDNA PCR分析P. endodontalis在两种感染根管内的检出率，对于P. endodontalis检出阳性者用RTFQ-PCR比较P. endodontalis在两种感染根管内的DNA相对表达量。

结果

P. endodontalis在原发性感染根管内的检出率明显高于再感染根管的检出率（P=0.001）。RTFQ-PCR检测结果表明P. endodontalis在原发性感染根管内的DNA表达量和再感染根管内DNA表达量差异无统计学意义（P=0.303）。

结论

P. endodontalis在原发性感染和再感染根管内均有定植，但与原发性感染根管关系更为密切。

细菌感染是慢性根尖周炎的重要致病因素，治疗后根管内再次感染是导致根管治疗失败的主要原因之一[1]。牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodontalis，P. endodontalis）是一种与牙髓感染和牙源性脓肿有特殊关系的革兰阴性菌，大多从感染根管和根尖周脓肿中分离出来[2]。P. endodontalis几乎只在感染根管内出现，且检出率较高，被认为是感染根管生态环境的核心细菌之一[3]。但P. endodontalis与原发性感染和再感染根管的关系如何目前尚无定论。

关于感染根管内微生物的分析一直是研究热点。目前国际上公认较好的检测方法之一是16S rDNA PCR，其优点在于反应快速、敏感性高、特异性强[4]。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）实现了PCR产物的实时定量检测，并为核酸定量带来了革命性的飞跃[5]，其已作为牙周病的诊断工具之一，但在牙髓病的诊治领域应用较少[6]。

本研究拟采用16S rDNA PCR分析P. endodontalis在原发性感染和再感染根管内的分布情况，并用SYBR GREEN Ⅰ模式的RTFQ-PCR比较P. endodontalis在两种感染根管内的DNA表达量，目的是进一步明确P. endodontalis与两种感染根管的关系，为丰富牙髓根尖周病的病因学理论提供实验依据。

1. 材料和方法

1.1. 病例选择

依据慢性根尖周炎的诊断标准[7]，选择2012年2月—2013年1月于首都医科大学附属北京口腔医院牙体牙髓科就诊的120例慢性根尖周炎患者的120颗单根管患牙，其中原发性感染和再感染组各60例。男性54例，女性66例，年龄19~68岁，平均年龄35岁。实验前经伦理委员会审查批准，记录患者一般信息，病史，患牙的牙位、症状，签署知情同意书。

纳入标准：1）因龋损而导致慢性根尖周炎的未治疗患牙；2）根管治疗1年以上，患牙的根尖周病变持续存在或出现新根尖周病变的患牙；3）牙冠无严重缺损，可用橡皮障隔湿；4）无明显牙根内外吸收及牙根折；5）牙周袋≤4 mm，且近1~3个月未服用抗生素。

排除标准：1）有系统性疾病和近2周服用过抗生素的患者；2）牙体缺损过大，无法使用橡皮障者；3）经塑化或干髓治疗过的患牙；4）髓腔穿孔或内吸收的患牙；5）患牙附着丧失≥4 mm。

1.2. 临床采样过程

按照Jung等[8]的方法，3%过氧化氢液含漱，橡皮障隔湿，3%过氧化氢液反复清洁牙面，碘伏消毒，20 g·L⁻¹ NaClO溶液冲洗擦拭牙面。无菌高速手机及球钻去除釉质或原充填材料，近髓腔处窝洞按上述方法再次消毒，换用无菌低速手机和球钻在无水状态下揭去髓室顶。采用无菌15号或20号H锉探查并通畅根管至工作长度并反复扩锉根管壁，连续3根无菌20号纸尖插入根管内距工作长度短1 mm处，停留30 s，吸取根管渗出液。若根管内干燥，则注入适量无菌生理盐水（不要溢出根管），充分扩锉根管壁，使细菌充分进入溶液中。对根管治疗失败的患牙去净冠部及髓腔旧充填物后采用无菌的3号或4号GG钻去除根管口冠方1/3的旧根充物并扩大根管口，无菌15号或20号H锉取出旧根充物并疏通根管，在干燥根管内注入适量无菌生理盐水，纸尖取样过程同初次感染根管。在操作过程中未使用化学制剂。

将纸尖放入盛有1 mL pH7.2磷酸盐缓冲液的无菌Eppendorf管中，−20 °C低温保存。为减少人为误差，每次取样所用的纸尖长短、粗细、插入深度及停留时间均保持一致，以上操作均由第一作者完成。

1.3. 参考菌株

国际参考菌株P. endodontalis ATCC35406、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）ATCC33277、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F. nucleatum）ATCC10953、黏性放线菌（Actinomyces viscosus，A. viscosus）ATCC19246、粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis）ATCC29212、微小微单胞菌（Peptostreptococcus micros，P. micros）ATCC33270均由首都医科大学附属北京口腔医院研究所口腔微生物研究室提供。

1.4. DNA提取

采用promega细菌DNA提取试剂盒（北京普洛麦格生物技术有限公司）提取临床标本细菌基因组DNA。

1.5. 16s rDNA PCR检测法

1.5.1. P. endodontalis的16s rDNA PCR特异性引物的合成和特异性、敏感性鉴定

P. endodontalis 16S rDNA扩增引物[9]上游序列：5′-GCTGCAGCTCAACTGTAGTC-3′，下游序列：5′-CCGCTTCATGTCACCATGTC-3′；该引物将产生672 bp的扩增产物。采用Primer Express 2.0软件设计细菌通用扩增引物，上游序列：5′-TGCCAGCAGCCGCGGTAATACG-3′，下游序列：5′-GACTACCAGGGTATCTAATCCTG-3′；该引物将产生290 bp的扩增产物。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

选择6株冻干保存的参考菌株，复苏，厌氧培养，采用promega细菌DNA提取试剂盒提取DNA，PCR反应检测P. endodontalis 16S rDNA扩增引物的特异性和敏感性，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5.2. PCR检测

以P. endodontalis参考菌DNA为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，采用16S rDNA PCR对临床标本中的P. endodontalis进行检测。总反应体系为50 µL。40 pmol引物，5 U·µL⁻¹ TaqDNA酶1 µL，4×dNTP 1 µL，10×PCR缓冲液5 µL，25 mmol·L⁻¹ MgCl₂ 3 µL与1 µL DNA模板及去离子水。95 °C预变性2 min；94 °C变性30 s，60 °C退火1 min，72 °C延伸2 min，36个循环；最后72 °C延伸10 min。将细菌通用引物的PCR反应作为阳性对照，其反应条件是95 °C预变性2 min；95 °C变性30 s，60 °C退火1 min，72 °C延伸1 min，36个循环；最后72 °C延伸2 min。

1.5.3. 检测结果的计算

临床标本的PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳、照相，扫描。计算60例初次感染根管和60例再感染根管临床标本中P. endodontalis的检出率。

1.6. RTFQ-PCR检测

1.6.1. 特异性引物和反应体系

本研究所用特异性引物根据细菌16S rRNA基因特异保守区域设计[10]，上游序列：5′-GCTGCAGCTCAACTGTAGTCTTG-3′，下游序列：5′-TCAGTGTCAGACGGAGCCTAGTAC-3′；该引物将产生110 bp的扩增产物。管家基因[11]上游序列：5′-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA-3′；下游序列：5′-TGCGGGACTTAACCCAACA-3′。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.6.2. 单一PCR扩增法

样本和内对照分别在独立的反应孔中进行扩增。使用β-actin作为内对照，每个样本和内对照使用3个重复反应孔进行扩增。反应体系为：SYBRMIX 10 µL，50 °C 2 min；Primer F 0.5 µL，95 °C 10 min；Primer R 0.5 µL，95 °C 15 s，40个循环；ddH₂O 8.2 µL，60 °C 60 s，40个循环；DNA 0.8 µL，读取融解曲线。

1.7. 统计学分析

采用SPSS 17.0统计分析软件包进行数据处理。采用chi-squared检验分析比较16s rDNA PCR获得的两组感染根管样本的P. endodontalis阳性检出率。RTFQ-PCR原始数据处理采用相对定量中的比较Ct值法（2^−ΔΔCt法），所得数据非正态分布，用Mann-Whitney检验，以P=0.05为检验标准。

2. 结果

2.1. 患者基本情况

临床样本分布情况见表1。

表 1. 临床样本分布情况.

Tab 1 Distribution of cases

项目		原发性感染根管	再感染根管
性别	男	29	25
	女	31	35
年龄/岁	≤40	24	21
	>40	36	39
牙位	上切牙	31	28
	下切牙	12	10
	上前磨牙	4	11
	下前磨牙	13	11
根尖病变直径/mm	≤3	32	45
	>3	28	15

n=60

2.2. P. endodontalis引物的特异性和敏感性验证

6株国际参考菌株中，以1株P. endodontalis ATCC35406 DNA为模板扩增出P. endodontalis 16S rDNA片段。电泳分析可见扩增片段大小与预计的672 bp一致，而其余5株非P. endodontalis菌株的DNA模板均未扩增出特异的DNA片段。以P. endodontalis ATCC35406菌株的DNA经倍比稀释后为模板，扩增P. endodontalis 16S rDNA片段，其敏感性为0.5 ng级。

2.3. 16s rDNA PCR分析P. endodontalis的检出率

120例临床标本中都提出了细菌DNA。60例原发性感染根管的样本中，26例样本扩增出预计的672 bp条带（图1），检出率为43%；60例再感染根管的样本中，5例样本扩增出预计的672 bp条带（图2），检出率为8%。前者检出率明显高于后者（P=0.001）。

图 1. 部分原发性感染根管内标本16S rDNA PCR扩增产物的电泳图.

Fig 1 16S rDNA PCR amplifications with primers in some of the primary infected endodontics

M：DNA扩增产物的标准参照物；1~16，17~24泳道为不同患者原发性感染根管内标本P.endodontalis 16S rDNA PCR 扩增产物的电泳图；其中2、4、5、8、11、13、16、18、20、23、24泳道扩增出预计672 bp片段。

图 2. 部分再感染根管内标本16S rDNA PCR扩增产物的电泳图.

Fig 2 16S rDNA PCR amplifications with primers in some of the reinfected endodontics

M：DNA扩增产物的标准参照物；1~8，9~15泳道为不同患者再感染根管内标本P. endodontalis 16S rDNA PCR 扩增产物的电泳图；其中12、14泳道扩增出预计672 bp片段。

2.4. RTFQ-PCR检测结果

P. endodontalis的RTFQ-PCR标准曲线见图3。原发性感染根管组中P. endodontalis的DNA相对表达量是0.018±0.061，再感染根管组中DNA相对表达量是0.003±0.002，两组样本的目标菌DNA相对表达量差异无统计学意义（P=0.303）。

图 3. P. endodontalis的RTFQ-PCR标准曲线图.

Fig 3 P. endodontalis RTFQ-PCR standard curve

3. 讨论

P. endodontalis属于产黑色素类专性厌氧菌，对生长条件要求苛刻，缺乏选择性培养基，传统方法包括细菌的分离培养、生化反应及免疫学检测等都有一定局限性，必须在细菌数目及产生的酶达到一定量时才能得到阳性结果，可能造成假阴性结果。本研究中采用的16s rDNA PCR检测方法反应快速、敏感性高、特异性强，由于16S rDNA的长度最合适，且几乎所有已知细菌的16S rDNA的碱基序列已被测定并存入基因库，故16S rDNA是目前最常被选用作细菌的分类和鉴定的基因[4]。本实验选用的P. endodontalis特异性引物[9]在实验前进行了敏感性和特异性验证，PCR反应体系敏感性为0.5 ng P. endodontalis DNA 模板，6株参考菌株中只有P. endodontalis菌株产生预想的672 bp条带，其余5株非P. endodontalis菌株均未产生条带。

目前认为，根管内的感染是以厌氧菌为主的混合感染。近年来，国内外学者采用分子生物学方法分析微生物在慢性根尖周炎的根管内的分布情况，关于P. endodontalis检出结果报告不一[12]–[14]。结果的多样化可能与样本量、样本来源地区、取样部位、患者的临床症状、DNA提取及PCR检测方法等多种影响因素有关[15]。本研究纳入的是北京地区患慢性根尖周炎群体，根据原发性感染和再感染将研究对象分为2组，为保证实验操作的一致性和避免机用镍钛旋转器械使用不当造成对根管壁的过度切削，所有病例去除根充物和取样过程由一人完成。取样前用20号H锉反复提拉管壁，将贴附在管壁的感染物质尽量溶于根管中，再用纸尖深入根尖1/ 3处取样，探查P. endodontalis在两种感染根管内的定植情况。P. endodontalis在原发性感染根管的检出率明显高于再感染根管（P<0.05）。在原发性感染根管内的检出率与多数研究结果相似[12],[14]，在再感染根管内的检出率低于徐杰等[16]报告结果（19%），但后者是用切除的根尖周病损组织的PCR结果反应根管内情况，而本研究是直接从根管内取样，部分感染物质可能会附着于旧根充物被带出。结果发现P. endodontalis在经过治疗的再感染根管内检出率明显减少，说明常规根管治疗可减少P. endodontalis在根管内的定植。

对于两组感染根管中P. endodontalis检出阳性者，再采用RTFQ-PCR分析比较目标菌中DNA的相对表达量。SYBR GREEN Ⅰ染料法的优点在于成本较低，不需合成和标记探针，适合初步筛查。RTFQ-PCR分为绝对定量和相对定量，后者可以通过比较ΔCt值来确定目的基因的表达量。本实验采用的就是相对定量中的比较Ct值法（2^−ΔΔCt法）。本研究结果显示，原发性感染的根管内目标菌DNA的表达量高于再感染根管，但差异无统计学意义，结果提示虽然P. endodontalis在再感染根管内检出率显著减少，但DNA表达量并未明显减少，说明其可能在根管的再感染过程中和其他细菌协同发挥致病作用。

国内外关于两种感染根管内P. endodontalis定植状态的比较研究较少，郭惠杰等[17]用传统的分离、培养方法比较未经治疗和根管治疗失败的慢性根尖周炎患牙根管内的感染状态时发现，P. endodontalis在初次治疗的感染根管内检出率为17.9%，在再治疗的感染根管内未被检出。P. endodontalis对生长环境要求苛刻，传统的实验方法可能获得假阴性结果。Blome等[6]用RTFQ-PCR中的绝对定量方法比较了原发性感染和再感染根管内的微生物分布情况，发现前者根管内的细菌总量明显高于后者，而P. endodontalis在两种根管内的检出率分别是50%和20%，原发性感染根管内P. endodontalis数量多于再感染根管，但未作差异的统计分析。本研究采用的实验方法和技术与其有所不同，Blome等[6]采用机用镍钛器械去除旧根充物，并用绝对定量法对两类感染根管的目标菌进行检出率和表达量比较，目标菌检出的敏感度相对更高，而本研究是针对P. endodontalis阳性检出者结合定量PCR法对目标菌DNA表达量进行比较。

感染根管是厌氧菌为主的混合感染，细菌的分布主要与氧气的可利用性及营养来源有关。原发性根尖周炎中的主要致病菌是专性厌氧菌，经过根管治疗后，根管内的pH值及抗菌剂均会对其微生态环境造成影响，可能导致菌群种类和结构发生改变[18]。有研究[16],[19]表明在治疗失败的慢性根尖周炎的根管内，G⁺兼性厌氧菌为优势菌，这与其是否可以耐受饥饿状态等特性有关。P. endodontalis在原发性感染的根管中检出率明显高于再感染根管，说明其与原发性根尖周炎关系更为密切。P. endodontalis在再次感染过程中和其他G⁺兼性厌氧菌共同发挥着作用，参与致病过程。可以采取扩大样本量或结合其他分子生物学方法进一步验证P. endodontalis与两种感染根管的关系，并深入研究其致病机理。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81170952）；北京市自然科学基金资助项目（7132111)